CN117187276B - 一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生物技术领域，公开了一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因及其应用。在小麦与条锈菌的互作中，TaSERK1基因受小麦条锈菌诱导表达。采用病毒介导的基因沉默技术瞬时沉默TaSERK1基因，发现其在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用。构建TaSERK1基因的过表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化，获得TaSERK1基因过表达的转基因植株，显著增强其对小麦条锈菌生理小种CYR31的抗性。本发明为利用TaSERK1基因改良小麦的抗条锈病性状提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因及其应用。
背景技术
小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp.tritici，Pst）引起的真菌性病害，在全球各小麦产区均有发生，严重威胁着全球的小麦生产安全。小麦条锈菌具有活体专性寄生、喜冷凉、通过高空气流远距离传播等特点，一般可造成0.5%–5%的产量损失，严重时可造成5%–25%的产量损失，甚至绝收。小麦条锈菌毒性频繁变异，导致致病新小种不断产生，条锈病流行频繁发生。因此，挖掘抗病相关基因，解析其作用机理，进而创制持久广谱抗病材料，对小麦抗条锈病的遗传改良具有重要意义。
病原相关分子模式免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）是基础抗病反应的重要组成部分，抗性相对广谱、稳定、持久，可用于作物抗病育种。因此，鉴定并利用富含亮氨酸重复的类受体激酶或类受体蛋白介导的免疫信号中的重要组成部分对抗病育种具有重要作用。现有研究表明，拟南芥中的SERK（胚胎发生受体激酶）家族蛋白在植物免疫中主要有以下几方面功能：一是参与模式识别受体识别配体后介导的免疫信号传导，二是对细胞死亡起负调控作用。
对于拟南芥中SERK家族蛋白的研究推动了主要作物中对其的研究，为促进作物农业性能的战略发展提供了见解，目前作物中参与植物免疫的SERK家族蛋白主要有水稻OsSERK2、番茄SlSERK3A和SlSERK1和马铃薯StSERK3A等。然而，小麦SERK家族蛋白是否参与到小麦与条锈菌的互作中，其功能及互作机制，目前还没有相关的研究和探索。
发明内容
为证实小麦SERK家族蛋白参与小麦与条锈菌的互作，明确其功能及互作机制，本发明旨在提供一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因及其在小麦抗条锈病中的应用。
一方面，本发明提供一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因在培育、改良小麦抗条锈病品种中的应用，小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因的开放阅读框（ORF）序列如SEQID NO:1所示。TaSERK1基因编码小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1，小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，本发明提供的小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因受条锈菌诱导表达，在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用。
进一步，本发明对小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因进行功能鉴定，功能鉴定方法包括：设计TaSERK1基因特异片段引物，以延伸因子TaEF1-α为内参，通过qRT-PCR分析小麦激酶TaSERK1在条锈菌侵染小麦不同时间点的表达量，研究发现，TaSERK1在非亲和体系（接种CYR23）中条锈菌侵染12 h表达量达到最高，而在亲和体系（接种CYR31）中的表达没有明显变化，表明TaSERK1基因受小麦条锈菌诱导表达，TaSERK1基因可能参与到小麦对条锈菌抗性中。
进一步，本发明通过病毒诱导的基因沉默对TaSERK1基因进行瞬时沉默，同时以沉默TaPDS（八氢番茄红素脱饱和酶基因）作为阳性对照，于二叶接种病毒7天后，观察试验组和对照组叶片，发现沉默TaPDS的小麦叶片上呈现出漂白状，其余接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，表明病毒接种成功；于三叶接种小麦条锈菌新鲜孢子，接种14天后观察表型，得知TaSERK1基因在小麦抗条锈病中起正调控作用。
进一步，小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因在培育、改良小麦抗条锈病品种中的应用包括：构建包含TaSERK1基因的过表达载体；将包含TaSERK1基因的过表达载体转入小麦幼胚，得到过表达TaSERK1基因的小麦植株。转入小麦幼胚的方法为农杆菌介导的遗传转化法。
进一步，本发明对小麦激酶TaSERK1基因在培育、改良小麦抗条锈病品种中的应用进行验证，所述验证包括：对过表达TaSERK1基因的小麦植株进行分子检测。所述验证还包括：对过表达TaSERK1基因的小麦植株接种小麦条锈菌生理小种CYR31，鉴定过表达TaSERK1基因的小麦植株对小麦条锈病的抗性。
本发明证明了小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1在小麦抗条锈病中起正调控作用，通过TaSERK1转基因植株创制抗小麦条锈菌生理小种CYR31的品系。
通过上述技术方案，结合实施例，本发明所提供一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1至少具有下述有益效果或优点：
1.本发明利用反向遗传学方法分析TaSERK1基因，发现TaSERK1基因受到条锈菌非亲和小种的诱导。
2.采用病毒介导的基因沉默技术瞬时沉默TaSERK1基因，确定TaSERK1基因在小麦抗条锈病中起正向调控作用。
3.将TaSERK1基因构建至过表达载体中，将过表达载体转入小麦幼胚，获得的转基因小麦植株对小麦条锈菌表现出抗性。
4.本发明证明TaSERK1基因可以用于小麦的抗条锈病育种改良，从而培育出抗小麦条锈病的新型抗病材料。
附图说明
图1为小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因的表达谱分析图。
图2为特异性沉默TaSERK1基因的表型结果示意图和TaSERK1基因的相对表达量图。BSMW-TaPDS为接种沉默小麦八氢番茄红素脱氢酶的大麦条纹花叶病毒的小麦植株，为阳性对照；BSMW-γ为对照组；BSMW-TaSerk-1为接种沉默特异片段1的大麦条纹花叶病毒的小麦植株：BSMW-TaSerk-2为接种沉默特异片段2的大麦条纹花叶病毒的小麦植株；Inoculated-CYR23为接种条锈菌生理小种CYR23；Inoculated-CYR31为接种条锈菌生理小种CYR31；Mock为野生型小麦水源11；BSMV:γ为BSMW-γ相比于阳性对照的TaSERK1基因相对表达量；BSMV:SerK1-1as为BSMW-TaSerk-1相比于阳性对照的TaSERK1基因相对表达量；BSMV:SerK1-2as为BSMW-TaSerk-2相比于阳性对照的TaSERK1基因相对表达量；*表示差异显著。
图3为过表达载体图。LB和RB为同源臂；ZmUbi为启动子；TaSERK1为TaSERK1基因；GusPlus为β葡萄糖苷酸酶报告基因；T-NOS为终止元件；Bar为除草剂筛选标记基因。
图4为TaSERK1过表达植株的再生植株示意图。TaSERK1-OE为TaSERK1过表达植株的再生植株。
图5为TaSERK1过表达植株的PCR检测结果图。6E-F/6E-R为过表达载体的检测通用引物；L1~L15为过表达TaSERK1植株的T1代转基因株系Line1~Line15；PC为过表达质粒扩增的阳性对照；WT为小麦品种Fielder；H2O为清水对照组。
图6为TaSERK1过表达植株接种条锈菌生理小种CYR31的表型结果示意图及TaSERK1过表达植株TaSERK1基因的相对表达量图。Mock为未接菌的野生型植株对照；Fielder为接菌的野生型植株；OE-L2为TaSERK1过表达植株的株系Line2；OE-L10为TaSERK1过表达植株的株系Line10；WT为接菌的野生型植株中TaSERK1基因的相对表达量；L2为株系Line2中TaSERK1基因的相对表达量；L10为株系Line10中TaSERK1基因的相对表达量；*表示差异显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本实施例提供了过表达TaSERK1基因植株的构建以及检测。
1、TaSERK1基因与小麦的互作
通过摩擦接种将条锈菌生理小种CYR23、CYR31新鲜夏孢子接种到小麦“水源11”二叶正面，对照以无菌水涂抹接种。接种后的幼苗于16℃黑暗条件下保湿24 h，然后取出置于16℃光照16 h，黑暗8 h光周期的生长培养箱中下培养。分别于接种后0、6、12、18、24、36、48、72和120 h 收集对照与接菌后小麦叶片，提取RNA进行反转录，以延伸因子TaEF1-α为内参，通过实时定量PCR，2—△△CT方法计算TaSERK1基因（如下所示引物扩增）的相对表达量（图1）。
定量-正向引物：TaSERK1-qRT-F：AACTGGCTCGTTTTCA；
定量-反向引物：TaSERK1-qRT-R：AATGGAGGCGGTGG。
内参-正向引物：TaEF1-α-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT；
内参-反向引物：TaEF1-α-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT。
由图1可知，TaSERK1在非亲和体系（接种CYR23）中条锈菌侵染12 h表达量达到最高，而在亲和体系（接种CYR31）中的表达没有明显变化，表明TaSERK1基因受小麦条锈菌诱导表达，TaSERK1基因可能参与到小麦对条锈菌抗性中。
2、TaSERK1基因在小麦抗条锈病中的调控作用
利用病毒诱导的瞬时沉默技术，分别对TaSERK1的两个特异片段（片段1：CTGCGGAGGTGTTGGTGGGCGGCGGCGGCGGTCTTGTCGGCGGTGCTGACCGTGAGCCGGGTCTCCGCCAACACAGAGGGTGATGCTCTGTACAGTCTGCGTCAAAGCCTTAAAGATGCTAAC；片段2：AACTGGCTCGTTTTCACTCTTTACCCCTATAAGTTTTGGTAATAATCCAAATCTTTGTGGCCCGGGTACTACGAAACCATGTCCTGGGGCACCTCCTTTTTCTCCACCGCCTCCATT）进行沉默，在小麦“水源11”生长16天时进行摩擦接种带有上述沉默片段的大麦条纹花叶病毒，同时接种带有沉默TaPDS（八氢番茄红素脱饱和酶基因）片段的大麦条纹花叶病毒作为阳性对照，接种后放置于24℃黑暗保湿24h，随后放置到24℃光照16h，黑暗8h光周期的生长培养箱中。于上述接种带有沉默片段的大麦条纹花叶病毒的小麦二叶上接种大麦条纹花叶病毒7天后，若沉默TaPDS的小麦叶片上呈现出漂白状，其余接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明病毒接种成功。
病毒介导的基因沉默载体构建引物：
片段1-正向引物：CCTTAATTAACTGCGGAGGTGTTGGTG，
片段1-反向引物：ATAAGAATGCGGCCGCGTTAGCATCTTTAAGGCTTTGAC。
片段2-正向引物：CCTTAATTAAAACTGGCTCGTTTTCA；
片段2-反向引物：ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAGGCGGTGG。
在病毒接种成功的三叶上分别接种条锈菌生理小种CYR23、CYR31，放置到保湿箱内16℃黑暗保湿24 h，接着转置于16℃光照16 h，黑暗8 h光周期的生长培养箱中。待接种14天后观察叶片上的孢子数量并计算TaSERK1基因的相对表达量（图2），相对表达量统计的方法与图1中计算方法相同。
由图2可知，带有沉默TaPDS片段的病毒的小麦叶片呈现出漂白状，其余接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，表明病毒接种成功。沉默TaSERK1基因特异片段1和特异片段2的小麦叶片中TaSERK1基因的相对表达量均显著降低。接种条锈菌生理小种CYR23和CYR31后，相比于沉默空载体的叶片，沉默TaSERK1基因特异片段1和特异片段2的叶片上产生的孢子堆增加，说明TaSERK1参与到小麦对条锈菌的抗性中，且起正调控作用。
3、过表达TaSERK1基因植株的构建
小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因的开放阅读框（ORF）序列如SEQ ID NO:1所示。小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。构建包含小麦激酶TaSERK1基因的植物过表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化小麦品种“Fielder”幼胚，得到过表达TaSERK1的转基因小麦。
通过Gateway反应将如下所示引物扩增片段构建到过表达载体 pANIC6E（西北农林科技大学提供）。将构建的TaSERK1-pANIC6E质粒（图3）转化农杆菌感受态 EHA105。利用农杆菌介导的遗传转化的方法将质粒转化到小麦品种“Fielder”（西北农林科技大学提供）幼胚，获得T0代再生苗。对T1代转基因植株接种条锈菌生理小种CYR31，进行表型鉴定（图4）。
过表达载体构建-正向引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAATGGCTGCGTCGCCGGA；
过表达载体构建-反向引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACCTCGGGCCGGACAGCT。
由图4可知，接种条锈菌生理小种CYR31后，与野生型相比，T1代转基因植株TaSERK1-OE植株产孢减少，对条锈菌表现出抗性。
4、小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证
获取T1代转基因小麦，对获得的TaSERK1转基因小麦进行分子检测（图5）。由图5可知，过表达TaSERK1植株的T1代转基因小麦L2~L5、L7~L9、L11、L14、L15中均表达了TaSERK1基因。
对获得的T1代转基因小麦和对照野生型“Fielder”的二叶通过摩擦接种的方法接种条锈菌生理小种CYR31的新鲜夏孢子（西北农林科技大学提供），接种后置于16°C黑暗保湿箱内保湿24小时，取出后放回16℃光照16 h，黑暗8 h光周期的生长培养箱中继续培养。接菌14天后，测定植株产孢量并计算TaSERK1基因的相对表达量（图6）。
由图6可知，与对照野生型“Fielder”相比，T1代转基因小麦TaSERK1-OE植株产孢明显减少，表明TaSERK1过表达的转基因小麦对条锈菌的抗性增强。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1基因在培育、改良小麦抗条锈病品种中的应用，其特征在于，所述TaSERK1基因的开放阅读框序列如SEQ ID NO:1所示；
所述TaSERK1基因编码小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1，所述小麦胚胎发生受体激酶TaSERK1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述TaSERK1基因受条锈菌诱导表达，在小麦抗条锈病的防御反应中起正调控作用；
过表达所述TaSERK1基因，提高小麦对条锈病的抗性。
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| The Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinase Protein TaSERK1 Positively Regulates High-Temperature Seedling Plant Resistance to Puccinia striiformis f. sp. tritici by Interacting with TaDJA7;Yifeng Shi等;《Molecular and Physiological Plant Pathology》;第113卷(第7期);摘要 * |
| Ye,X.G.等.Triticum aestivum somatic embryogenesis receptor kinase 1 (SERK1) mRNA, complete cds.《GENBANK》.2016,序列. * |
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