CN117304288B - 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用 - Google Patents

一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117304288B
CN117304288B CN202311138746.4A CN202311138746A CN117304288B CN 117304288 B CN117304288 B CN 117304288B CN 202311138746 A CN202311138746 A CN 202311138746A CN 117304288 B CN117304288 B CN 117304288B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
gene
ositand
tillering
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311138746.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117304288A (zh
Inventor
张德春
夏宁
胡东坡
田可欣
马江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Three Gorges University CTGU
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Three Gorges University CTGU filed Critical China Three Gorges University CTGU
Priority to CN202311138746.4A priority Critical patent/CN117304288B/zh
Publication of CN117304288A publication Critical patent/CN117304288A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117304288B publication Critical patent/CN117304288B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种水稻分蘖角度相关蛋白ITAND，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，还提供了ITAND表达载体、表达载体的宿主，以及在调控水稻株型提高水稻产量方面的应用。本发明提供的水稻分蘖角度相关基因ITAND在转录水平上调控水稻的分蘖角度，通过构建植物超量表达载体，农杆菌侵染转化粳稻台北309（TP309）胚性愈伤后获得转基因阳性植株，在分蘖期对阳性植株进行表型观察和定量测定实验，发现在超量表达ITAND的转基因水稻中分蘖角度明显增加。本发明为水稻的株型改良和分子设计育种提供了理论基础和科学依据。

Description

一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是人类重要的粮食作物之一，耕种与食用的历史都相当悠久。全世界有一半的人口食用稻，主要在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区，稻的总产量占世界粮食作物产量第三位。对于禾本科农作物而言，株型是作物多个农艺性状在整体水平上的综合体现，是决定作物产量的重要因素。通过改良水稻株型，培育具有理想株型的新品种是提高水稻单产的重要途径。
禾本科植物在地面以下或接近地面所发生的分枝称为分蘖，水稻产生分枝的节称为分蘖节，分蘖节的高低与分蘖的成穗率密切相关，分蘖位越低，其分蘖发生越早、生长期越长，越容易成穗；分蘖发生越迟，生长期越短而不能成穗，形成无效分蘖消耗水稻养分，降低产量。分蘖角指最大分蘖茎与主茎之间的夹角，是水稻株型的重要构成因素之一。分蘖角主要是通过影响植株对光的捕捉和对病虫害的抗性来影响作物的产量。在生产中，极端紧凑的水稻株型很容易受到病虫害的影响，而极度分散的株型又占据了太多的空间，从而降低单位面积的产量。因此，合适的分蘖角度对于高密度种植和最大限度地提高水稻群体的粮食产量至关重要。
上世纪50-60年代，育种学家利用“矮化基因”改良水稻、小麦等作物株型，培育高产品种，被称为“绿色革命”。虽然“绿色革命”带来了高产的株型，但是这种复杂且决定产量的性状究竟由什么因素决定，科学家并不清楚。目前科学家们对水稻绿色革命基因进行了深入研究，其代表性成活是国际水稻研究所于1967年培育的IR8，这一品种成功解决了东南亚地区的粮食问题，被誉为奇迹稻。奇迹稻IR8矮杆抗倒，同时丛生多蘖，十分稳产高产，控制这两个性状的基因分别来自中国台湾水稻品种低脚乌尖中的SD1DGWG基因和高大繁茂亲本皮泰中的独脚金内酯等位基因HTD1HZ。近些年来，学者们对水稻中的其他与分蘖有关的基因也进行了深入研究，如中国专利CN104479000B公开了水稻基因Os HRH在促进水稻繁殖和分蘖中的应用；中国专利CN106868019A公开了控制水稻分蘖基因OsHT1及其应用；李家洋研究组克隆了调控水稻分蘖形成的首个关键基因MOC1(Monoculm 1)(Li et al.,Nature,422:618-621,2003)及其它重要基因如MOC3(Lu et al.,JGG,42:71-78,2015)，通过对MOC3的研究发现其能够直接结合FON1的启动子区并激活它的表达。FON1在分蘖芽部位表达，特异调控分蘖芽的伸长，而不影响分蘖芽的起始，并最终使得fon1突变体出现分蘖数目显著减少的表型。进一步研究发现MOC3和MOC1不但是分蘖芽起始的关键因子，而且能够调控分蘖芽的伸长，而且MOC1可以和MOC3发生蛋白互作，并作为MOC3的共激活因子进一步增强FON1的表达(Shao et al.,Tiller Bud Formation Regulators MOC1 and MOC3Cooperatively Promote Tiller Bud Outgrowth by Activating FON1 Expression inRice.Molecular Plant,2019,12(8):1090-1102)。
但截止目前为止，还有很多与水稻分蘖有关的基因亟待发现与利用。
发明内容
本发明的目的是重新提供一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用。
本发明采用的技术方案为一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND，所述OsITAND蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的基因为OsITAND，DNA序列为SEQ ID NO:1。
本发明还提供一种重组超量表达载体，重组超量表达载体由上述OsITAND基因的DNA序列通过KpnI和SacI酶切位点插入pCXUN-Myc重组而成。
本发明还提供一种重组工程菌，重组工程菌由上述的重组超量表达载体转化入宿主菌制备而成。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株或农杆菌EHA105菌株。
本发明还提供一种超表达转基因水稻植株，所述超表达转基因水稻植物为转入了上述的重组超量表达载体或用上述的重组工程菌浸染后得到的超表达转基因水稻植株。
一种基因敲除水稻植株，所述基因敲除水稻植株为利用CRISPR-Cas9技术敲除了OsITAND基因。
本发明还提供一种超表达转基因水稻植株的生产方法，包括以下步骤：
(1)培养水稻胚性愈伤组织；
(2)采用农杆菌转化法，利用上述构建的重组工程菌侵染步骤(1)得到的水性胚性愈伤组织；经Kana抗性筛选和Rif抗性筛选得到转基因胚性愈伤组织；
(3)诱导步骤(2)得到的转基因胚性愈伤组织分化成小苗，并培养成水稻植株；
(4)对水稻植株进行PCR检测、qPCR检测以及分蘖表型分析，确定为转基因植株，其中内参基因为OsActin，检测基因为潮霉素抗性标记基因Hyg。
本发明还提供一种如水稻分蘖角度相关基因或重组超量表达载体或重组工程菌在调控单子叶植物分蘖中的应用；优选的，所述单子叶植物为水稻。
本发明的有益效果在于：通过对突变体材料的表型分析及基因的精细定位，筛选确定了一个差异基因OsITAND，通过敲除实验、超量表达实验以及转基因植物的构建实验确定该基因能够在转录水平调控水稻的分蘖角度，表明OsITAND基因为水稻分蘖角度相关基因，且随着OsITAND基因表达量的升高，水稻分蘖角增大，植株越分散，该基因的发现为水稻的株型改良和分子设计育种提供了理论基础和科学依据。本发明在验证OsITAND基因功能的过程中，构建了重组超量表达载体、两种重组工程菌：大肠杆菌DH5α菌株或农杆菌EHA105菌株以及一种超表达转基因水稻植株。
附图说明
图1为实施例1中野生型TP309和突变体itand的株型图，其中a为分蘖期的野生型TP309的株型，b为分蘖期的突变体itand的株型，c为成熟期野生型TP309的株型，d为成熟期突变体itand的株型。
图2为实施例1中水稻分蘖角度相关基因OsITAND的精细定位图。
图3为实施例1中水稻分蘖角度相关基因OsITAND的筛选确定，其中a为突变体中启动子插入序列示意图，b为野生型水稻和突变体水稻的碱基序列差异电泳图，c为OsITAND的基因的表达量柱状。
图4为实施例2中敲除了基因的水稻表型及基因突变结果图，图中a为野生型水稻与3个T0代阳性水稻的散生表明对照图，b为靶点ITAND-T1的位置示意图，c为对靶点ITAND-T1敲除后的基因突变对比图。
图5为实施例3中RNA质量检测凝胶电泳图。
图6为实施例5中OsITAND基因的PCR扩增后的凝胶电泳图。
图7为实施例8中的水稻愈伤组织，图中a为诱导一周得到的愈伤组织，b为筛选得到的转基因胚性愈伤组织。
图8为实施例9中转基因水稻的再生照片，图中a为分化出小绿芽的愈伤组织，b为转基因水稻小苗。
图9为实施例10中Hyg基因的凝胶电泳图。
图10为实施例11中转基因水稻植株的基因表达量及植株表型，图中a为OsITAND基因的表达量分析柱状图；b为转基因植株的表型，c为转基因植株的分蘖角度的柱状图。
图中WT为野生型TP309；O1、O2、O3是OsITAND基因的过表达植株。*表示t检验存在显著性(P<0.05)差异；**表示t检验存在极显著性(P<0.01)差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步解释说明，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优选实施例，而不应理解为对本发明的限制，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。本领域技术人员在充分理解本发明的技术方案上而对本发明的技术方案做出修改、替换，都落到本发明的保护范围之内。
试剂：
RN53-EASYspin Plus多糖多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒购买自北京艾德莱生物科技有限公司；
BeyoRTTMII cDNA第一链合成试剂盒、PrimeSTAR Max DNA Polymerase购买于TaKaRa公司；
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit、ChamQ SYBRqPCR Master Mix试剂盒、ClonExpress IIOne Step Cloning Kit购买于南京诺维赞生物技术股份有限公司；
Plant Genomic DNA Extraction Kit购买于天根生化科技(北京)有限公司；
Kana、Rif、特美汀以及潮霉素均购买于上海源叶生物科技有限公司；
其他未提及的试剂均属于市售。
培养基剂抗生素的配制：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L；
LB固体培养基：LB液体培养基、琼脂粉20g/L；
N6M：N6 24.1g/L、水解酪蛋白0.5g/L、肌醇0.1g/L、蔗糖30g/L、琼脂8.0g/L；
N6-CL：N6M、2,4-D 2.5mg/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
N6-IN：N6M、2,4-D 2mg/L、AS100μmol/L、pH5.2；
N6-CO：N6M、2,4-D 2mg/L、AS100μmol/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
N6-SL：N6M、2,4-D 2.5mg/L、Hyg B 50mg/L、Tim 200mg/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
N6-PS：N6M、KT 1mg/L、NAA 0.25mg/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
N6-SR：N6M、KT 1mg/L、NAA 0.25mg/L、6-BA 1mg/L、Hyg B 25mg/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
1/2MS-RR：1/2MS、NAA 0.25mg/L、Hyg B 25mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8.0g/L、pH5.8；
下述实施例中，野生型粳稻TP309，突变体材料itand、眀恢63全部由三峡大学生物技术研究中心提供。
实施例1水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND的筛选
1、水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND的表型和遗传分析
在田间从水稻品种TP309后代中发现了一个突变体材料itand，主要突变表型为分蘖角度增大，株高变矮(图1)。利用野生型TP309与itand进行正反交实验，F1代均表现为突变体表型，F2代出现性状分离，且野生型与突变体的表型分离比接近1:3，这表明itand的突变表型受单一显性核基因控制。
2、水稻分蘖角度相关基因OsITAND的精细定位
以itand为母本，水稻品种眀恢63为父本杂交得到F1，由F1自交获得F2群体，从F2群体中筛选父本表型植株作为图位克隆的定位群体。具体步骤为首先利用已知的均匀分布于水稻12条染色体24对多态性SSR标对表型与父本相似的单株进行连锁分析，初步定位在第三染色体上；然后从F2群体中选取表型与父本相似的单株进一步精细定位，最终将目的基因定位在三号染色体8046715bp-8177586bp的区间内(图2)。
3、水稻分蘖角度相关基因OsITAND的确定
通过图位克隆，我们已经确定了ITAND所在的精细定位区间，然后根据水稻基因组注释数据库预测(Rice Genome Annotation Project(uga.edu))，发现在该区间内具有17个基因，分别对野生型TP309和突变体itand进行基因组测序，发现其中一个基因LOC_Os03g14840的启动子序列存在差异，通过对该启动子的分析发现，启动子分为F2R2区和F6R4区(图3a)，分别对F2R2区、F6R4区设计引物进行扩增，发现在突变体itand中该基因启动子的F6R4区中插入了一段3420bp的转座子序列(图3a-b)，该插入并未导致基因LOC_Os03g14840的编码序列发生变化，其中F2R2的前引物序列为SEQ ID NO:3，后引物序列为SEQ ID NO:4；F6R4区的前引物序列为SEQ ID NO:5，后引物序列为SEQ ID NO:6。
然后根据LOC_Os03g14840基因的序列设计实时荧光定量PCR引物，检测该基因的表达量，其中前引物序列为SEQ ID NO:7，后引物序列为SEQ ID NO:8，发现itand突变体中LOC_Os03g14840基因的表达水平发生了显著提升(图3c)，表明突变体分蘖角的增大是由于基因LOC_Os03g14840表达量的升高而引起的，因此初步确定基因LOC_Os03g14840为水稻的散生基因，并命名为OsITAND。
实施例2水稻分蘖角度相关基因OsITAND的CRISPR-Cas9敲除实验
(1)根据OsITAND基因的序列信息，在其外显子上搜寻2个PAM位点为“NGG”的23bp的序列作为靶点，其中靶点1命名为ITAND-T1，序列为SEQ ID NO:9，靶点2命名为ITAND-T2，序列为SEQ ID NO:10；
(2)根据靶点1和靶点2，设计合成sgRNA，序列为SEQ ID NO:11；
(3)将sgRNA与载体pCBSG032酶切连接、转化筛选得到的阳性转化子；
(4)将阳性转化子转入到粳稻TP309的胚性愈伤组织中，接着经过愈伤组织的筛选、分化、生根得到敲除了OsITAND基因的水稻植株，标记为T0代阳性水稻；
(5)将T0代阳性水稻移栽到水田，在分蘖期观察它们相应的表现，结果显示CRISPR-Cas9敲除植株全部表现出紧凑的株型(图4a)。通过测序发现CRISPR-Cas9阳性植株在敲除靶点处发生了移码突变(图4b-c)，使该基因的功能丧失，水稻株型发生改变。
实施例3水稻总RNA的提取
在水稻分蘖期取生长状态良好、无病虫害的TP309、itand突变体分蘖基节为材料，利用RN53-EASYspin Plus试剂盒提取总RNA，其中RNA提取过程中所用的药勺、研钵、研磨棒等均用无水乙醇灼烧至冷却后使用，在整个提取过程中需佩戴口罩及一次性手套，避免RNA酶污染；具体步骤如下：
(1)分别取100mg超低温冰箱保存的水稻分蘖基节，液氮充分研磨后加入1mL的CLB和50μLβ-巯基乙醇，立即涡旋混匀，65℃水浴10min，中间颠倒2-3次帮助裂解；
(2)将裂解液置于冷冻离心机中在12000rpm，4℃下离心10min；
(3)取上清转到一个新的1.5mL EP管中，加入上清体积一半的无水乙醇，立即混匀，将混合物加入基因组清除柱中(清除柱放入收集管中)，13000rpm离心2min，弃废液；
(4)将基因组清除柱放入一个干净的2mL EP管内，加入500μL裂解液RLT Plus，13000rpm离心30s，收集滤液，加入0.5倍体积的无水乙醇，立即混匀；
(5)立刻将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)，13000rpm离心2min，弃掉废液；
(6)加350μL去蛋白液RW1，室温放置1min，13000rpm离心30s，弃废液；
(7)将45μL DNase I buffer和5μL RNase free DNase I混匀后加入吸附柱RA的中央，室温静置15min；
(8)向吸附柱RA中加入350μL去蛋白液RW1，13000rpm，离心30s，弃废液；
(9)加500μL漂洗液RW(已加入无水乙醇)，13000rpm离心30s，弃废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍；
(10)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min；
(11)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加30μLRNase free water，室温静置1min，12000rpm离心1min；
(12)利用分光光度计检测RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，结果如图5所示，电泳条带均为两条带，且第一条带的亮度是第二条带亮度的两倍，说明提取的RNA完整无污染，质量好，将RNA保存于-80℃备用。
实施例4水稻的cDNA获取
利用实施例3获得的水稻总RNA，利用BeyoRTTMII cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，具体步骤如下：
(1)按照表1配制反转录第一反应体系，轻柔混匀后低速离心，收集反转录体系于管底；
(2)将离心后的反转录体系放入PCR仪中，65℃反应5min后立即置于冰上冷却；
(3)取步骤(2)的都得反转录第一步反应体系，按照表2配制反转录第二部反应体系，轻柔混匀后离心，再置于PCR仪中42℃，1h；80℃，10min，得到水稻cDNA模板。
表1反转录第一步反应体系
试剂 用量
Total RNA 2μg
Oligo(dT)18 1μL
DEPC-treated Water Add To 12μL
表2反转录第二步反应体系
试剂 用量
5×Reaction Buffer 4μL
RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL
dNTP Mix(10mM) 2μL
BeyoRTTMII M-MLV反转录酶(RNase) 1μL
Reaction solution from last step 12μL
Total volume 20μL
实施例5OsITAND基因的获取
分析OsITAND基因序列并设计引物，然后以实施例4得到的cDNA为模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行OsITAND基因的扩增，具体步骤如下：
(1)将OsITAND基因序列和pCXUN-Myc载体序列提交至SnapGene中，分析基因序列和pCXUN-Myc载体UBI启动子和终止子之间的序列，发现KpnI和SacI酶切位点适用于对载体进行酶切，选取KpnI和SacI酶切位点附近的序列，设计含有同源臂的OsITAND基因引物，前引物序列为SEQ ID NO:12，后引物序列为SEQ ID NO:13；
(2)利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶进行目的基因片段扩增，扩增体系见表3，扩增程序见表4；
(3)将PCR反应完毕后得到的反应液用1％琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带与目的条带大小一致、条带清晰的部分(图6)切下，并利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收，获得纯化的OsITAND基因。
表3 PCR反应体系
试剂 用量
2×PrimerSTAR Max Premix 25μL
F1(10μM) 1μL
R1(10μM) 1μL
模板cDNA(浓度为100ng/μL) 1μL
ddH2O Add To 50μL
表4 PCR反应程序
温度 时间 循环数
98℃ 3min 1
98℃ 30s 32
58℃ 30s 32
72℃ 30s 32
72℃ 5min 1
实施例6重组超量表达载体的构建
将实施例5获得的纯化的的OsITAND基因插入到用KpnI和SacI限制性核酸内切酶处理后的线性化载体pCXUN-Myc，具体步骤如下：
(1)取10μL pCXUN-Myc载体(浓度为562.8ng/μL)，1μL KpnI(15U/μL)和1μL SacI(15U/μL)限制性核酸酶切，5μL NEB 1.1buffer和ddH2O配制50μL酶切反应体系，轻柔混匀后低速离心收集液体与管底，然后置于37℃下恒温孵育3h，然后将酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测，对酶切结果正确的线性化载体进行切胶回收，获得纯化的线性化载体pCXUN-Myc；
(2)取实施例5获得的纯化的OsITAND基因与步骤(1)获得的线性化载体pCXUN-Myc，利用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit进行载体连接，连接反应体系见表5，然后置于37℃条件下处理30min，获得连接反应液；
(3)将连接反应液全部转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布至含有kana抗生素(50mg/mL)LB平板上，37℃下倒置培养过夜至长出单菌落；
(4)挑取单菌落进行菌落PCR检测是否成功转化重组超量表达载体，PCR反应条件同实施例5，检测结果显示已经成功获得了重组超量表达载体ITAND-pCXUN-Myc，然后取菌落PCR验证正确的菌种摇菌提取质粒，利用KpnI和SacI限制性核酸内切酶进行酶切验证，结果发现酶切出5条带，条带大小分别为11230bp、601bp、531bp、200bp以及66bp，其中200bp处包括两条带，分别为203bp和201b；该结果也表明重组工程菌种含有重组超量表达载体ITAND-pCXUN-Myc，综上表明已经成功构建了重组超量表达载体ITAND-pCXUN-Myc并获得了含有该重组超量表达载体的重组大肠杆菌DH5α菌株。
表5连接反应体系
试剂 用量
OsITAND基因(483.7ng/μL) 1μL
线性化载体pCXUN-Myc(113.8ng/μL) 1μL
5×CE II Buffer 4μL
Exnase II 2μL
ddH2O 补充至20μL
实施例7含有重组OsITAND-pCXUN-Myc的重组工程菌的获取
取实施例6得到的含有重组超量表达载体ITAND-pCXUN-Myc的重组大肠杆菌DH5α菌株提取质粒，然后将质粒转化农杆菌EHA105，具体步骤如下：
(1)挑取重组大肠杆菌DH5α菌株接种至含有Kana抗生素(50mg/mL)，37℃下培养过夜获得重组工程菌液，然后利用AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit试剂盒提取重组超量表达载体，调整浓度至100ng/μL，备用；
(2)取保存于-80℃的EHA105农杆菌感受态细胞100μL，置于冰上融化；
(3)向感受态细胞中加入步骤(1)得到的重组超量表达载体1μg，轻轻混匀，依次于冰上静置10min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
(4)转移至超净工作台中并加入500μL LB液体培养基，28℃，220rpm培养2-3h；
(5)吸取步骤(4)得到的菌液100μL涂布于含有50μg/mL Kana和25μg/mL Rif的LB固体平板上，平板吹干后28℃倒置培养2-3d，长出单菌落；
(6)挑取单菌落进行菌落PCR检测，鉴定阳性克隆，鉴定正确的菌株即为重组工程菌，命名为EHA105-ITAND--pCXUN-Myc，然后在重组工程菌菌液中加入15％甘油保存。
实施例8水稻的遗传转化
利用实施例7得到的重组工程菌转化水稻胚性愈伤组织，获得阳性胚性愈伤组织，具体步骤如下：
(1)取灌浆后两周后的野生型粳稻TP309种子，去壳后用70％的乙醇表面消毒5min，然后用0.1％的升汞消毒5min，无菌水冲洗6次以上，在无菌滤纸上晾干，将种子接种到N6-CL培养基上，28℃黑暗培养一周至愈伤组织长至颗粒直径为3mm左右，且颜色鲜黄、质地圆润坚硬、状态良好(图7a)；
(2)选择致密、相对干燥的胚性愈伤组织继续接种到N6-CL培养基上，28℃黑暗培养2-4d，用于后续农杆菌侵染；
(3)挑取实施例7得到的重组工程菌进行活化，然后接种于50μg/mL Kana和25μg/mL Rif的LB液体培养基中，28℃，220rpm过夜培养；
(4)将过夜培养的农杆菌按1：100(V/V)的比例进行扩大培养3-4h直至OD600达到0.5左右，6000rpm离心5min，弃上清，用含有100μmol/L AS的N6-IN培养基重悬菌体，制成农杆菌侵染液，OD600为0.4-0.6；
(5)选取生长状态良好的的愈伤组织，放入灭菌的三角瓶中，倒入适量的农杆菌侵染液，使其没过愈伤组织，侵染15-20min，期间轻摇三角瓶，侵染结束倒掉侵染液，将愈伤组织平铺在灭菌的滤纸上，在超净工作台中干燥1-2h，直至愈伤组织基本干燥；
(6)将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的N6-CO培养基上，28℃培养三天；
(7)培养结束后在超净工作台中将愈伤组织用灭菌的蒸馏水漂洗4次，直至液体透亮，之后用含有200mg/L的特美汀的无菌水漂洗3次，然后放置在无菌滤纸上干燥，最后将晾干的愈伤组织转移到含有200mg/L特美汀和50mg/L潮霉素的N6-SL培养基上，28℃黑暗培养15-20d，一共需要三轮筛选，筛选条件相同；最终得到转基因胚性愈伤组织(图7b)。
实施例9转基因植物的再生
取实施例8获得的转基因性胚性愈伤组织进行植物再生，获得转基因植物，具体步骤如下：
(1)选取实施例8中质地坚硬，颜色米白的颗粒状阳性胚性愈伤组织转移到N6-PS培养基上，28℃黑暗培养10-15d，进行预分化；
(2)将预分化的愈伤组织转入N6-SR培养基上进行分化，28℃，光照12h/d，培养至长出小绿芽(图8a)；
(3)将长出小绿芽的愈伤组织转移到1/2MS-RR培养基上培养，28℃，光照12h/d，直至长出小苗(图8b)；
(4)当小苗长到10cm以上后将小苗在室温下炼苗一周后移栽到大田进行生长，获得转基因水稻。
实施例10转基因植株PCR分子检测
在转基因水稻生长前期，在植株上摘取适量的叶片，提取基因组DNA，通过设计潮霉素抗性基因引物进行PCR检测，同时结合植株表型来判断转基因植株是否为阳性植株，具体步骤如下：
(1)取100mg水稻叶片，利用Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒提取水稻基因组DNA，-20℃保存备用；
(2)根据潮霉素标记基因Hyg，设计Hyg基因的特异性引物，前引物为Hyg-F，序列为SEQ ID NO:14，后引物为Hyg-R，序列为SEQ ID NO:15；
(3)以步骤(1)得到的水稻基因组DNA为模板和步骤(2)设计的引物进行PCR扩增，扩增条件同实施例5，然后用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果发现(图9)在转基因水稻植株中扩增到了Hyg基因，表明该水稻为阳性植株。
实施例11转基因植物中OsITAND基因的表达量分析
分别提取野生型粳稻TP309和经实施例10验证后的转基因水稻的RNA，并反转录成cDNA后，以OsActin为内参基因进行实时荧光定量PCR分析，具体步骤如下：
(1)提取野生型粳稻TP309和转基因水稻的RNA，方法同实施例3，然后反转录获得cDNA，方法同实施例3；
(2)根据水稻OsActin基因序列设计引物，前引物为Actin-F，序列为SEQ ID NO:16，后引物为Actin-R，序列为SEQ ID NO:17；
(3)使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，反应体系见表6，反应程序为95℃预变形30s；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，40个循环。每个样品三个重复，根据2-ΔΔCt计算基因的相对表达量，同t-test方法分析转基因植株与野生型对照之间的显著性差异，其中qPCR引物序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
结果如图10a所示，与野生型TP309中OsITAND基因的表达量相比，转基因植物中OsITAND基因的表达量显著上升，但是转基因植物的不同的植株中的OsITAND基因的表达量并不相同，其中转基因植株O1中的OsITAND基因的表达量最低，与野生型无显著差异，O2和O3中的基因表达量显著高于野生型和O1植株；
同时将实施例10得到的转基因水稻种植于黄花水稻田中，5月播种，6月插秧，进行常规的稻田管理，在水稻分蘖期对转基因水稻进行分蘖角度统计分析，株型结果(图10b)和分蘖角度统计结果(图10c)表明，随着转基因植株中OsITAND基因表达量的升高，水稻的分蘖角越大，植株越分散，因此表明OsITAND可以用于调控水稻的分蘖。

Claims (6)

1. 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：所述OsITAND蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的基因为OsITAND，DNA序列为SEQID NO:1。
2.一种重组超量表达载体在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：所述重组超量表达载体由权利要求1中所述的DNA序列通过KpnI和SacI酶切位点插入pCXUN-Myc重组而成。
3.一种重组工程菌在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：所述重组工程菌由权利要求2中所述的重组超量表达载体转化入宿主菌制备而成。
4.根据权利要求3所述的一种重组工程菌在调控水稻分蘖角度中的应用，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株或农杆菌EHA105菌株。
5.一种超表达转基因水稻植株的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）培养水稻胚性愈伤组织；
（2）采用农杆菌转化法，利用权利要求3-4任一项中所述的重组工程菌侵染步骤（1）得到的水稻胚性愈伤组织；经抗性筛选得到转基因胚性愈伤组织；
（3）诱导步骤（2）得到的转基因胚性愈伤组织分化成小苗，并培养成水稻植株；
（4）对水稻植株进行PCR检测、qPCR检测以及分蘖角度分析，确定为转基因植株；
所述重组工程菌中含有如权利要求2中所述的重组超量表达载体；所述重组超量表达载体含有如权利要求1中所述的OsITAND基因。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于：步骤（2）所述的抗性筛选为Kana抗性筛选和Rif抗性筛选；
步骤（4）所述的qPCR检测的内参基因为OsActin，PCR检测的检测基因为潮霉素抗性标记基因Hyg。
CN202311138746.4A 2023-09-05 2023-09-05 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用 Active CN117304288B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311138746.4A CN117304288B (zh) 2023-09-05 2023-09-05 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311138746.4A CN117304288B (zh) 2023-09-05 2023-09-05 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117304288A CN117304288A (zh) 2023-12-29
CN117304288B true CN117304288B (zh) 2024-04-19

Family

ID=89245352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311138746.4A Active CN117304288B (zh) 2023-09-05 2023-09-05 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117304288B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182524A (zh) * 2006-04-28 2008-05-21 中国农业大学 一种调控水稻分蘖角度的基因及其编码蛋白与应用
CN102180956A (zh) * 2011-04-29 2011-09-14 中国农业科学院作物科学研究所 水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用
CN105273071A (zh) * 2015-12-01 2016-01-27 华南农业大学 OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用
CN106868019A (zh) * 2017-03-16 2017-06-20 周口师范学院 控制水稻分蘖基因OsHT1及其应用
CN107937409A (zh) * 2016-10-10 2018-04-20 华中农业大学 水稻分蘖角度基因tac3的克隆和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182524A (zh) * 2006-04-28 2008-05-21 中国农业大学 一种调控水稻分蘖角度的基因及其编码蛋白与应用
CN102180956A (zh) * 2011-04-29 2011-09-14 中国农业科学院作物科学研究所 水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用
CN105273071A (zh) * 2015-12-01 2016-01-27 华南农业大学 OsRUS1蛋白及其编码基因在控制水稻分蘖角度及分蘖数中的应用
CN107937409A (zh) * 2016-10-10 2018-04-20 华中农业大学 水稻分蘖角度基因tac3的克隆和应用
CN106868019A (zh) * 2017-03-16 2017-06-20 周口师范学院 控制水稻分蘖基因OsHT1及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fine mapping and candidate gene analysis of qTAC8, a major quantitative trait locus controlling tiller angle in rice (Oryza sativa L.);Jiwai He等;《plos one》;20170525;e0178177 *
PREDICTED: Oryza sativa Japonica Group serine/threonine-protein kinase WAG1 (LOC4332276), mRNA;Genbank Database;《Genbank Database》;20180807;Accession No：XM_015773645.1 *
水稻分蘖角度及其调控的生物学研究;董成琼;欧阳由男;刘学;朱练峰;禹盛苗;金千瑜;;中国稻米;20080320(02);全文 *
水稻分蘖角度的QTLs分析;钱前, 何平, 滕胜, 曾大力, 朱立煌;遗传学报;20010110(01);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117304288A (zh) 2023-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107475210B (zh) 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用
WO2023040623A1 (zh) 一种甘蓝型油菜BnHBBD基因定点突变的方法及应用
CN113215172B (zh) 雄性不育基因MsJMT及其应用
CN109609527B (zh) Cdpk18l基因作为负调控因子在提高番茄细菌性叶斑病抗性和高温抗性中的应用
CN112522291B (zh) 水稻OsSH3P2基因及其应用
CN102432679A (zh) 水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用
CN111593058A (zh) Bna-miR169n基因及其在控制甘蓝型油菜抗旱性中的应用
CN113373166B (zh) 烟草NtAAP3基因在烟草中应用
CN108486149B (zh) 一种黄瓜CsWRKY50基因在增强黄瓜霜霉病抗性中的应用
CN111635904B (zh) 一种增强黄瓜靶斑病抗性的基因CsWRKY10及其应用
CN111118028A (zh) 一种白花虎眼万年青矮化多分蘖OtDWARF53基因及应用
CN114134157B (zh) 甘薯IbSAP15基因在调控甘薯叶型与花型中的应用
CN114591984B (zh) OsAP79基因诱导水稻抗褐飞虱的应用
CN117304288B (zh) 一种水稻分蘖角度相关蛋白OsITAND及其编码基因及应用
CN113106115B (zh) 水稻OsPDCD5基因在降低水稻稻米中直链淀粉含量的应用
CN114958866B (zh) 调控大豆分枝数的基因及其用途
CN104293808A (zh) 一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用
CN115011631B (zh) 调控玉米苗期抗旱性的蛋白及其编码基因和应用
CN114807166B (zh) 一种鹅掌楸转录因子LcbHLH02399基因及其表达蛋白和应用
CN113832163B (zh) 有效提高植物果实生物量的方法
CN113403331B (zh) 烟草NtAAP6基因在烟草中应用
CN113215182B (zh) BnaLACS8A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用
CN117363648B (zh) 一种用于调控黍亚科植物分蘖数的SvMOC1基因表达及应用
CN117431256B (zh) 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用
CN109097388B (zh) GmCOP1a和/或GmCOP1b在调控植物株高方面的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant