CN115896140B

CN115896140B - β-1，6-葡聚糖酶基因及检测引物、应用

Info

Publication number: CN115896140B
Application number: CN202211656418.9A
Authority: CN
Inventors: 李昌焱; 申恩龙; 林拥军; 游艾青; 崔中利; 李周坤
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops; Huazhong Agricultural University; Nanjing Agricultural University
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops; Huazhong Agricultural University; Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-12-22
Also published as: CN115896140A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种β‑1，6‑葡聚糖酶基因及检测引物、应用。本发明提供了一种β‑1，6‑葡聚糖酶基因，所述β‑1，6‑葡聚糖酶基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。所述β‑1，6‑葡聚糖酶基因经密码子优化，能导入水稻受体，在水稻中实现高表达，进而提高水稻对真菌性病害的抗性。

Description

β-1，6-葡聚糖酶基因及检测引物、应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种β-1，6-葡聚糖酶基因及检测引物、应用。

背景技术

水稻是世界上主要谷类作物之一，也是全球30亿人口主要粮食来源。然而，由于常年遭受生物胁迫，水稻安全生产会受到影响，其中因各种病害造成的产量损失在30％以上。水稻真菌性病害主要包含由死体营养型病原菌Rhizoctonia solani Kühn引起的纹枯病、由半活体营养型真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病和由活体营养型真菌Ustilaginoidea Virens引起的稻曲病。

目前人们防治病害主要措施为喷洒农药，然而由于病原体的抗药性增强，对自然生态系统的破坏以及农药残留等问题，有必要寻找更安全可靠的防治途径来保证世界粮食安全。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种β-1，6-葡聚糖酶基因，所述β-1，6-葡聚糖酶基因经密码子优化，能导入水稻受体，在水稻中实现高表达，进而提高水稻对真菌性病害的抗性。

β-1，6-葡聚糖是真菌细胞壁中十分重要的组分，可以与其它分子β-1，3-葡聚糖，几丁质和糖磷脂酰肌醇锚定分子(GPI)交联维持细胞稳定。β-1，6-葡聚糖酶能够专一切割β-1，6-糖苷键，可以靶向真菌细胞壁从而抑制真菌生长。GluM是一种β-1，6-葡聚糖酶，来源于粘细菌Corallococcus sp.菌株EGB中，能够水解真菌细胞壁，进而参与捕食稻瘟病菌。基于植物体基因表达和细菌基因表达的差异性，一般认为细菌来源的基因在植物体内难以表达得到正常活性的蛋白。很多微生物来源的基因由于其序列特征在水稻中的表达可能存在异常。现有研究中，GluM基因功能的验证仅在微生物中进行，并没有在植物特别是没有在水稻转化中进行验证。

在本发明中，所述β-1，6-葡聚糖酶基因包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因是一种人工合成和修饰的新的GluM蛋白编码序列，通过对原始序列进行密码子优化，以提高植物偏爱密码子的使用频率、去除可以形成复杂二级结构的序列、去除富含AT碱基的序列，同时，去除常用的限制性内切酶酶切位点。本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因相比原始基因序列的GC含量降低，可以避免GluM基因在水稻中异常转录和翻译；GluM基因相比原始基因序列限制性内切酶识别位点数量显著降低，有利于基因工程操作。在本发明提供的实施例中，采用农杆菌介导的粳稻遗传转化法，将所述的GluM基因导入受体水稻品种中花11中，可以获得GluM基因单拷贝且GluM基因表达正常的抗真菌性病害水稻品种GZ12。经验证，所述水稻品种GZ12对水稻稻瘟病、纹枯病和稻曲病抗病均具有良好抗性。说明本发明提供的β-1，6-葡聚糖基因利于基因工程操作，能在水稻中表达得到正常活性的GluM蛋白。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料包括所述β-1，6-葡聚糖酶基因的核苷酸序列。

在本发明提供的优选实施方式中，所述生物材料包括人工合成序列；所述人工合成序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

在本发明提供的另一种优选实施方式中，所述生物材料包括表达载体；所述表达载体包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体pGTH-GluM是以含有抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*的pGTH-3质粒为基础载体，将人工合成的GluM基因插入其多克隆位点，形成的植物表达载体。表达载体pGTH-GluM的T-DNA区包含I.variabilis-EPSPS*基因。本发明为了培育出无抗生素标记的转基因作物，避免影响粮食安全或生态环境，应用I.variabilis-EPSPS*基因作为筛选标记。因此，本发明利用pGTH-GluM载体获得转基因植株不仅具有真菌性病害抗性，还具有抗草甘膦除草剂功能，具有较高的生物安全性。

本发明提供了所述β-1，6-葡聚糖酶基因或者所述生物材料在提高水稻对真菌性病害抗性中的应用。

具体的，本发明提供了一种获得抗真菌性病害水稻的方法，包括如下步骤：将所述β-1，6-葡聚糖酶基因或者所述生物材料导入水稻受体，获得抗真菌性病害的转基因水稻。

真菌细胞壁是一种特异的细胞结构，其主要成分β-1，6-葡聚糖也是真菌细胞壁特有的，并不存在于人类和其他哺乳动物中。因此，β-1，6-葡聚糖酶GluM并不会靶向人类或哺乳动物产生毒性，将所述β-1，6-葡聚糖酶基因或者所述生物材料应用于提高水稻对真菌性病害抗性，具有较高的生物安全性。

本发明还提供了一种检测引物，用于检测所述β-1，6-葡聚糖GluM基因，所述检测引物包括引物1和引物2，所述引物1包括SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列(GATCAGGAGTTCATCAAG)；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；所述引物2包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列(GAAGAACCACAGCTTATC)；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明提供了另外一种检测引物，用于检测所述I.variabilis-EPSPS*基因，所述检测引物包括引物3和引物4，所述引物3包括SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列(CCCCACCCAAAGGTAAGGC)；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列；所述引物4包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列(AGCAGAGGCGTCCACATCC)；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述引物1和引物2；或者，包括所述引物3和引物4；或者，包括所述引物1、引物2、引物3和引物4。

有益效果：

本发明提供了一种β-1，6-葡聚糖酶基因，所述β-1，6-葡聚糖酶基因包括SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；或，在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。所述β-1，6-葡聚糖酶基因经密码子优化，能导入水稻受体，在水稻中实现高表达，进而提高水稻对真菌性病害的抗性。

附图说明

图1为本发明实施例2所述载体pGTH-3的结构示意图。

图2为本发明实施例2所述载体pGTH-GluM的结构示意图。该载体是在pGTH-3的基础上改造而来，在多克隆位点处连接了外源基因GluM的表达框架。

图3是本发明获得的转基因家系GZ12的拷贝数检测结果。用HindⅢ对转化载体和水稻基因组DNA进行酶切，用DIG标记GluM探针进行杂交，野生型(非转基因)水稻中花11没有杂交条带，转化载体pGTH-GluM和GZ12有杂交条带。其中，M：为DIG标记marker；泳道N、P和GZ12分别表示野生型中花11、转化载体、GZ12的基因组DNA用HindⅢ酶切。

图4是本发明获得的转基因家系GZ12的特征性PCR胶图。其中：分别用引物I.variabilis-EPSPS*-F/R(上部)和GluM-F/R(下部)进行扩增；P和N代表以阳性对照和阴性对照为模板；1-22代表以部分不同转基因家系为模板。M代表DNAmarker，从上到下条带大小依次为1kb、750bp和500bp。

图5是本发明克隆的GluM基因在转基因家系GZ12中的表达量的检测结果。其中，利用Northern blot对GluM在GZ12的转录进行检测。杂交使用的探针为DIG标记的GluM探针。M代表marker,ZH11代表野生型中花11，上部是GluMmRNA丰度，下部代表上样量相同。

图6是本发明实施例8中利用Western blot对GluM基因在转基因家系GZ12中的翻译进行检测的结果。

图7是本发明实施例7中获得的转基因家系GZ12的草甘膦筛选结果。其中，GZ12表示转GluM基因中花11纯合株系；ZH11表示野生型中花11。

图8是本发明实施例9中获得的转基因家系GZ12抗病抗性结果。其中a图表示纹枯病，b图表示稻瘟病，c图表示稻曲病。a图、b图和c图中，ZH11表示野生型中花11，GZ12表示GluM基因中花11纯合株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

实施例1：GluM序列的密码子优化

本发明所用目的基因GluM的原始序列是南京农业大学崔中利教授课题组从微生物即粘细菌Corallococcus sp.菌株EGB中克隆获得(基因功能验证也是在微生物中验证的，并没有在植物特别是没有在水稻转化中进行验证，参见文献：Li,et al.Anovel outermembrane beta-1,6-glucanase is deployed in the predation offungi bymyxobacteria.ISMEJ,2019b,13:2223-2235)，原始基因命名为的GluM，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示，编码氨基酸的序列如SEQ ID NO.5所示，不同密码子的使用频率如表1所示。对原始GluM基因进行分析，将其应用于抗真菌性病害水稻的培育可能存在如下问题：限制性内切酶识别位点过多；原始GluM基因中一些非最优密码子如丙氨酸密码子GCG、脯氨酸密码子CCC、精氨酸密码子CGG等过多使用不仅导致序列GC含量提高而且可能导致翻译异常。

本发明以不同密码子在单子叶植物中的使用频率为依据，在不改变编码氨基酸序列的前提下对来自微生物源的原始GluM基因序列进行修饰。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，密码子使用频率如表1所示。经测定本发明修饰的GluM基因序列中：(1)碱基A的含量为16.36％、碱基C的含量为28.43％、碱基G的含量为31.39％、碱基T的含量为23.82％，其GC含量降低到60％，本发明修饰的GluM基因序列与原基因GluM序列的同源性为87％，但是本发明修饰的基因编码的氨基酸序列与原始来源基因序列完全相同；(2)用DNAMAN软件对GluM基因序列进行分析，限制性内切酶识别位点降低到35个识别位点；(3)丙氨酸、脯氨酸和精氨酸等氨基酸的最优密码子使用频率提高；(4)42个密码子的使用频率相比原始序列发生改变，导致修饰后的序列最优密码子与非最优密码子的使用频率更加均衡，利于蛋白质表达。同时我们在修饰的GluM基因序列的5’末端加入BamHⅠ内切酶识别位点序列、引导序列UTR，3’末端加入终止密码子TAA，UTR及nos终止子序列和HindⅢ内切酶识别位点序列后，人工合成的DNA片段序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进行化学合成，用于植物表达载体构建。

表1密码子使用频率统计

实施例2：植物表达载体的构建

本发明所用的原始转化载体为农杆菌Ti双元载体pGTH-3，其结构示意图参见图1。用BamHⅠ+HindⅢ分别双酶切pGTH-3和GluM化学合成基因片段，然后用T₄ DNA连接酶连接，最终得到表达载体pGTH-GluM。pGTH-GluM的序列参见SEQ ID NO.3。pGTH-GluM的结构示意图参见图2。将pGTH-GluM转化到农杆菌EHA105中，将转化后的农杆菌菌株置于-70℃保存待用。

实施例3：农杆菌介导的水稻中花11的遗传转化

愈伤组织诱导和继代培养主要参考现有文献。通过梯度试验确定水稻品种中花11(常规品种，三明市农业科学研究所选育，《三明农业科技》2012年第1期(122)，特刊2；华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室保存)。抗性愈伤组织筛选所需最适的草甘膦浓度为200mg/L。农杆菌介导的中花11的转化的操作过程步骤如下：

(1)愈伤组织诱导

将成熟的水稻中花11种子去壳，然后依次用75％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞种子表面消毒15min；用灭菌水洗种子5次；将种子放在愈伤组织诱导培养基上(MS培养基基础上添加2.5mg/L 2，4-D，0.8g/L水解酪蛋白，0.6g/L脯氨酸，0.5g/L谷氨酰胺，30g/L麦芽糖和3g/Lphytagel)；将接种后的种子置于黑暗处培养4周(培养温度28±1℃)。

(2)愈伤组织继代培养

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基(营养成分与诱导培养基相同)，黑暗下培养3周(温度28±1℃)。

(3)农杆菌培养

在含有50mg/L卡那霉素的LA培养基(10g/L Tryptone,5g/L Yeast extract,10g/L NaCl,15g/L琼脂粉,pH 7.0)预培养农杆菌2d(温度为28±1℃)；将农杆菌转移至悬浮培养基(1/2MS培养基大量元素成分、1/2MS培养基微量元素成分、1/2MS培养基铁盐成分和MS培养基维生素成分基础上添加2.5mg/L 2,4-D，10g/L葡萄糖和100μM乙酰丁香酮，其中本发明所用到的MS培养基的基础成分或称MS基本培养基参见：Murashige和Skoog，1962文献，为本领域常用培养基，下同)，在摇床上以28℃，200rpm的条件培养2h。

(4)农杆菌侵染

将愈伤组织转移至灭好菌的三角瓶内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀值为0.3左右；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30min；转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(1/2MS培养基大量元素成分、1/2MS培养基微量元素成分、1/2MS培养基铁盐成分和MS培养基维生素成分基础上添加2.5mg/L 2,4-D，0.6g/L脯氨酸，30g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，100μM乙酰丁香酮和8g/L琼脂粉)上培养3d(培养温度19℃)。

(5)愈伤组织洗涤和选择培养

用灭菌水洗涤愈伤组织10次；然后将愈伤组织浸泡在含500mg/L的羧苄青霉素的灭菌水中30min；转移愈伤组织至灭好菌的滤纸上吸干；再转移愈伤组织至选择培养基(MS培养基基础上添加2.5mg/L 2，4-D，0.6g/L脯氨酸，200mg/L草甘膦，500mg/L羧苄青霉素，30g/L麦芽糖和8g/L琼脂粉)上选择培养3次，每次培养2周。

(6)分化

将抗性愈伤组织转移至分化培养基上(MS培养基基础上添加2mg/L KT，0.2mg/LNAA，2mg/L 6-BA，0.2mg/L IAA，0.8g/L水解酪蛋白，0.6g/L脯氨酸，30g/L麦芽糖和3g/Lphytagel)，光照(2000Lux)下培养(温度26±1℃)。

(7)生根

剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基(1/2MS培养基基础上添加20g/L蔗糖和3g/L phytagel)中，2000Lux光照培养3周(温度26±1℃)。

(8)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持土壤湿润。

实施例4：转基因植株的PCR检测

采用CTAB法提取水稻叶片总DNA(文献：Murry&Thompson，1980)。PCR引物的设计利用Primer3软件完成(http://bioinformatics.hzau.edu.cn/)。用于GluM基因扩增的两条引物分别是GluM-F(见SEQ ID NO.6)和GluM-R(见SEQ ID NO.7)，用于I.variabilis-EPSPS*基因扩增的两条引物分别是I.variabilis-EPSPS*-F(见SEQ ID NO.8)和I.variabilis-EPSPS*-R(见SEQ ID NO.9)。用引物GluM-F/R和I.variabilis-EPSPS*-F/R-R扩增到得到的PCR产物大小分别是576bp和565bp)。PCR反应体系：50ng模板DNA，2μL10×PCR buffer(Mg²⁺plus)，0.4μL dNTP(10mM)，0.3μL GluM–F引物/I.variabilis-EPSPS*–F引物(10μM)，0.3μL GluM–R引物/I.variabilis-EPSPS*-R引物(10μM)，1U TaqDNApolymerase，补ddH₂O至20μL。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s；重复32个循环；72℃终延伸8min。扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行检测。对所有T₀代植株进行PCR检测，分析GluM和I.variabilis-EPSPS*在转基因植株中的整合情况。结果：一共检测T₀代转化植株70株，其中45株转化植株为GluM阳性植株(见图4)。

实施例5：转基因植株GluM拷贝数检测

利用Southern杂交对45个可育的GluM家系进行GluM拷贝数分析。利用CTAB法抽提转基因水稻植株叶片总DNA(参见文献：Murry&Thompson，1980)，Southern杂交分析方法参见Roche公司的地高辛应用手册。总DNA用Hind III酶切，以地高辛标记的GluM基因的PCR扩增产物为杂交探针进行检测。根据Southern杂交结果，共确定GZ12转基因株系为单拷贝转基因株系(见图3)。

实施例6：纯合阳性转基因单株筛选

对转基因家系GZ12的T₁代株系分单株收种，将收获后的成熟种子在含有草甘膦的培养基上进行发芽试验。草甘膦培养基发芽试验具体操作步骤如下：将转基因家系GZ12的T₁代的成熟种子去壳，先用75％的乙醇浸泡消毒1min，然后将75％的乙醇倒掉，再用0.15％的升汞溶液消毒15min；最后将0.15％的升汞倒掉，用灭菌水洗5次。将消毒后的种子分别接种于草甘膦浓度为0和30mg/L的1/2MS培养基上(MS培养基参照：Murashige和Skoog，1962文献，为本领域常用培养基)，2000Lux光照培养(培养温度为26±1℃，培养时间为16小时光照/8小时暗培养)5天后统计发芽率。以理论值计算，若消毒的种子在含0mg/L草甘膦的条件下应具有100％的发芽活力，则在含草甘膦的1/2MS培养基上，阳性纯合转基因单株的发芽率为100％，杂合转基因单株的发芽率为75％左右，阴性纯合单株的发芽率为0％。通过草甘膦培养基发芽试验挑选出GZ12纯合阳性转基因单株(见图7)。

实施例8：GluM基因在纯合阳性转基因株系中的表达

当GZ12的纯合株系和野生型中花11生长至苗期，用Trizol试剂(购自北京全式金生物技术有限公司)提取RNA，用蛋白抽提液(含20mM pH 8.0Tis-Hcl，137mM Nacl，10％glycerol，1％TritonX-100，2mM EDTA和2×protease inhibitor)提取总蛋白。Nouthernblot的分析方法参照Roche公司的地高辛应用手册。GluM蛋白多克隆抗体(购自上海佑隆生物科技有限公司)通过在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达带有GST标签的GluM蛋白，利用glutathione sepharose 4B(购自GE公司)纯化表达出的蛋白，将纯化的GluM蛋白免疫兔子得到。按照常用的Western blot的分析方法进行操作。根据Northern blot结果，本发明的GluM基因在转基因家系GZ12纯合阳性株系中可以正常转录(见图5)；根据Western blot结果GluM基因在转基因家系GZ12的纯合阳性株系中可以翻译成蛋白(见图6)。

实施例9：转基因家系GZ12抗病等级评估

在水稻苗期，播种40天后，分别对T3代纯合转基因家系和野生型ZH11水稻叶片进行划伤处理，并且接种稻瘟病病原菌99-20-2孢子，保湿七天后考察病斑扩展面积。野生型ZH11病斑扩展面积为18.91mm²，但是转基因家系GZ12稻瘟病病斑扩展面积为3.27mm²，显著地小于野生型ZH11病斑扩展面积，病斑扩展面积甚至能减少82.7％，表现出了对稻瘟病极高的抗性(见图8中b图)。

在水稻孕穗期，我们分别截取T3代纯合转基因家系和野生型ZH11水稻剑叶，在室内接种纹枯病菌YN-7菌丝块，60小时后通过病斑面积评估转基因水稻纹枯病抗性。野生型ZH11每叶片平均病斑面积为222.22mm²，但是转基因家系GZ12每片剑叶病斑面积为142.76mm²，平均病斑面积相对减少35.76％，明显小于野生型ZH11病斑面积，表现出对纹枯病很高抗性(见图8中a图)。

另外，在温室中，当水稻处于孕穗末期时，分别向野生型ZH11和转基因家系穗包中注射稻曲病病原菌JS60-2的分生孢子，21天后调查病穗率和每穗稻曲球数。ZH11病穗率为38％，然而转基因家系GZ9病穗率为18％，(见图8中c图)。分析得出转基因家系的病穗率显著低于野生型，表现出对水稻稻曲病极高的抗性。

综上，为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种经修饰的β-1，6-葡聚糖酶基因及抗真菌性病害水稻的培育方法。并具体公开了GluM基因的获得、植物表达载体的构建、水稻遗传转化、抗真菌性病害水稻品种GZ12的分子鉴定和水稻稻瘟病、纹枯病和稻曲病抗病评估。

本发明所述β-1，6-葡聚糖酶基因通过对原始序列进行密码子优化及人工合成得到。进一步的，以本实验室改造的含有抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS*的pGTH-3质粒为基础载体，将人工合成的GluM基因插入其多克隆位点，形成相应的植物表达载体pGTH-GluM。真菌细胞壁是一种特异的细胞结构，并不存在于人类和其他哺乳动物中，其主要成分β-1，6-葡聚糖也是真菌细胞壁特有的。因此，β-1，6-葡聚糖酶GluM并不会靶向人类或哺乳动物产生毒性。另外，为了培育出无抗生素标记的转基因作物，避免影响粮食安全或生态环境，本发明应用的表达载体pGTH-GluM的T-DNA区包含I.variabilis-EPSPS*基因，以此基因作为筛选标记，利用该载体获得转基因植株有抗草甘膦除草剂功能，具有较高的生物安全性。

本发明采用农杆菌介导的粳稻遗传转化法，将所述基因导入受体水稻品种中花11中。具体的，本发明将水稻品种中花11的成熟种子消毒后诱导胚性愈伤组织。将含有表达载体pGTH-GluM的农杆菌菌株与胚性愈伤组织进行共培养后，在含有草甘膦的筛选培养基上进行抗性愈伤组织的筛选，将筛选出来的抗性愈伤组织在分化培养基上进行分化，当分化的小植株长到2cm左右时，切掉原生根，转移到生根培养基上进行生根，当新根生长到2cm左右时，炼苗后移栽到温室。这些再生小苗即为T0代转基因植株。在T0代植株生长期间，通过PCR方法检测GluM在转基因植株中的整合(检测转基因植物阳性率)，利用Southern blot方法检测GluM在转基因植株的拷贝数，对GluM单拷贝整合的转基因植株分单株收种。在T1代，转基因植株分家系进行种植，收获后的种子在含有草甘膦的培养基上进行发芽试验筛选得到纯合的转基因单株。通过进一步Northern blot和Western blot检测确定GluM基因的表达，经过水稻稻瘟病、纹枯病和稻曲病抗病评估，最终获得GluM基因单拷贝且GluM基因表达正常的，具有商业潜力的抗真菌性病害水稻品种GZ12。自然条件喷洒农药的情况下，通过调查了田间转基因水稻GZ12和野生型水稻ZH11的农艺性状，表明本发明获得的水稻品种GZ12的主要农艺性状不发生改变，可以应用于农业生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.β-1，6-葡聚糖酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.包含权利要求1所述β-1，6-葡聚糖酶基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为人工合成序列，所述人工合成序列为SEQ ID NO.2所示的序列。

3.包含权利要求1所述β-1，6-葡聚糖酶基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体的序列为SEQ ID NO.3所示的序列。

4.权利要求1所述β-1，6-葡聚糖酶基因、或者权利要求2所述生物材料、或者权利要求3所述表达载体在提高水稻对真菌性病害抗性中的应用。

5.获得抗真菌性病害水稻的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述β-1，6-葡聚糖酶基因、或者权利要求2所述生物材料、或者权利要求3所述表达载体导入水稻受体，获得抗真菌性病害的转基因水稻。

6.用于检测β-1，6-葡聚糖基因的引物对，其特征在于，所述检测引物对为引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.用于检测I.variabilis-EPSPS*基因的引物对，其特征在于，所述引物对为引物3和引物4，所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述引物4的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

8.用于检测β-1，6-葡聚糖基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述引物对。

9.用于检测I.variabilis-EPSPS*基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述引物对。