CN116179594A - 一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，涉及抗性植物分子育种技术领域。该含RcPFARl的转基因月季的创制方法，具体包括以下步骤：S1.基因克隆；S2.载体构建；S3.阳性克隆农杆菌制；S4.月季无菌苗的获取；S5.月季体细胞胚的诱导；S6.遗传转化；S7.转基因月季植株的获取。本发明提供一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，本发明构建基因的表达载体，将基因通过农杆菌的介导作用转入月季植株中，就可以利用基因对月季植株体内的棕榈醇合成进行调控，产生棕榈醇，让月季植株在不感染白粉菌的情况下获得对甜菜夜蛾的抗性，本发明突破了传统育种手段的障碍，为植物抗虫能力的调控提供了重要的基因工程方法。

Description

一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法

技术领域

本发明涉及抗性植物分子育种技术领域，具体为一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法。

背景技术

随着现代农业不断发展，对生态环境的保护更加深入人心。与此同时，植物保护理念不断发展变化，有害生物防治过程中以“防”为先成为业界共识，而不是有害生物爆发才“治”，因此，植物源农药应运而生，为常规化学农药存在的“3R”问题的解决提供了新途径。这其中，植物源害虫驱避剂引起了专家学者高度关注。害虫驱避剂作为天然信息化合物(semiochemicals)中的一类，在农林害虫寄主识别过程中起到直接的关键作用，空气中信息化合物的浓度只需达到纳克级或者更低即可被昆虫有效识别。因此，天然信息化合物用于有害昆虫的防治，可有效对昆虫行为进行调控，具有防效极高的特点。在田间实际应用过程中，害虫驱避剂与引诱剂相比有着明显的优势。一是植物自身产生引诱剂，成为人工使用的引诱剂的背景气味，掩盖了人工引诱剂的效果；二是因为昆虫具有学习能力，所以引诱剂的使用效果会随着使用时间延长而下降。

已有较多研究表明，专性寄生真菌侵染寄主植物可对同一寄主上的昆虫造成不利影响。研究结果表明，中国月季(Rosa chinensis Jacq.)感染白粉菌(Podosphaerapannosa(Wallr.:Fr.)de Bary)后会对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hü bner))产生抗性，原因是白粉菌诱导月季植株产生棕榈醇(palmityl alcohol)等挥发性成分，被甜菜夜蛾成虫作为信息化合物，用于识别寄主植物是否感病。如果识别出棕榈醇，成虫就会确认植株感病并避免在该植株上产卵，因此可用于防止该虫对植株的危害。

显然，在切花月季生产过程中，不能为了防治甜菜夜蛾而让植株感染白粉菌，但是可将人工合成的棕榈醇施用于健康月季植株上，就能在不感染白粉菌的情况下防治甜菜夜蛾。不过，更进一步，随着基因工程技术不断发展进步，创制新型转基因月季植株，让植株自身合成棕榈醇，从而获得对甜菜夜蛾的抗性，这已成为可能。这也为抗性分子育种领域的研究提供一种全新的思路和方法。

为此，本发明研制开发一种创制转基因月季植株的方法，可使植株获得对甜菜夜蛾的抗性。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，解决了现有的月季植株存在生长过程中难以处理病虫危害的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，具体包括以下步骤：

S1.基因克隆

基因RcPFARl的克隆；

S2.载体构建

表达载体构建；

S3.阳性克隆农杆菌制备

将所述的重组载体加入经活化的根癌农杆菌EHA105中，在平板培养基上划线培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，获得含有目标基因RcPFARl的阳性克隆农杆菌；

S4.月季无菌苗的获取

采集带1个腋芽的月季茎段作为外植体，消毒，在培养基上培养得到无菌苗，将无菌苗腋芽剪下、接种于继代培养基上继续培养，获得足够数量的无菌苗；

S5.月季体细胞胚的诱导

从无菌苗采集叶片作为外植体，在体细胞胚诱导培养基上培养，直接诱导出月季体细胞胚，将所述的体细胞胚进一步进行继代培养，获得受体材料；

S6.遗传转化

将所述的受体材料转入农杆菌菌液中进行侵染，从而将棕榈醇形成脂酰辅酶A还原酶样蛋白基因RcPFARl的目标基因RcPFARl转入月季体细胞胚中；

S7.转基因月季植株的获取

将所述的含有目标基因的体细胞胚依次进行增殖培养、继代培养、成苗培养、生根培养，最终获得月季‘艳粉’的转基因植株。

优选的，所述转入目标基因使得月季植株在不感染白粉菌的情况下自身就能合成棕榈醇。

优选的，所述在含有目标基因RcPFARl的月季体细胞胚中和最终获得的植株中均能检测到棕榈醇。

优选的，所述月季体细胞胚和植株中棕榈醇的检测方法为SPME-GC-MS。

优选的，所述体细胞胚和植株中棕榈醇含量分别为14.7±2.1和27.6±4.5ng·g^―1fw·h^―1。

优选的，所述棕榈醇的合成使植株获得了对甜菜夜蛾等害虫的抗性。

优选的，所述被转入的基因RcPFARl在正常健康月季植株中不表达，在自然界中只有在白粉菌侵染的诱导作用下才会表达。

(三)有益效果

本发明提供了一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法。具备以下有益效果：

本发明提供了一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，本发明将含有目标基因的体细胞胚依次进行增殖培养、继代培养、成苗培养、生根培养，最终获得月季‘艳粉’的转基因植株，其目标基因在月季植株中表达，使月季植株自身合成棕榈醇，从而对甜菜夜蛾产生抗性，通常情况下，健康月季植株不会合成棕榈醇。白粉菌侵染月季后，能诱导月季表达目标基因RcPFARl，使月季植株合成棕榈醇，从而对甜菜夜蛾产生抗性，但是不能为了防治甜菜夜蛾而让月季感染白粉菌，因此，本发明筛选出的目标基因，利用基因工程技术将目标基因转入健康月季植株中，自身合成棕榈醇，使月季在不感染白粉菌的情况下获得对甜菜夜蛾的抗性。

附图说明

图1为本发明健康和感染白粉菌的月季组织的转录组学和代谢组学联合分析图；

图2为本发明目标基因RcPFARl的qRT-PCR验证图；

图3为本发明月季遗传转化体系图；

图4为本发明月季样品中的棕榈醇含量图；

图5为本发明转基因月季对甜菜夜蛾的抗性图；

图6为本发明目标基因RcPFARl的序列表图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

如图1-6所示，本发明实施例提供一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，具体包括以下步骤：

S1.基因克隆

基因RcPFARl的克隆；

S2.载体构建

表达载体构建；

S3.阳性克隆农杆菌制备

将所述的重组载体加入经活化的根癌农杆菌EHA105中，在平板培养基上划线培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，获得含有目标基因RcPFARl的阳性克隆农杆菌；

S4.月季无菌苗的获取

采集带1个腋芽的月季茎段作为外植体，消毒，在培养基上培养得到无菌苗，将无菌苗腋芽剪下、接种于继代培养基上继续培养，获得足够数量的无菌苗；

S5.月季体细胞胚的诱导

从无菌苗采集叶片作为外植体，在体细胞胚诱导培养基上培养，直接诱导出月季体细胞胚，将所述的体细胞胚进一步进行继代培养，获得受体材料；

S6.遗传转化

将所述的受体材料转入农杆菌菌液中进行侵染，从而将棕榈醇形成脂酰辅酶A还原酶样蛋白基因RcPFARl的目标基因RcPFARl转入月季体细胞胚中，被转入月季的基因RcPFARl的序列如SEQ ID NO.1所示；

S7.转基因月季植株的获取

将所述的含有目标基因的体细胞胚依次进行增殖培养、继代培养、成苗培养、生根培养，最终获得月季‘艳粉’的转基因植株。

所述转入目标基因使得月季植株在不感染白粉菌的情况下自身就能合成棕榈醇，所述在含有目标基因RcPFARl的月季体细胞胚中和最终获得的植株中均能检测到棕榈醇，所述月季体细胞胚和植株中棕榈醇的检测方法为SPME-GC-MS。

所述体细胞胚和植株中棕榈醇含量分别为14.7±2.1和27.6±4.5ng·g^―1fw·h^―1，所述棕榈醇的合成使植株获得了对甜菜夜蛾等害虫的抗性，与对照相比，甜菜夜蛾雌蛾在转基因月季上的产卵量减少88.6％，所述被转入的基因RcPFARl在正常健康月季植株中不表达，在自然界中只有在白粉菌侵染的诱导作用下才会表达。

基于本发明的方法步骤：(1)目标基因RcPFARl的克隆；(2)表达载体构建；(3)阳性克隆农杆菌(EHA105)制备；(4)月季无菌苗的获取；(5)月季体细胞胚的诱导；(6)遗传转化：将体细胞胚转入阳性克隆农杆菌菌液中进行侵染，从而将目标基因RcPFARl转入月季体细胞胚中；(7)转基因月季植株的获取：将所述的含有目标基因的体细胞胚依次进行增殖培养、继代培养、成苗培养、生根培养，最终获得月季‘艳粉’的转基因植株。

棕榈醇作为一种天然信息化合物，对甜菜夜蛾有强烈的驱避作用，在空气中的浓度只需达到纳克级或者更低即可被甜菜夜蛾高效识别出来，从而可保护月季免受该虫入侵。本发明所述的目标基因转入月季后在月季中的表达量很低，生成的棕榈醇含量也极低，却能使月季获得高效的抗虫性。亦即，月季为获得高效抗虫性所需付出的代价是极小的，这是本发明的最重要的特点。

本发明的工作原理：

中国月季(Rosa chinensis Jacq.)俗称玫瑰，居世界四大鲜切花之首，深受人们喜爱，在全世界广为栽培。但是月季上的病虫害发生也十分严重，主要包括月季白粉菌(Podosphaera pannosa(Wallr.:Fr.)de Bary)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua(Hü bner))等。研究结果表明，月季感染白粉菌后会对甜菜夜蛾产生抗性，原因是白粉菌诱导月季植株产生棕榈醇等挥发性成分，被甜菜夜蛾成虫作为信息化合物，用于识别寄主植物是否感病。如果识别出棕榈醇，成虫就会确认植株感病并避免在该植株上产卵，因此可用于防止该虫对植株的危害。棕榈醇作为一种天然信息化合物，对甜菜夜蛾有强烈的驱避作用，在空气中的浓度只需达到纳克级或者更低即可被甜菜夜蛾高效识别出来，从而可保护月季免受该虫入侵。

显然，在切花月季生产过程中，不能为了防治甜菜夜蛾而让植株感染白粉菌。但是可将人工合成的棕榈醇施用于健康月季植株上，就能在不感染白粉菌的情况下防治甜菜夜蛾。不过，更进一步，随着基因工程技术不断发展进步，创制新型转基因月季植株，让植株自身合成棕榈醇，从而获得对甜菜夜蛾的抗性，这已成为可能。这也为抗性分子育种领域提供一种全新的思路和方法。为此，本发明研制开发一种创制转基因月季植株的方法，可使植株获得对甜菜夜蛾的抗性。本发明所述的目标基因转入月季后在月季中的表达量很低，生成的棕榈醇含量也极低，却能使月季获得高效的抗虫性。亦即，月季为获得高效抗虫性所需付出的代价是极小的，这是本发明的最重要的特点。

本发明的特点：

将所述目标基因转入月季植株后，月季会产生棕榈醇，从而使月季获得对甜菜夜蛾的抗性。棕榈醇作为一种甜菜夜蛾用于识别寄主健康状况的信息化合物，含量极低的棕榈醇即可对昆虫行为产生强烈的调控作用，用来代替化学农药对甜菜夜蛾进行防治，不会导致该虫产生抗药性。

同时，棕榈醇来自寄主植物，在自然界中有着天然的完整的降解途径，不会对环境产生不良影响，是一种环境友好型的活性成分，加之月季产生的棕榈醇极少，更不会对环境产生不良影响。该方法利用所转入的基因，控制植物定向合成特定的活性化学成分，用于害虫防治，为植物保护可持续发展相关研究领域提供新思路和新方法，具有广阔的应用前景。

本发明所述的目标基因转入月季后在月季中的表达量很低，生成的棕榈醇含量也极低，不会对月季植株产生不良影响，但却能使月季获得高效的抗虫性。亦即，月季为获得高效抗虫性所需付出的代价是极小的，这是本发明的最重要的特点。

附图1健康和感染白粉菌的月季组织的转录组学和代谢组学联合分析

图中，A为转录组学分析结果，目标基因RcPFARl的Gene ID为gene27628；B为非靶向代谢组学分析结果，对甜菜夜蛾具有强烈驱避活性的信息化合物是棕榈醇(palmitylalcohol)。通过联合分析可知，目标基因直接控制棕榈醇的合成，感染白粉菌后目标基因和棕榈醇的表达量均上调，差异达到显著水平(P<0.05)。

附图2目标基因RcPFARl的qRT-PCR验证

图中目标基因表达量变化趋势与转录组分析结果一致。

附图3月季遗传转化体系

图中，A为1％琼脂凝胶电泳结果，左起第一列为Marker，第二、三列为目标基因RcPFARl；B为搭载了目标基因的载体；C为月季体细胞胚；D为转入了目标基因的月季叶片。

附图4月季样品中的棕榈醇含量

图中，SE1为不含目标基因的月季体细胞胚(somatic embryo)，作为对照；SE2为含目标基因的月季体细胞胚。L1和L2分别为月季叶片(leaf)样品，L1为对照，不含目标基因，L2中已转入了目标基因。“***”表示差异极显著(P<0.001)。

附图5转基因月季对甜菜夜蛾的抗性

图中数据表示双选生物测试中的每雌平均产卵量，A为卵块数(块)，B为卵数(枚)。L1为对照植株，L2为转基因月季植株。“***”表示差异极显著(P<0.001)

图6的目标基因RcPFARl的序列表SEQ ID NO.1月季‘艳粉’(Rosa chinensisJacq.)。

实施例2：

如图1-2所示，本发明实施例提供一种目标基因的发现

收集健康和感染白粉菌的月季叶组织，采用转录组学和代谢组学联合分析的方法进行分析，找出与月季体内棕榈醇合成相关的基因，即为目标基因。

(1)转录组学和代谢组学联合分析

本发明所述的一种转基因月季，其栽培品种为‘艳粉’。采集健康和感染白粉菌后的月季叶片各3份，用去离子水洗净，液氮冷冻保存，用于转录组测序。叶组织用Trizol试剂法提取总RNA并去除DNA污染，NanoDrop 1000检测RNA纯度及浓度，富集mRNA。以mRNA作为模板，合成第一条cDNA链，随后合成第二条cDNA链。将双链的cDNA补成平末端，后在3’末端加上“A”碱基，最后采用Illumina Novaseq 6000对修饰后的cDNA进行高通量测序，获得Unigene，结合参考基因组利用Swiss-Prot、GO、KEGG、NCBI、Pfam等数据库对比以获取注释信息。接下来用DESeq2(1.38.0)进行差异基因分析，筛选条件为：P-adjust<0.05以及|log2FC|≥1，采用BH(Benjamini/Hochberg)法校正，上下调差异倍数2.0倍。对差异基因进行PCA分析、火山图分析、Venn分析、聚类分析等，并对目标基因进行生物信息学分析。

其中火山图分析结果如图1(A)所示。目标基因RcPFARl的Gene ID为gene27628，位于火山图中的红色区域，表明所述的目标基因在感染白粉菌后上调表达，其log2FC为1.14、-log10(P-adjust)为12.70，尽管表达量不高，但差异达到极显著水平(P<0.0001)。具体而言，在3个健康对照(CK)样品中所述基因的TPM值分别为0.00、0.01、0.00，在3份感染白粉菌后的处理(T)样中分别为0.14、0.15、0.11，可知，目标基因在正常情况下不表达，但可被白粉菌诱导表达。生物信息学分析结果表明，所述的目标基因为脂酰辅酶A还原酶。

另外采集健康(CK)和感染白粉菌(T)的月季叶片样品各6份，每份样品用400μl甲醇-水(4:1,v/v)提取。前处理完毕采用UHPLC-Q Exactive system进行非靶向代谢组学分析，ESI负模式为-2800V，正模式3500V，碰撞能量20-40-60V滚动，质谱扫描范围70–1050m/z，采用软件Progenesis QI进行分析，结果如图1(B)所示。可知，在CK组和T组中棕榈醇表达量定量值分别为0.00±0.00、3.42±0.04，在健康月季中未检测到棕榈醇，感染白粉菌后棕榈醇含量上调表达，表达量很低，但差异达到极显著水平(P<0.0001)。

对图1(A)和图1(B)中的结果进行转录组学和代谢组学联合分析，利用iPath3.0、KEGG、HMDB等网站进行Pathway分析，可初步确认所述的目标基因RcPFARl编码棕榈醇形成脂酰辅酶A还原酶样蛋白(PFARl)，催化月季体内棕榈醇形成，反应方程式如下。

(2)目标基因RcPFARl的qRT-PCR验证

利用提取的RNA进行逆转录合成cDNA，每样本设置3个生物学重复。以月季感染白粉菌感前后稳定表达的基因LOC112165308为内参基因，利用Primer Premier 6.0软件设计目标基因RcPFARl的qRT-PCR引物(F:GTCGACATGGAGTTGGAGAGCATAGTGGCAT A CCTAAGC；R:CCGAGCTCTTCATTTGTTCAGAACATGTTTCAGGA ATCCTGG)，进行qRT-PCR验证。qRT-PCR的扩增流程为：95℃预变性120s；95℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸120s，进行30个循环，结果如图2所示。结果表明，目标基因RcPFARl的表达量变化趋势与转录组学分析结果一致，转录组学分析结果可靠。

实施例3：

如图3所示，本发明实施例提供一种月季遗传转化体系建立

实施例3a，目标基因RcPFARl的克隆及重组载体构建。采集感染白粉菌的月季叶片，采用qRT-PCR的方法对目标基因RcPFARl进行克隆。扩增产物经过1％琼脂凝胶电泳检测，条带在1500bp左右，与目的基因长度大小相同。切胶后按照TaKaRa公司的DNA高度纯化回收试剂盒方法进行回收，获得目的片段。根据目标基因的CDS序列及载体pRI-201-AN的序列使用SnapGene软件设计目的片段与载体的连接方式，按设计好的连接方式将回收后的目的片段与载体用SalI与SacI分别进行双酶切，电泳后切胶回收，回收产物用TaKaRa公司T4DNA Ligase试剂盒方法进行连接，以获得携带目标基因的重组载体。

实施例3b，阳性克隆农杆菌制备。将携带目标基因的重组载体加入经活化的感受态根癌农杆菌EHA105中，平板划线到含20μg/mL rif和50μg/mL kana的YEB平板上，将平板倒置放于28℃培养箱培养2～3天。挑取单克隆进行PCR鉴定，获得含有目标基因的阳性克隆农杆菌。

实施例3c，月季无菌苗的获取及体细胞胚的诱导。采集带1个腋芽的健康月季茎段作为外植体，75％酒精消毒30s，无菌水冲洗，2％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗，接种于MS培养基(除特别指明外，本发明用于月季的所有培养基均含30μg/mL葡萄糖)+0.5μg/mL6-BA，调节pH至5.8～6.0，(25±1)℃暗培养，获得无菌苗。将无菌苗腋芽剪下、接种于继代培养基(MS+0.5μg/mL 6-BA+0.05μg/mL NAA)上，光周期L14:D10继续培养，获得足够数量的无菌苗。从无菌苗采集叶片作为外植体，在体细胞胚诱导培养基(MS+3μg/mL 2,4-D)上培养，诱导出月季体细胞胚，将所述的体细胞胚进一步进行增殖培养(MS+1μg/mL 2,4-D+0.03μg/mL 6-BA+50μg/mL葡萄糖)、继代培养(MS+1μg/mL 2,4-D+0.03μg/mL 6-BA)，获得受体材料。

实施例3d，农杆菌侵染月季体细胞胚以及转基因月季苗的获取。用携带目标基因的阳性克隆农杆菌菌液侵染受体材料月季体细胞胚，侵染时间为40min。侵染完成后，除去体细胞胚中的菌液，接种于培养基(MS+1μg/mL 2,4-D+0.02μg/mL 6-BA+45μg/mL葡萄糖)中，暗培养2天。接下来将培养后的体细胞胚接种至成苗培养基(MS+1μg/mL TDZ+0.4μg/mL6-BA)培养10周，每两周更换一次培养基，直至长出无根或根系生长较弱的幼苗，在转接至生根培养基(MS+0.01μg/mL NAA)上培养，从而获得转基因幼苗，幼苗中包含了目标基因。另外，用含有相同载体但未携带目标基因的农杆菌侵染月季体细胞胚，同法获得幼苗但目标基因未转入幼苗中。采集携带目标基因的转基因幼苗和未携带目标基因的幼苗，将后者作为对照，进行GUS检测，筛选出携带目标基因的阳性植株，并进一步进行PCR验证。月季遗传转化体系如附图3所示。

实施例4：

如图4所示，本发明实施例提供一种棕榈醇检测

采集实施例3中所述的四类月季样品，第一类样品为体细胞胚(somatic embryo,SE)样品，用含有相同载体但未携带目标基因RcPFARl(空载体)的农杆菌侵染，编号为SE1，作为对照组；第二类为体细胞胚，用含有相同载体且携带目标基因RcPFARl的农杆菌侵染，即，目标基因已转入，编号为SE2，作为处理组；第三类为月季叶片(leaves)，从SE1培养获取月季植株，并采集叶片，不含目标基因，编号为L1，作为对照组；第四类为月季叶片，从SE2培养获取月季植株，并采集叶片，包含目标基因，编号为L2，作为处理组。每类样品设3个生物学重复，SPSS 17.0(student t检验)做统计分析。

将月季样品放入顶空瓶中，60℃加热30min，让经活化的固相微萃取头充分吸附从样品中挥发出来的挥发性成分，采用SPME-GC-MS法测定棕榈醇的含量，用棕榈醇标准品进行外标法定量。固相微萃取头吸附完毕后，对于月季体细胞胚，过滤、用滤纸吸干，在电子天平上称出体细胞胚的鲜重，对于叶片样品则直接称出鲜重，用于计算棕榈醇在各样品中的含量，结果以ng·g^―1fw·h^―1为单位表示，如附图4所示。结果表明，在月季体细胞胚对照组(SE1)中和叶片对照组(L1)样品中均未检测到棕榈醇，而在体细胞胚处理组(SE2)中和叶片处理组(L2)中均检测到了棕榈醇，表明转基因成功。

实施例5：

如图5所示，本发明实施例提供一种转基因月季植株的抗虫性

所述的植株为正常生长的完整月季植株L1和L2，两种植株均采用相同方法获得，先用含有载体的农杆菌侵染月季体细胞胚，再从体细胞胚培养获取月季植株。但L1的载体中不含目标基因RcPFARl，是空载体，所以目标基因未转入月季植株中，作为对照；L2携带目标基因，成为了转基因月季植株。

人工饲养甜菜夜蛾至化蛹，将蛹取出在体视镜下区分雌雄，雌雄蛹分开单独饲养至羽化。

将长势良好、叶数相近的植株L1和L2放入铁丝网制成的产卵笼中，相距50cm，放入3对羽化2天、飞翔正常、雌雄配对的甜菜夜蛾成虫，让雌蛾任意选择在L1或L2上产卵。在枝条上悬挂蘸有适量蜂蜜水(10％)的棉花，作为成虫营养源。每日在体视镜下记录两种植株上的卵块数和产卵量至所有雌蛾不再产卵，每次记录完毕更换植株，设5个生物学重复(共计15对成虫)，计算每雌平均产卵量，SPSS 17.0(student t检验)做统计分析，结果如附图5所示。结果表明，无论是从卵块数或是卵数来看，甜菜夜蛾抱卵雌蛾均选择在对照月季植株L1上产卵，在转基因月季植株L2上的产卵量显著较低，差异达到极显著水平(P<0.001)。与对照相比，甜菜夜蛾雌蛾在转基因月季上的产卵量减少了88.6％。由于目标基因RcPFARl的转入，转基因月季植株合成了棕榈醇，作为甜菜夜蛾的天然信息化合物，可被抱卵雌蛾高效识别出来，从而避免在该转基因月季植株上产卵，表明转基因月季植株获得了对甜菜夜蛾的显著抗性。

综上所述，本发明从月季‘艳粉’茎段培养出无菌苗，再用无菌苗作为外植体诱导出月季体细胞胚。利用根癌农杆菌介导，将目标基因RcPFARl转入体细胞胚中，进一步从体细胞胚诱导产生转基因月季植株，从而，该转基因月季植株中携带了目标基因。目标基因表达后使月季产生棕榈醇，从而使转基因月季植株获得了对甜菜夜蛾的显著抗性。月季植株中目标基因的表达量较小，生成的棕榈醇含量很低，表明植株付出的代价很小，但是却能对甜菜夜蛾产生十分显著的抗性。本发明提供了一种转基因月季植株的创制方法，为植物抗虫能力的调控提供了重要的基因工程方法，为各类植物各类病虫害防治的研究提供了新的路径和手段，应用前景广阔。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1.基因克隆

基因RcPFARl的克隆；

S2.载体构建

表达载体构建；

S3.阳性克隆农杆菌制备

将所述的重组载体加入经活化的根癌农杆菌EHA105中，在平板培养基上划线培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，获得含有目标基因RcPFARl的阳性克隆农杆菌；

S4.月季无菌苗的获取

采集带1个腋芽的月季茎段作为外植体，消毒，在培养基上培养得到无菌苗，将无菌苗腋芽剪下、接种于继代培养基上继续培养，获得足够数量的无菌苗；

S5.月季体细胞胚的诱导

从无菌苗采集叶片作为外植体，在体细胞胚诱导培养基上培养，直接诱导出月季体细胞胚，将所述的体细胞胚进一步进行继代培养，获得受体材料；

S6.遗传转化

将所述的受体材料转入农杆菌菌液中进行侵染，从而将棕榈醇形成脂酰辅酶A还原酶样蛋白基因RcPFARl的目标基因RcPFARl转入月季体细胞胚中；

S7.转基因月季植株的获取

将所述的含有目标基因的体细胞胚依次进行增殖培养、继代培养、成苗培养、生根培养，最终获得月季‘艳粉’的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述转入目标基因使得月季植株在不感染白粉菌的情况下自身就能合成棕榈醇。

3.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述在含有目标基因RcPFARl的月季体细胞胚中和最终获得的植株中均能检测到棕榈醇。

4.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述月季体细胞胚和植株中棕榈醇的检测方法为SPME-GC-MS。

5.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述体细胞胚和植株中棕榈醇含量分别为14.7±2.1和27.6±4.5ng·g^―1fw·h^―1。

6.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述棕榈醇的合成使植株获得了对甜菜夜蛾等害虫的抗性。

7.根据权利要求1所述的一种含RcPFARl的转基因月季的创制方法，其特征在于：所述被转入的基因RcPFARl在正常健康月季植株中不表达，在自然界中只有在白粉菌侵染的诱导作用下才会表达。

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