CN105154450A

CN105154450A - 大豆抗花叶病毒基因GmNN1及其功能标记的应用

Info

Publication number: CN105154450A
Application number: CN201510414946.7A
Authority: CN
Inventors: 张彩英; 李喜焕; 李文龙; 赵晴; 郭帅
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: CN105154450B

Abstract

本发明提供一种大豆抗花叶病毒基因GmNN1及其感病的等位基因，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示。本发明分析了GmNN1在不同大豆抗、感品种间的表达差异，阐明了GmNN1参与大豆抗SMV反应，研究了不同大豆抗、感SMV品种间的GmNN1基因序列差异，并依据序列差异开发了功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT，同时利用SMV抗感RIL群体验证了标记与大豆抗病性的关联，该标记能够区分不同抗感SMV大豆品种。研究结果可为大豆抗SMV育种提供功能基因与选择标记。本发明还提供了大豆抗花叶病毒基因GmNN1的功能标记鉴定方法及其在育种选择中的应用。

Description

大豆抗花叶病毒基因GmNN1及其功能标记的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种大豆抗花叶病毒基因GmNN1及其功能标记的应用。

背景技术

大豆是我国重要粮食和油料作物，含有多种生理活性物质，具有广泛工业用途，在国民经济中占有不可替代的重要地位。大豆还是人类食物结构中主要植物蛋白来源，是当今市场上重要保健食品和优质蛋白饲料。近年来，世界对大豆需求量逐年上升，而我国大豆消费量的三分之二依赖进口。因此，提高大豆产量成为我国乃至世界大豆育种的重要任务和研究方向。

大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，SMV)病是一种全球性大豆病害，严重影响大豆产量和品质。我国以黄淮流域、汉江平原和华北地区发病较重，东北地区每年也有发生。大豆受花叶病毒侵染后，植株矮化、叶片皱缩、叶面积减小、光合能力下降，营养生长受阻，生长速率下降，根瘤重下降，单株荚数、单株粒数减少，粒重降低，褐斑粒率上升，品质下降。据统计，该病害引起的大豆产量损失一般在5％～7％，重病年损失可达10％～20％，个别年份或少数地区产量损失可高达50％，甚至造成绝收。

对于大豆花叶病毒病，生产上目前还没有十分有效的化学药物进行防治，而培育和种植抗病品种是防治该病发生的最经济有效方法。因此，通过生物技术手段，克隆并转化功能基因，创制抗病毒转基因新种质，培育抗花叶病毒新品种就成为减轻病毒危害，提高大豆产量的重要途径。

近年来，随着分子生物学的快速发展以及重要农作物病害基因的克隆与应用，研究者逐渐认识到利用生物技术手段进行抗病基因克隆与转化的重要性，而利用寄主抗性来克隆抗病相关基因就成为这一领域研究热点。

在植物抗病毒基因研究方面，烟草中的N基因是第一个被分离的抗病毒基因，该基因起源于烟草野生种Nicotianaglutinosa，编码一种胞质内定位蛋白，具有TIR-NBS-LRR结构。N基因介导的抗烟草花叶病毒(TMV)有两个显著特点：(1)TMV侵染后大约48h发生过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)，即在侵染点部位产生枯斑，病毒被限制在枯斑或其邻近部位；(2)具有温度敏感性，当携带N基因的烟草接种病毒后，28℃以下培养，发生HR，抗TMV功能正常，而较高温度时，TMV能够在携带N基因的烟草植株内扩散，如果将已经扩散的烟草移到低于28℃条件下培养，则发生系统性HR。N基因是一个单显性基因，可抗绝大多数烟草花叶病毒组成员，在番茄、烟草中均已获得转N基因的抗TMV植株。

据研究，烟草N基因与花叶病毒TMV间的相互作用是基因对基因假说的经典模型。研究发现，存在于TMV复制酶羧基端的50kDa解旋酶基序的氨基酸序列(p50序列)能够在含有N基因的烟草中引发过敏反应，是N基因对应的无毒基因，通过将这段p50序列转化到感病的烟草中，获得了转基因烟草植株，被称为转基因P50植株。将纯合的转基因P50植株与纯合的转N基因烟草栽培种进行杂交，发现杂交种中同时含有N基因及其无毒基因P50。当种子萌发1-2个星期发现，这些F₁烟草幼苗发生了系统性过敏反应而最终死亡，只有在N基因或p50发生突变而失去功能的情况下，杂交种幼苗才能够存活下来。进一步研究还发现，转有N基因的烟草植株能够介导对烟草花叶病毒除Ob生理小种以外其它所有类型生理小种的抗性反应，在病毒侵染部位出现坏死斑，发生过敏反应，限制TMV的传播，并对TMV或其它病原类似物的再次入侵产生广谱抗性。

在大豆抗病毒基因研究中，国内外已命名或报道的大豆抗SMV基因主要有Rsv1、Rsv3、Rsv4、Ra、Rc、Rg和Rh，其中Rsv1与Rpv1连锁遗传，Ra、Rc、Rg与Rh连锁遗传，Rsv1定位在大豆F连锁群，Rsv3定位在B2连锁群，Rsv4定位在D1b连锁群。陈受宜等通过文库筛选和5’RACE-PCR，从大豆抗花叶病毒品种科丰1号中获得3个抗病相关基因KR1、KR3和KR4。其中KR1蛋白具有Toll/白细胞介素-1受体(TIR)、NBS和不完整的LRR等抗病基因分子特征，RT-PCR分析表明，KR1受外源水杨酸和大豆花叶病毒株系Sa诱导；KR3长度为2353bp，编码636个氨基酸，KR3蛋白在结构上与烟草花叶病毒N基因蛋白有较高同源性，具有Toll/白细胞介素-1受体(TIR)、NBS等抗病基因分子特征，Southern杂交显示KR3在基因组中为低拷贝，RT-PCR分析表明，该基因表达受外源水杨酸诱导；KR4长度为3818bp，编码1211个氨基酸，KR4蛋白也具有NBS等抗病基因分子特征，Southern杂交显示KR4在基因组中为低拷贝，RT-PCR分析发现，该基因表达受外源水杨酸和大豆花叶病毒株系N3诱导。

基因功能标记与基因控制的性状紧密联系，通过其检测的序列多态性与表型直接相关，且与性状完全共分离。因此，该类标记如用于分子标记辅助育种准确性更高。基因功能标记开发基于功能明确的基因以及该基因在品种间的等位变异。目前，基因功能标记开发已在小麦、水稻等作物深入研究。何心尧等克隆了普通小麦2A和2D染色体上PPO基因Ppo-A1与Ppo-D1全长序列，针对Ppo-D1位点等位变异Ppo-D1a和Ppo-D1b分别开发了显性标记PPO16和PPO29，PPO16在低PPO活性品种扩增713bp条带，而PPO29在高PPO活性品种扩增490bp条带，且与PPO活性相关。Hur等克隆了不同抗性水稻中Xa3，序列比对发现，序列间存在多态性，根据其多态性开发了显性功能标记BB3-RF/BB3-RR，该标记仅在抗病品系中扩增出255bp条带。大豆基因功能标记开发鲜有报道，Juwattanasomran等根据控制大豆芳香气味GmBADH2等位变异，开发了SNP标记，该标记能够区分芳香气味品种和无芳香气味品种，同时该标记已用于分子标记辅助育种培育芳香气味大豆品种。然而至今，尚无大豆抗花叶病毒功能标记的研究报道。

因此，利用现代基因克隆技术，进一步筛选或发掘更多抗病基因，验证基因功能，开发功能标记，为大豆抗病育种提供有效的功能基因和分子标记辅助选择工具，仍是今后一段时期重要课题与研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆抗花叶病毒基因GmNN1及其功能标记的应用。

本发明提供的大豆抗花叶病毒基因GmNN1，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明提供的大豆抗花叶病毒基因GmNN1的感病等位基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

本发明提供大豆抗花叶病毒基因GmNN1编码的蛋白质，其为：

1)由SEQIDNo.3所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明提供大豆抗花叶病毒基因GmNN1的感病等位基因编码的蛋白质，其为：

1)由SEQIDNo.4所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQIDNo.4所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明提供了含有本发明所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的表达载体。

本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。

本发明还提供了大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-AC功能标记，该标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

AC-F：CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如SEQIDNO.5所示)

AC-R：CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如SEQIDNO.6所示)。

大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-AC功能标记的应用方法，通过下述引物对扩增待检大豆基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

AC-F：CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如SEQIDNO.5所示)

AC-R：CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如SEQIDNO.6所示)；

如果用上述引物对能够扩增出340bp的片段，则标志着该待检大豆抗大豆花叶病毒病。

本发明还提供了大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-GT功能标记，该标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

GT-F：GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如SEQIDNO.7所示)

GT-R：GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如SEQIDNO.8所示)。

大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-GT功能标记的应用方法，通过下述引物对扩增待检大豆基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

GT-F：GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如SEQIDNO.7所示)

GT-R：GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如SEQIDNO.8所示)；

如果用上述引物对能够扩增出749bp片段，则标志着该待检大豆感大豆花叶病毒病。

综合应用GmNN1-AC、GmNN1-GT标记，可鉴定大豆品种对SMV的抗感性。

本发明提供了大豆抗花叶病毒基因GmNN1在制备转基因植物中的应用。

申请人依据烟草抗花叶病毒N基因序列，克隆大豆中的同源基因GmNN1，分析基因在不同大豆抗、感品种间的表达差异，阐明基因是否参与大豆抗SMV反应；构建GmNN1原核表达载体、进行基因原核表达；构建GmNN1基因的超表达载体，转化大豆，获得转基因阳性植株，探究基因在大豆中的抗花叶病毒功能；分析基因在不同大豆抗、感品种间的序列差异，并依据序列差异开发功能标记，同时利用SMV抗感RIL群体及不同抗感SMV大豆品种验证标记可靠性和实用性。研究结果可为大豆抗SMV育种提供功能基因与选择标记。

附图说明

图1是实施例5中4个大豆品种的RT-PCR扩增电泳照片(M：DNAMarkerDL2000；1：冀豆12号；2：五星2号；3：冀NF58；4：南农1138-2。

图2是实施例5中菌液PCR检测pGM-GmNN1阳性克隆的电泳照片(M:DNAMarkerDL2000；1-17：pGM-GmNN1阳性克隆)。

图3是实施例6中GmNN1在冀豆12号和冀NF58接种叶片中的差异表达柱形图。

图4是实施例6中大豆抗、感SMV品种中GmNN1及其编码蛋白序列差异对比图(A：GmNN1基因序列差异，差异位点为200bp、910bp；B：GmNN1基因编码蛋白序列差异，差异位点为67aa、304aa；冀豆12号、五星2号为抗病品种，冀NF58、南农1138-2为感病品种)。

图5是实施例7中GmNN1原核表达载体构建过程中的电泳照片(A：目的片段的酶切，其中M1：DNAMarkerDL5000、1：pGM-GmNN1KpnI/BamHI酶切产物、2：pGM-GmNN1对照；B：pET-30a(+)酶切，其中M2:DNAMarkerDL2000、1：pET-30a(+)对照、2：pET-30a(+)KpnI/BamHI酶切产物；C：pET-30a-GmNN1重组质粒酶切鉴定，其中M1：DNAMarkerDL5000、1：pET-30a-GmNN1对照、2：pET-30a-GmNN1酶切产物)。

图6是实施例7中大豆GmNN1基因的原核表达SDS-PAGE图谱(M：ProteinMarker；1-12每3个一组按照时间排列，具体为1-3:IPTG诱导前、4-6:诱导后3h、7-9：诱导后6h、10-12：诱导后9h，每组内依次为空质粒、空菌株、重组质粒，箭头所示为目标蛋白)。

图7是实施例8中超表达载体pBI121-GmNN1构建过程中的电泳照片(A：pGM-GmNN1载体酶切，M1：DNAMarkerDL5000，1、3：pGM-GmNN1酶切，2、4：pGM-GmNN1对照；B：pBI121载体酶切，M2：DNAMarkerDL2000，1：pBI121对照，2：pBI121酶切；C：pBI121-GmNN1重组载体酶切，M3：DNAMarkerDL5000，1：pBI121-GmNN1对照；2：pBI121-GmNN1酶切)。

图8是实施例11中SMV3侵染大豆植株后的叶片表现照片(A：转基因大豆叶片；B：野生型大豆叶片)。

图9是实施例12中不同大豆材料GmNN1-AC功能标记检测电泳照片(M：DNAMarkerDL2000；1：空白对照；2：冀豆12号；3：冀NF58；4-10：抗病株系RIL-118、RIL-151、RIL-153、RIL-156、RIL-188、RIL-194、RIL-202；11-16：感病株系RIL-125、RIL-148、RIL-157、RIL-187、RIL-192、RIL-256)。

图10是实施例12中GmNN1-GT功能标记检测电泳照片(M:DNAMarkerDL2000；1:空白对照；2：冀豆12号；3：冀NF58；4-10：感病株系RIL-125、RIL-148、RIL-157、RIL-187、RIL-192、RIL-256、RIL-263；11-16：抗病株系RIL-118、RIL-151、RIL-153、RIL-156、RIL-188、RIL-194)。

图11是实施例12中功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT及其引物序列对比图(阴影字母为差异碱基，下划线为GmNN1-AC引物序列，双下划线为GmNN1-GT引物序列)。

图12是实施例12中连锁图谱和新开发的功能标记GmNN1-AC、GmNN1-GT在图谱上的位置示意图。

图13是实施例12中大豆品种资源功能标记GmNN1-AC检测电泳照片(M：DNAMarkerDL2000；1：空白对照；2：冀豆17；3：晋豆21；4：中作J8024；5：鲁黄1号；6：五星1号；7：石豆101；8：周豆18；9：中黄41；10：铁01092-4；11：中作J5054；12：沧豆12；13：荷豆14；14：中作J8035；15：中作J8023；16：邯4324；17：中黄25)

图14是实施例12中大豆品种资源功能标记GmNN1-GT检测电泳照片(M：DNAMarkerDL2000；1：空白对照；2：冀豆17；3：晋豆21；4：中作J8024；5：鲁黄1号；6：五星1号；7：石豆101；8：周豆18；9：中黄41；10：铁01092-4；11：中作J5054；12：沧豆12；13：荷豆14；14：中作J8035；15：中作J8023；16：邯4324；17：中黄25)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下列实施例选用的实验材料为大豆品种冀豆12号、五星2号、冀NF58和南农1138-2，以上大豆品种均为公知公用品种。

实施例1：不同大豆品种花叶病毒抗性鉴定

选取整齐、一致的大豆品种种子，播种于防虫网室内，待第一对真叶展开，选取长势一致的幼苗接种大豆花叶病毒SMV3，并以未接种病毒的植株为对照。随后分别于接种后1、2、3、4周观察品种发病情况，鉴定品种的花叶病毒抗性。鉴定结果为冀豆12号、五星2号是抗病品种，冀NF58和南农1138-2是感病品种。

实施例2：大豆叶片总RNA提取

提取大豆品种冀豆12号、五星2号、冀NF58和南农1138-2叶片总RNA，操作步骤参照TRNzolTotalRNAReagent试剂盒的操作指南。

实施例3：合成cDNA方法

Ⅰ.基因克隆用cDNA合成

cDNA合成参照PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit操作指南进行，反应程序如下：

在0.2mL离心管中配制下列反应液：

枪头轻轻吹打混匀，65℃温育5min，冰上放置冷却。

在上述管中继续加入以下反应物：

轻轻混匀，42℃60min，90℃5min，4℃保存。反应结束后，取5μL进行2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

Ⅱ.荧光定量PCR用cDNA合成

以PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser操作指南进行，反应程序如下：

A.基因组DNA的去除

42℃温育2min，4℃保存。

B.cDNA的合成

在反应管中继续加入以下反应物：

37℃反应15min，85℃5sec，4℃保存。反应结束后，取5μL进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例4：大豆抗花叶病毒基因GmNN1的序列拼接

1)利用烟草N基因核酸序列(NGU15605)，检索大豆EST数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，然后从中得到高度同源的大豆序列，利用DNAStar软件将同源大豆序列进行拼接组装。

2)以拼接后的序列为种子序列，再次检索大豆EST数据库，延伸重叠序列，重复上述过程，直至没有新的EST检出。

3)根据电子拼接序列，设计引物，从大豆cDNA中扩增，若能得到扩增产物且测序结果与拼接序列基本一致，则获得的新生序列为真实序列。

利用烟草抗花叶病毒基因N核酸序列(GenBankNo.NGU15605)作为种子序列，在NCBI网站的大豆EST数据库中进行BLAST比对，从而获得与种子序列同源性较高且重叠区域大于100bp的EST。采用DNAstar软件对入选的EST进行电子拼接，形成新的种子序列，并以该种子序列重新比对大豆EST数据库，获得新的EST，重复电子拼接过程和比对过程，延长比对序列，直至没有新的EST出现。结果发现，最终拼接得到了1条包含1683bp开放阅读框(ORF)的电子序列。

实施例5：大豆抗花叶病毒基因GmNN1的开放阅读框PCR扩增

利用所获得的目的基因电子序列，选取开放阅读框两端设计相应引物。以实施例3反转录获得的大豆品种冀豆12号、五星2号、冀NF58和南农1138-2的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增。

PCR反应

根据已设计的GmNN1的引物进行PCR扩增，扩增体系与程序如下：

(1)PCR体系

(2)扩增程序

将PCR体系混匀后扩增：

扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，在4个样品中均扩增得到一条长度约1700bp目的条带，与基因电子拼接序列大小基本一致(图1)。

PCR产物的回收

采用上海生工UNIQ-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(SK8132)，步骤详见说明书。

PCR或酶切产物的连接和转化

取7μL回收产物与pGM-T载体进行连接12h，具体为用T₄DNA连接酶将回收目的片段连接到pGM-T载体上。

(1)连接体系：

混匀后，瞬时离心，16℃连接12h。

(2)连接产物的转化：

I.从-80℃超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态DH5α，冰上融化。将5μL连接产物加入50μL感受态细胞中，弹匀，冰上放置30min；

II.42℃热激90s，取出后在冰上静置2～3min；

III.向离心管中加入500μL液体LB培养基，37℃150rpm培养45min；

IV.将离心管中的液体转移到固体LB培养基上(80mg/mLAmp、40μLX-gal和4μLIPTG)，用涂布器均匀涂开，晾干后，倒置平板，37℃培养箱中培养12～16h。

V.挑取阳性克隆加入到1mL液体LB(加Amp⁺)培养基中，37℃振荡培养，并进行菌液PCR扩增，获得阳性克隆(图2)。将阳性克隆进行测序分析，结果发现，目的片段含有1662bp的完整开放阅读框，与电子拼接序列基本一致，将其命名为GmNN1，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

大豆抗花叶病毒基因GmNN1序列获得：

I.PCR检测

(1)PCR检测的体系

(2)PCR的检测程序

95℃10min；94℃1min；52℃1min；72℃2min；gotostep2，35cycles；72℃10min；10℃end。

II.阳性克隆测序及结果分析

随机挑选阳性克隆测序，将测序结果与电子拼接序列进行比对，序列比对一致的阳性克隆用于后续试验。

实施例6：抗花叶病毒基因GmNN1在不同大豆品种中的表达分析

以GmNN1为目标基因，大豆组成型表达Actin11为内参基因，设计Realtime-PCR引物，采用GreenⅠ荧光染料法，参考Huang等的步骤进行实时定量PCR分析，采用比较Ct进行基因表达水平的相对定量分析。

此处ΔΔCt＝(C_t _GmNN1–C_tactin11)_{冀豆12叶片}–(C_tGmNN1–C_tactin11)_{冀NF58叶片}。

以抗病品种冀豆12号和感病品种冀NF58为材料，分析GmNN1在接种病毒后的表达(图3)。结果发现，冀豆12号接种病毒后基因被快速诱导，24h出现第一个表达高峰，随后表达量稍有下降(48h)。但随即又被快速诱导，且在96h出现第二个表达高峰；GmNN1在冀NF58中被缓慢诱导，直至12h出现表达高峰，随即表达量快速下降，96h达到最低。值得注意的是，GmNN1基因在抗病品种中的表达量从接种病毒0-96h始终高于感病品种中的表达量(除12h表达量基本一致外)，说明GmNN1与大豆品种的抗花叶病毒特性密切相关。

为进一步分析GmNN1基因在大豆不同抗、感SMV品种中的序列差异，以2个抗SMV品种(冀豆12号、五星2号)与2个感SMV品种(冀NF58、南农1138-2)为材料，采用RT-PCR技术扩增GmNN1基因。为保证测序结果的正确性和真实性，对每个品种的PCR扩增产物，分别选取8个阳性克隆(共32个阳性克隆)进行测序。测序结果发现，GmNN1基因的cDNA序列在抗病毒品种与感病品种中的等位基因(如SEQIDNO.2所示)相比存在2个碱基的突变。

2个抗病毒品种中的GmNN1基因ORF序列第200位置均为A，而感病品种中的相应位置均为G，从而导致基因编码蛋白序列存在1个氨基酸的改变，即2个抗病品种中的GmNN1编码蛋白序列(如SEQIDNO.3所示)第67位置均为H(组氨酸，His)，而感病品种中GmNN1基因的等位基因编码的蛋白(如SEQIDNO.4所示)的相应位置均为R(精氨酸，Arg)(图4)。同时发现，2个抗病毒品种中的GmNN1基因ORF序列第910位置均为C，而感病品种中的相应位置均为T，从而导致编码蛋白序列存在1个氨基酸的改变，即2个抗病品种中的GmNN1编码蛋白序列第304位置为R(精氨酸，Arg)，而感病品种中的相应位置均为C(半胱氨酸，Cys)(图4)。进一步分析基因编码蛋白的保守域发现，第67位氨基酸的突变位于TIR保守域，而第304位氨基酸的突变位于P-loop保守域，推断这两个氨基酸的改变可能与GmNN1基因抗病功能发挥密切相关。

实施例7：大豆抗花叶病毒基因GmNN1原核表达

1.GmNN1原核表达载体构建

I.设计原核表达引物，以pGM-GmNN1为模板进行PCR扩增

(1)PCR反应体系：

(2)PCR反应扩增程序：

将上述反应液混匀后，进行扩增

II.将PCR产物分别用BamHⅠ/KpnⅠ双酶切，酶切反应体系如下：

37℃酶切4h后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的片段，并进行胶回收，连接。连接体系如下：

混匀后，16℃连接13h。

III.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经PCR和酶切检测阳性克隆，进行测序分析，测序正确的即为构建的GmNN1原核表达载体。

IV.将测序正确的质粒5μL、空载体pET-30a(+)质粒转入大肠杆菌Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell菌株，通过PCR、酶切及测序筛选出序列没有突变的重组子，用于后续试验。

GmNN1与原核表达载体pET-30a(+)进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切(图5A、图5B)，分别回收酶切后的目的条带，采用T₄DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。挑取单克隆，提取质粒，进行菌液PCR扩增以及KpnⅠ和BamHⅠ的酶切鉴定(图5C)，获得阳性克隆。将阳性克隆进行测序分析，结果发现，GmNN1基因序列正确，表明原核表达载体pET-30a-GmNN1构建成功。将重组载体pET-30a-GmNN1转化大肠杆菌表达菌株(Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell)，并进行菌液PCR、酶切与测序分析鉴定，最后获得了转有重组质粒的表达菌株，用于后续基因原核表达。

2.GmNN1融合重组蛋白的诱导表达

(1)分别吸取不含质粒的空菌株Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell、空质粒pET-30a(+)和含pET30a-GmNN1的菌液，加入20mLLB液体培养基(含相应抗生素)，在灭菌的三角瓶中37℃，200rpm培养12h。

(2)将400μL菌液、18mLLB和2mL葡萄糖(20％)加入灭菌的三角瓶，37℃培养1.5-3h至OD₆₀₀达到0.6左右。

(3)取诱导前菌液1mL，12000rpm离心1min，弃上清，则沉淀保存于-20℃，该样品为0h样品。向三角瓶中加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，30℃条件下诱导GmNN1表达，分别收集3h、6h、9h菌液1mL，于-20℃保存待用。

3.表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测

(1)将收集的各个时间点的菌液10000rpm，离心1min，弃上清，分别加入100μL上样缓冲液，涡旋振荡混匀后，100℃加热10min，瞬时离心12000rpm，1min，取上清液进行电泳检测。

(2)向制作好的垂直板中先后加入10％分离胶和5％浓缩胶，聚合完毕后，拔出梳子加入SDS-PAGE缓冲液。

(3)80V恒压电泳约1h，120V恒压继续电泳，待溴酚蓝到达凝胶底部后停止电泳。

(4)关闭电源，拆去连接的导线，倒掉电极液，取下玻璃夹板。撬开上面的玻璃平板，用刀片沿胶板边缘划开，轻轻取下凝胶。

(5)用蒸馏水冲洗干净，然后用0.25％考马斯亮蓝R-250染色3h。

(6)在含有乙醇、醋酸、水(50mL：100mL：850mL)的脱色液中，脱色4～8h，中间更换脱色液一次，直至出现清晰的条带。

利用测序正确的大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell阳性克隆进行原核表达分析，同时辅以空质粒(pET-30a)转化的BL21与空菌株BL21作为对照，取样时间、数量和加入诱导物的浓度均与转化菌株一致。结果发现，在IPTG(0.8mmol/L)诱导下，pET-30a(+)载体本底表达产生20.4KDa左右的目的蛋白，而pET30a-GmNN1诱导表达一条分子量约60KDa的特异蛋白(图6)。同时发现，在IPTG的诱导下，空质粒转化菌液和未经转化的空菌株均不能表达出该特异蛋白；另外，没有经过IPTG诱导的重组克隆和对照克隆也不能表达出该60KDa特异蛋白。可见，大豆抗病毒基因GmNN1可在大肠杆菌中成功表达。

实施例8：大豆抗花叶病毒基因GmNN1超表达载体构建

将pGM-GmNN1和pBI121载体的质粒分别用BamHⅠ单酶切：

37℃酶切3h后，进行电泳分离，回收目的片段，连接载体片段与回收的目的片段，反应体系如下：

混匀后，16℃连接12h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，提取质粒，BamHⅠ酶切鉴定，结果见图7，获得了阳性克隆，将阳性克隆进行测序，获得了基因序列正确的超表达载体pBI121-GmNN1。将超表达载体pBI121-GmNN1转化农杆菌菌株EHA105，获得了含有超表达载体的农杆菌菌株，用于后续遗传转化。

实施例9：真核表达载体的农杆菌转化方法

1.农杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法)

挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mLLB(Str⁺，100mg/L)液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养；取2mL培养菌液接种于50mL不含抗生素的LB液体培养基，继续培养至OD₆₀₀达到0.5～0.7；冰浴30min后，4℃，5000rpm离心5min，弃上清；加入10mL100mmol/L预冷的NaCl溶液重悬，4℃，5000rpm离心5min，去上清；加入1mL20mmol/LCaCl₂溶液重悬菌体，分装至无菌1.5mL离心管，-80℃保存。

2.真核表达载体转化农杆菌

1)将5μLpBI121-GmNN1质粒加入到120μL冰上溶化的EHA105农杆菌感受态，混匀后冰浴30min。

2)37℃水浴10min。

3)加入400μL液体LB，28℃低速培养12h。

4)4000rpm离心5min，去掉300μL，将剩余的弹匀。涂在含有50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。

5)28℃条件下暗培养2～3d，挑取单菌落摇菌。

6)进行PCR和BamHⅠ的单酶切鉴定。

实施例10：农杆菌侵染液的制备

将含有重组质粒的农杆菌，涂于含50mg/mLStr和50mg/mLKan的固体LB平板，28℃培养。挑取单菌落，接种到20mL含有50mg/mLStr和50mg/mLKan的LB培养液中，在28℃恒温摇床上培养到OD₆₀₀为0.6-0.8，取上述培养物1％-2％的比例，转入无抗生素的LB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.5时，即可用于转化。

实施例11：GmNN1在转基因大豆中的抗病性功能分析

利用农杆菌介导与大豆花粉管通道遗传转化技术，将超表达载体pBI121-GmNN1转化大豆感病品种冀NF58，经PCR鉴定，获得T₁转基因植株。为研究GmNN1在大豆中的生物学功能，将转GmNN1和野生型大豆植株同时接种大豆花叶病毒强致病性株系SMV3，待感病对照系统发病后，观察转基因植株与野生型植株结果发现，野生型的叶片表现出皱缩症状(大豆花叶病毒感病症状的一种)，而转基因叶片未出现感病症状，见图8。

同时发现，转超表达载体pBI121-GmNN1的感病品种冀NF58植株的单株粒数、单株粒重、百粒重较野生型分别提高35.66％、22.45％、11.30％，且达(极)显著水平，说明大豆植株感染SMV后，GmNN1能够有效抵抗病毒在植株体内的传播扩散，保证植株的正常健康生长，减轻大豆产量的损失。

实施例12：GmNN1基因功能标记开发及育种应用

1.GmNN1基因功能标记的开发

检测的大豆材料有抗SMV品种冀豆12号与感病品种冀NF58，以及抗感SMV的RIL株系，具体包括RIL-118、RIL-151、RIL-153、RIL-156、RIL-188、RIL-194、RIL-202等抗病株系与RIL-125、RIL-148、RIL-157、RIL-187、RIL-192、RIL-256、RIL-263等感病株系。

依据GmNN1在抗、感大豆品种间的碱基序列差异(图4)，开发了基因功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT(表1)。其中GmNN1-AC标记可在抗病品种中有扩增产物(340bp)，感病品种中无扩增产物(图9)；而GmNN1-GT标记可在感病品种中有扩增产物(749bp)，抗病品种中无扩增产物(图10)，两个标记相互验证，确保了准确性。图11是功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT及GmNN1等位基因部分cDNA序列。

表1功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT序列

2.GmNN1基因功能标记QTL定位与可靠性分析

(1)RIL群体不同株系的抗病性鉴定结果

为了进行功能标记与抗病性的连锁分析，利用强大豆花叶病毒株系SMV3在人工气候室对RIL群体128个株系进行抗病性鉴定，每个株系种植20株，试验两次重复。结果发现，免疫单株24株，抗病单株54株，中抗单株9株，中感单株18株，感病单株5株，高感单株18株。免疫单株24株：高感单株18株≈1:1。

(2)GmNN1基因功能标记的染色体定位和QTL分析

以RIL群体的128个F₁₀株系为作图群体，构建了分子遗传连锁图谱，并进行了功能标记的QTL分析，结果发现在F连锁群上检测到一个与功能标记GmNN1-AC、GmNN1-GT共分离的QTL，LOD值为7.84，可解释20.3％的表型变异(图12)，说明GmNN1-AC、GmNN1-GT与大豆花叶病毒抗性紧密连锁。

(3)GmNN1功能标记的应用

利用GmNN1-AC和GmNN1-GT扩增课题组前期已进行SMV抗性鉴定的100份大豆品种资源。结果见图13、图14，标记GmNN1-AC在79份抗病品种中，53份有扩增产物，条带大小为340bp，26份无扩增产物；在21份感病品种中，14份无扩增产物，7份有扩增产物；选择准确率为67％。同时发现标记GmNN1-GT在79份抗病品种中，69份无扩增产物，10份有扩增产物，在21份感病品种中，13份有扩增产物，条带大小为749bp，8份无扩增产物，选择准确率达到82％。

综合上述实施例，得到如下结论：

1.克隆了大豆抗花叶病毒GmNN1，具有1662bp的ORF，编码553个氨基酸残基。

2.分析了GmNN1在抗、感品种接种SMV后的表达，在抗病品种中被快速诱导，且出现2次高峰，在感病品种中被缓慢诱导，出现1次高峰，且抗病品种中的表达量从接种病毒后直至96h始终高于感病品种。

3.分析了GmNN1在不同抗、感SMV品种间的序列差异，抗病品种GmNN1的ORF第200、910位为A、C，感病品种为G、T，抗病品种中的基因编码蛋白第67和304位为组氨酸和精氨酸，感病品种为精氨酸和半胱氨酸。

4.构建了GmNN1原核表达载体，诱导表达一条60KDa左右目的条带。

5.构建了GmNN1超表达载体，获得了转基因大豆阳性植株，GmNN1转基因大豆功能分析表明，接种花叶病毒后超表达植株较野生型植株感病症状轻，且较对照植株的单株粒数、单株粒重和百粒重分别显著提高35.66％、22.45％和11.30％。

6.根据GmNN1在抗感SMV大豆品种间的cDNA序列差异，开发了功能标记GmNN1-AC/GmNN1-GT。QTL分析表明，在RIL群体中检测到一个与标记GmNN1-AC/GmNN1-GT共分离的QTL，可解释20.3％的表型变异，功能标记能够鉴别高抗、感SMV大豆品种。

Claims

1.一种大豆抗花叶病毒基因GmNN1，其特征在于，所述基因GmNN1的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.如权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的感病等位基因，其特征在于，所述感病等位基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。

3.权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1编码的蛋白质，其为：

1)由SEQIDNo.3所示的氨基酸组成的蛋白质；或

4.权利要求2所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的感病等位基因编码的蛋白质，其为：

1)由SEQIDNo.4所示的氨基酸组成的蛋白质；或

5.含有权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的表达载体或宿主细胞。

6.检测权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-AC功能标记，其特征在于，该功能标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

AC-F：CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如SEQIDNO.5所示)

AC-R：CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如SEQIDNO.6所示)。

7.权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-AC功能标记的应用方法，其特征在于，通过下述引物对扩增待检大豆基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

AC-F：CTTTCGGAGGCGATTGATCA(如SEQIDNO.5所示)

AC-R：CCACAATCTTCTCAATCAACTCG(如SEQIDNO.6所示)；

如果用上述引物对能够扩增出340bp的片段，则标志着该待检大豆品种属于抗花叶病毒类型。

8.检测权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-GT功能标记，该标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：

GT-F：GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如SEQIDNO.7所示)

GT-R：GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如SEQIDNO.8所示)。

9.权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1的GmNN1-GT功能标记的应用方法，其为通过下述引物对扩增待检大豆基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对的核苷酸序列为：

GT-F：GGGCTTTCGGAGGCGATTGATCG(如SEQIDNO.7所示)

GT-R：GGGGCGCAAGTCATCTAGCTCTCA(如SEQIDNO.8所示)；

如果用上述引物对能够扩增出749bp的片段，则标志着该待检大豆品种属于感花叶病毒类型。

10.权利要求1所述大豆抗花叶病毒基因GmNN1在制备转基因植物中的应用。