CN113215182B

CN113215182B - BnaLACS8A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用

Info

Publication number: CN113215182B
Application number: CN202110418835.9A
Authority: CN
Inventors: 谭小力; 金婵玉; 李玉龙; 朱克明; 丁丽娜; 王政; 曹军; 赵静; 薛怡萱; 耿瑞; 李腾
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN113215182A

Abstract

本发明提供了BnaLACS8A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用，属于植物基因工程和生物技术领域；在本发明中，对BnaLACS8A03基因进行了克隆，然后获得了油料作物的RNAi转基因株系，通过对转基因株系叶片中的硫苷含量进行测定，得出能够抑制BnaLACS8A03基因的表达来降低油料作物中的硫甙葡萄糖苷含量，进而改善油料作物的品质。

Description

BnaLACS8A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及BnaLACS8A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用。

背景技术

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）含有丰富的脂肪酸和多种维生素，营养价值高，是我国种植面积最广的油料作物之一。甘蓝型油菜不仅可以生产食用油，还可以用于制造润滑剂、驱虫剂和药品，并且其饼粕富含蛋白质，也可作为动物饲料，是一种具有高经济价值，较大发展潜力的油料作物。由于我国是最主要的菜籽油进口国家，亟需提高油菜的产量和质量。

硫甙葡萄糖苷（简称硫苷）是存在于十字花科植物中的防御化合物，其水解产物是植物防御体系的重要组成成分，可以有效抵抗蚜虫、细菌、真菌和病毒。甘蓝型油菜中，硫苷主要存在于种子中，其降低了种子型蛋白质丰富饲料的营养价值；并且，榨完油的菜籽饼中含有高浓度的硫甙葡萄糖苷，会对动物的健康产生负面影响，出现食欲降低、甲状腺肿大、甲状腺激素水平降低、肝肾功能异常以及其他有害动物生长发育的症状。因此，亟需调控油菜中硫苷的含量来扩大油菜的应用价值。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明提供了BnaLACS8A03基因（长链脂酰辅酶A合成酶基因）在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用。在本发明中，对BnaLACS8A03基因进行了克隆，然后获得了油料作物的RNAi转基因株系，通过对转基因株系叶片中的硫苷含量进行测定，得出能够抑制BnaLACS8A03基因的表达来降低油料作物中的硫甙葡萄糖苷含量，进而改善油料作物的品质。

本发明中首先提供了BnaLACS8A03基因在降低油料作物中的硫甙葡萄糖苷含量的应用，所述BnaLACS8A03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

具体的，通过对BnaLACS8A03基因的沉默或抑制表达来降低硫苷的含量，具体的通过对BnaLACS8A03基因特异性序列片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示）沉默或抑制表达来降低硫苷的含量。

进一步的，所述油料作物为甘蓝型油菜。

本发明还提供所述重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03，所述重组表达载体含有BnaLACS8A03基因的特异性序列片段（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示），本发明中还提供了上述重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03在改善油料作物品质方面的用途。

进一步的，所述改善油料作物品质为降低硫苷含量，提高油料作物榨油后作为动物饲料的营养价值；所指油料作物种类没有特殊限制，优选为甘蓝型油菜。

本发明还提供一种转化体，所述转化体为重组表达载体pHellsgate12- BnaLACS8A03转化宿主细胞获得。

本发明还提供一种改善油料作物品质的方法，具体的，包括：通过构建BnaLACS8A03基因的抑制表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03，并将其转化农杆菌，通过农杆菌侵染油料作物，使得油料作物中硫甙葡萄糖苷的含量显著降低，菜籽饼的营养价值提高，改善了油料作物的品质。

进一步的，所述农杆菌为农杆菌GV3103。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

（1）本发明中所采用的是农杆菌介导的下胚轴转化法转化甘蓝型油菜，可靠性高、速度快、效率高。

（2）本发明利用具有324个油菜种质的自然群体进行关联分析，筛选到了一个可以调控甘蓝型油菜硫甙葡萄糖苷含量的相关基因BnaLACS8A03，其关联度高达17.5%，真实可靠，具有说服力。本发明在油菜中抑制表达BnaLACS8A03基因能降低油菜中硫苷的含量，从而改善油菜的品质。

（3）本发明涉及的基因BnaLACS8A03在改善油料作物品质中的用途，对油菜等油料作物的生产育种等具有重要指导借鉴意义。本发明构建的pHellsgate12-BnaLACS8A03重组载体转化油菜获得的BnaLACS8A03抑制表达株系，为研究BnaLACS8A03基因调控硫苷含量的功能提供了原材料，为改善油料作物品质提供了新的基因源，将有助于培育更优产高质的新品种。

附图说明

图1是候选基因关联分析方法获得甘蓝型油菜硫甙葡萄糖苷相关基因BnaLACS8A03的 Mahattan图。

图2是候选基因关联分析方法获得的BnaLACS8A03基因与其相关病情指数的结果统计。

图3是BnaLACS8A03基因组织表达模式分析结果。

图4是植物转化重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03的构建示意图。

图5是油菜BnaLACS8A03抑制表达株系PCR鉴定结果；图中，1为DL1，000 DNAMarker，7为阳性对照，8为阴性对照，9为空白对照，2、3、4、5、6分别为独立的BnaLACS8A03抑制表达株系。

图6抑制表达BnaLACS8A03转基因植株中BnaLACS8A03的表达量。

图7抑制表达BnaLACS8A03转基因植株中硫甙葡萄糖苷的含量。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1 ：BnaLACS8A03基因的获得

本实施例从收集的324份甘蓝型油菜（由中国农业科学院油料作物研究所提供）构成自然群体，对每个材料进行约7×重测序，并与参考油菜Darmor-bzh的基因组（主要登录号： https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/，CCCW000000000））来获得基因型数据。材料于2015年种植于武汉阳逻试验基地，随机区组三个重复，每个小区种植3行，于次年成熟时进行发病率与病情指数调查，获得表型数据。根据候选基因关联分析结果（图1、图2）表明，基因BnaA03g57930D（登录号：XM_013801627）与硫苷含量（GLS）显著相关，贡献率高达17.5%。因此确定BnaA03g57930D为甘蓝型油菜硫苷含量显著相关的基因，由于甘蓝型油菜中双11号经过全基因组测序的，可以获得目的基因的参考序列，便于设计引物以及克隆，选用双11号种子购于武汉中油种业科技有限公司）克隆此基因并研究其功能，将克隆到的基因命名为BnaLACS8A03，具体步骤如下：

（1）植物材料培养：

以甘蓝型油菜中双11号植株（种子购于武汉中油种业科技有限公司，由本实验室种植）作为实验材料，生长条件为：温度为20±2℃；湿度为60-90%；每天光周期为光照8h黑暗16h；光照强度为44 µmol m^-2 s^-1。

（2）油菜总RNA的提取以及cDNA合成：

采用Trizol试剂快速提取法提取油菜总RNA：取少量组织用液氮迅速充分，直至呈粉末状，之后加入1mL预冷的Trizol，充分混合后冰上静置10min，4℃，12，000r/min离心10分钟；取约800µL此上清加入300µL氯仿并剧烈震荡，4℃，12，000r/min离心10分钟；取上清加入等体积异丙醇轻摇，4℃，12，000r/min离心10min；弃上清加入75%乙醇充分洗涤，4℃，12，000r/min离心5min；弃上清，干燥沉淀，加入DEPC水溶解，-70℃保存备用。

cDNA合成是以总RNA为模板，采用反转录试剂盒（HiScript^® Q RT SuperMix forQ-PCR，购于南京诺唯赞生物技术有限公司）说明书进行反转录合成第一链。反应体系为：4×gDNA wiper Mix 4µL；RNA 模板；RNase-free 补全至16µL，42℃ 2min。然后，第一步反应液16µL；5×HiScript Ⅲ qRT Mix 4µL，50℃ 15min, 85℃ 2min。

（3）BnaLACS8A03基因 cDNA序列克隆：

根据BnaA03g57930D序列设计引物进行克隆，扩增BnaLACS8A03的引物序列分别为：

BnLACS8-1 For XbaI（SEQ.ID.N0.4）：

5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAAGATCCTCCAATGGCTTC-3'（TCTAGA为XbaI的酶切位点）

和BnLACS8-1 Rev SacI（SEQ.ID.N0.5）：

5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGGCATATAGCTTGTGGAGTTCATC-3'。（GAGCTC为SacI的酶切位点）

引物由上海生工公司合成，以甘蓝型油菜中双11号的cDNA为模板，使用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo（东洋纺（上海）生物科技有限公司）进行目的片段扩增，采用胶回收试剂盒E.Z.N.A.^®Gel Extraction Kit（购于Omega Bio-Tek公司）从琼脂糖凝胶中回收扩增产物，并将产物连接到经过XbaI和SacI（所用酶为NEB公司）酶切回收后的空质粒PBI121（购自上海柯雷生物技术有限公司）上从而构建成为PBI121-BnaLACS8A03载体，之后转化进大肠杆菌DH5a感受态细胞（购于南京诺唯赞生物技术有限公司），并将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经测序验证，本实施例获得了目的基因，记为BnaLACS8A03，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。

SEQ ID N0.1：

atggaagatc ctccaatggc ttcatcgttt ctggagaatt ccaaaatcag cgagtacggactctccacga tcgtagcagg cggagtcgcc gctctactag taccggttct cctctccgtc gtcttaaccggaaccaaaaa ggggaagaag agaggcgttc cggtgaaagt aggcggcgag gaaggctacg cgatgcgtcacgccagaggt cccgatctcg tcgacgttcc ttggccagga gccacgacta tggccgcttt gttcgagcaggcttgcaaga agtactcgag caaccggttg ctcgggacta gggagtttat agacaaggag atcgttacgtctagtgacgg aaggaagttc gagaagcttc atctcgggga gtatcggtgg cagagctatg gagaggtctttgaacgtgtt tgcaactttg cgtctgggct tgttggtgtt ggacataacg ttgatacacg tgtcgctatattttctgata ctcgagctga gtggtttatc gcgtttcagg ggtgttttag gcagaacttg actgttgtgactatctatgc ttctttggga gaggaggctt tgatttactc actcaatgag actcaagtgt cgaccctgatatgcgactca aagcaactca agaagttgtc tgcgatacaa tcaagcttga agactgtgaa gaacattatttacattgaag aagatggagt tgaggttgct tctagtgagg tgaatggtct tggtgatata acggtttcgtccatctctga agttgagaaa ctggggaagg agagacctgt tgagccgagc tttccttcca agaatggagttgcggttata atgtttacaa gtggtagtac cggtctacca aagggagtta tgattaccca cgggaatctaatcgcaactg ctgcaggagt tatgaaggtg attccaaagc tgaataagaa tgatgtgtat attgcatatttacctttggc gcatgtgttt gagctggaag ctgagattgt ggtctttaca tggggtagtg ccatcggttatggctcagca atgactttaa ctgacacttc aaataaagtt aagaaaggaa ccaaaggaga tgtttcagttcttaacccaa ctctcatgac tgcagttcca gctattctgg atcgcgtccg tgatggagtt ctaaaaaaggttgaggaaaa gggaggcatg gcgaagactc tctttaactt tgcatacaat cgccggttag cagctgtgaacggaagttgg tttggtgcct ggggtttgga gaaaatgttt tgggacactc tagtcttcac aaaaatacgcgctgtgcttg gtggacgcat ccgatttatg ctcgttggag gggctcctct gtctcctgat tcgcaacgcttcatcaatat ctgcatgggg tctcccatcg gtcaaggata tggattaact gaaacgtgtg ctggagctacgttttctgag tgggacgatc ctactgctgg acgcgtggga ccaccacttc catgcggtta cattaagcttgtttcttggg aagaaggtgg ctatagagtt tcagacaaac caatgcctcg gggggagatt gtggtaggtggtaacagtgt aacagcaggt tacttcaaca atcaagaaaa aacagatgag gtttacaagg ttgatgagaatggcacgagg tggttttaca caggagacat tgggagattc caccctgatg gatgtcttga agttattgacagaaagaaag atatcgttaa acttcaacac ggggaatatg tatcccttgg aaaggtggag gcagctttgggttcaagtaa ttacgttgac aacattatgg tacacgcaga cccaatgaac agctactgtg tagctcttgttgtaccatca cacggagcat tagagaaatg ggcagaggaa gcaggcgtta aatccagcga cttctctgagctatgtgaga acggtgaagc agtcaaggag gttcagcaat ctcttatcaa ggcagcaaag acggcaaagctagaaaagtt tgagatccca gcaaagataa agttattgcc ggagcagtgg acaccagagt cggggctagtcacagctgct ctcaagttaa agagggagca aataaaggcc aagttcaaag atgaactcca caagctatatgcctaa

SEQ ID N0.2：

MEDPPMASSFLENSKISEYGLSTIVAGGVAALLVPVLLSVVLTGTKKGKKRGVPVKVGGEEGYAMRHARGPDLVDVPWPGATTMAALFEQACKKYSSNRLLGTREFIDKEIVTSSDGRKFEKLHLGEYRWQSYGEVFERVCNFASGLVGVGHNVDTRVAIFSDTRAEWFIAFQGCFRQNLTVVTIYASLGEEALIYSLNETQVSTLICDSKQLKKLSAIQSSLKTVKNIIYIEEDGVEVASSEVNGLGDITVSSISEVEKLGKERPVEPSFPSKNGVAVIMFTSGSTGLPKGVMITHGNLIATAAGVMKVIPKLNKNDVYIAYLPLAHVFELEAEIVVFTWGSAIGYGSAMTLTDTSNKVKKGTKGDVSVLNPTLMTAVPAILDRVRDGVLKKVEEKGGMAKTLFNFAYNRRLAAVNGSWFGAWGLEKMFWDTLVFTKIRAVLGGRIRFMLVGGAPLSPDSQRFINICMGSPIGQGYGLTETCAGATFSEWDDPTAGRVGPPLPCGYIKLVSWEEGGYRVSDKPMPRGEIVVGGNSVTAGYFNNQEKTDEVYKVDENGTRWFYTGDIGRFHPDGCLEVIDRKKDIVKLQHGEYVSLGKVEAALGSSNYVDNIMVHADPMNSYCVALVVPSHGALEKWAEEAGVKSSDFSELCENGEAVKEVQQSLIKAAKTAKLEKFEIPAKIKLLPEQW TPESGLVTAA LKLKREQIKA KFKDELHKLYA

实施例2：BnaLACS8A03基因的表达模式

为了探究基因BnaLACS8A03在甘蓝型油菜各组织中的差异表达，采用qRT-PCR技术检测了BnaLACS8A03在甘蓝型油菜根、茎、茎尖、叶、花、花蕾、幼嫩的角果、成熟的角果中的表达模式，本实施例中用的植株材料为甘蓝型油菜中双11号，采集各个组织新鲜材料立即用液氮冷冻，并存于-70℃超低温冰箱备用。按照实施例1中的方法获得油菜各个组织的RNA以及合成cDNA。

根据BnaLACS8A03基因序列的非保守区设计实时荧光定量PCR引物，引物序列为：

Q1F-LACS8（SEQ.ID.NO.6）：5'-GCCAGGAGCCACGACTA-3'

和Q1R-LACS8（SEQ.ID.NO.7）：5'-ACCAACAAGCCCAGACG-3'，

选取甘蓝型油Actin基因（GenBank：AF111812.1）作为内参基因，内参引物序列为：

Actin-QF ： 5' -TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC- 3'

和Actin-QR：5'- GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3'。

以反转录第一条链cDNA为模板，具体操作方法根据AceQ^® QpcrSYBR^® GreenMaster Mix试剂盒说明书进行，体系为：AceQ qPCR SYBR Mix 10µL；上游引物0.4µL；下游引物0.4µL；Rox Reference Dye2 0.4µL；cDNA模板2µL；ddH₂O 6.8µL，实验数据采用GraphPad Prism 7软件进行作图。

图3 是BnaLACS8A03基因组织表达模式分析结果，从图3 中可以看出，以油菜根的表达量作为对照，BnaLACS8A03在叶和花中的表达量最高，约是根中表达量的3-4倍，这些结果显示BnaLACS8A03在油菜不同组织器官中均有表达，且在花和叶中表达量最高，此结果为后续BnaLACS8A03的研究提供理论基础。

实施例3：构建BnaLACS8A03抑制表达转基因油菜植株

（1）BnaLACS8A03抑制表达载体构建

比对甘蓝型油菜BnaLACS8A03及其同源序列，筛选出特异序列如SEQ.ID. NO.3所示。

SEQ.ID. NO.3：

TCAGACAAACCAATGCCTCGGGGGGAGATTGTGGTAGGTGGTAACAGTGTAACAGCAGGTTACTTCAACAATCAAGAAAAAACAGATGAGGTTTACAAGGTTGATGAGAATGGCACGAGGTGGTTTTACACAGGAGACATTGGGAGATTCCACCCTGATGGATGTCTTGAAGTTATTGACAGAAAGAAAGATATCGTTAAACTTCAACACGGGGAATATGTATCCCTTGGAAAGGTGGAGGCAGCTTTGGGTTCAAGTAATTACGTTGACAACATTATGGTACACGCAGACCCA

本研究实例运用Gateway的方法，在上游引物的5’加上CACC，引物序列使用软件Primer Premier 5设计，如下所示：

RNAi F（SEQ.ID.NO.8）：5'-CACCTCAGACAAACCAATGCCTCG-3'

RNAi R（SEQ.ID NO.9）：5'-TGGGTCTGCGTGTACCATA-3'，

利用高保真酶（东洋纺（上海）生物科技有限公司）扩增特异性片段，将其胶回收产物与PENTR Vector（试剂盒订购于赛默飞公司）进行连接，具体体系为：胶回收产物（按浓度添加，与pENTR载体的摩尔比为2：1），pENTR Vector 0.5µL；Salt solution 0.5µL；ddH₂O补全至3µL，22℃ 2h30min。将连接产物转化DH5α感受态细胞（购于南京诺唯赞生物技术有限公司），并提取质粒，获得中间载体PENTR-BnaLACS8A03。将得到的中间载体质粒PENTR- BnaLACS8A03作为模板，与终载体pHellsgate12（来自澳大利亚 CSIRO（http：//www.pi.csiro.au/rnai/vectors.htm））进行LR重组反应，具体体系为：中间载体质粒（按浓度添加，与终载体pHellsgate12的质量比为1：1~10µL；终载体pHellsgate12（300ng） 2µL；5×LR clonase^TM 4µL；TE Buffer补全至16µL）之后转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞（购于南京诺唯赞生物技术有限公司），并将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经测序获得了目的重组载体pHellsgate12-BnaLACS8A03（图4 ），并提取质粒。将重组载体转化到农杆菌GV3101感受态细胞（购于上海尚亚生物技术有限公司）中，选取阳性克隆保菌于-70 ℃冰箱，以备后用。

（2）使用重组质粒pHellsgate12-BnaLACS8A03进行油菜的遗传转化：

种子消毒以及播种：精选甘蓝型油菜K407的种子(来自陕西省杂交油菜研究中心的油菜分子育种实验室)，去除霉变、破粒、带菌的种子及杂质；75%酒精浸泡种子30s，倒掉酒精后加入10ml浓度为15%的bleach溶液（8.115ml ddH₂O, 1.875ml 次氯酸钠溶液，10µlTritanx-100），消毒15min；无菌水冲洗4-5遍。将消毒后的种子播种到播种培养基（1L培养基成分：2.21gMS, 20g蔗糖, 8g琼脂粉）上，每瓶播15-20粒，然后置于无菌培养间中，25℃暗培养5-6 天。

农杆菌的活化和制备：挑取保存的含有重组质粒的农杆菌GV3101在平板上划线活化，28℃下培养2天，然后挑取阳性单菌落接种到3-5mL含有Kan抗性（30mg/mL）的LB液体培养基中(1L培养基成分：Yeast extract 5g; 蛋白胨 10g; 氯化钠 10g )，于28℃、220r/min震荡培养36h-48h。再按1%接种量接种到100mL含有Kan抗性的LB液体培养基中，至菌液终浓度为约0.8左右。将培养好的菌液吸入2mL于离心管中，5，000r/min离心5-10min，倒掉上清液，用等体积DM液体播种培养基（1L培养基成分：4.42g MS粉，30g蔗糖）重悬，离心，弃上清，再用相同体积DM重悬，取2mL菌液用18mL的DM培养基稀释，以作为侵染液备用。

外植体的制备与侵染：用镊子和解剖刀切取5-6段幼苗下胚轴，长度约为0.8-1cm，切外植体时尽量45度斜切，在M1液体培养基（1L培养基成分：4.42g MS粉，30g蔗糖，18g甘露醇）中切取效果更佳。将切好的外植体放到已配好的侵染液中，侵染20min（时间不能长，否则外植体易死亡），期间摇晃4-6次，侵染以每皿80-100个外植体/20mL菌液较合适。

侵染结束后，滤纸尽量吸去菌液，下胚轴转到M1基础培养基上（1L培养基成分：4.42g MS粉，30g蔗糖，18g甘露醇，8g琼脂粉），每皿20个，25℃暗培养2天。2天后转到M2筛选培养基上（1L培养基成分：4.42g MS粉，30g蔗糖，18g甘露醇，8g琼脂糖, 且含有1.6ml Kan抗生素（30mg/mL）），25℃光照培养（昼16h/夜8h）；3周后转到M3出芽培养基（1L培养基成分：4.42g MS，10g葡萄糖，0.25g木糖，0.6g乙磺酸，8g 琼脂粉且含有1.6ml Kan抗生素（30mg/mL））上，每2-3周继代一次，直至绿芽；转入M4生根培养基（1L培养基成分：3.86g B5培养基，20g蔗糖，6g琼脂粉）进行生根，之后放入低温春化培养箱培养2-4周；春化完成后，移栽至营养钵，放入人工气候室培养，直至收获。

（3）抑制表达BnaLACS8A03转基因油菜植株PCR鉴定：

选取5株油菜分别进行编号（#1、#2、#3、#4、#5）为提取叶片的基因组，采用PCR技术进行鉴定。使用软件Primer Premier 5设计鉴定引物序列为：

RNAi F（SEQ.ID.NO.8）：5'-CACCTCAGACAAACCAATGCCTCG-3'

R（SEQ.ID.NO.10）：5'-CTAACAGAACTCGCCGTGAAGACT-3'

阴性对照为野生型油菜K407（WT），阳性对照为含有该基因的质粒pHellsgate12- BnaLACS8A03，空白对照为H₂O。

图5 是油菜BnaLACS8A03抑制表达株系PCR鉴定结果；图中，1为规格1000bp大小的指示条带DL1，000 DNA Marker，7为阳性对照，8为阴性对照，9为空白对照，2、3、4、5、6分别为独立的BnaLACS8A03抑制表达株系。检测结果表明，本实施例中#2、#4、#5和阳性对照均能够扩增出预期特异序列大小的电泳条带848bp，#1、#3号未扩出条带，是非阳性植株；而阴性对照和空白对照中则没有电泳条带，将条带大体系扩增后测序，测序结果与目的基因序列一致，表明转基因油菜基因组中已经含有目的基因片段。

实施例4：检测BnaLACS8A03转基因油菜植株中的硫苷含量

（1）转基因油菜植株中基因表达量的鉴定：

为了探究基因BnaLACS8A03在阳性植株#2、#4、#5中的表达量是否得到了抑制，采用qRT-PCR技术检测了BnaLACS8A03基因在#2、#4、#5号转基因植株，以及野生型甘蓝型油菜K407中的表达量，具体包括如下方式：

采集各个植株的新鲜叶片立即用液氮冷冻，并存于-70℃超低温冰箱备用。按照实施例1中的方法获得转基因及野生型油菜叶片组织的RNA以及合成cDNA。引物序列为：

Q1F-LACS8（SEQ.ID.NO.6）：5'-GCCAGGAGCCACGACTA-3'

和Q1R-LACS8（SEQ.ID.NO.7）：5'-ACCAACAAGCCCAGACG-3'，并将得到的基因表达量数据绘图。

图6 抑制表达BnaLACS8A03转基因植株中BnaLACS8A03的表达量，从图中可以看出，以野生型甘蓝型油菜叶片的表达量作为对照，BnaLACS8A03基因在转基因植株中的表达量虽有差异，但不足野生型油菜的1/10。这些结果显示转基因植株中BnaLACS8A03基因成功得到了抑制，此结果为后续BnaLACS8A03的应用提供了材料基础。

（2）抑制表达BnaLACS8A03基因转基因油菜叶片中的硫苷含量测定：

将培育出的阳性植株#2、#4、#5号进行留种，挑选T2代部分子代植株，分别命名为2-1、2-2、2-3、4-1、4-2、4-3、5-1进行PCR鉴定以及Q-PCR鉴定后，将植株叶片送去陕西省杂交油菜研究中心进行硫苷含量测定，数据结果采用GraphPad Prism 7软件进行作图。

图7抑制表达BnaLACS8A03转基因植株中硫甙葡萄糖苷的含量，结果显示，转基因油菜硫苷含量是野生型油菜的硫苷含量是的80%-16%。由此可知，BnaLACS8A03基因显著降低了甘蓝型油菜中的硫苷含量，有望通过调控BnaLACS8A03来改变油料作物中硫甙葡萄糖苷的含量从而改善油料作物的品质。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏大学

<120> BnaLACS8.A03基因在调节油菜中硫甙葡萄糖苷含量的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2166

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 1

atggaagatc ctccaatggc ttcatcgttt ctggagaatt ccaaaatcag cgagtacgga 60

ctctccacga tcgtagcagg cggagtcgcc gctctactag taccggttct cctctccgtc 120

gtcttaaccg gaaccaaaaa ggggaagaag agaggcgttc cggtgaaagt aggcggcgag 180

gaaggctacg cgatgcgtca cgccagaggt cccgatctcg tcgacgttcc ttggccagga 240

gccacgacta tggccgcttt gttcgagcag gcttgcaaga agtactcgag caaccggttg 300

ctcgggacta gggagtttat agacaaggag atcgttacgt ctagtgacgg aaggaagttc 360

gagaagcttc atctcgggga gtatcggtgg cagagctatg gagaggtctt tgaacgtgtt 420

tgcaactttg cgtctgggct tgttggtgtt ggacataacg ttgatacacg tgtcgctata 480

ttttctgata ctcgagctga gtggtttatc gcgtttcagg ggtgttttag gcagaacttg 540

actgttgtga ctatctatgc ttctttggga gaggaggctt tgatttactc actcaatgag 600

actcaagtgt cgaccctgat atgcgactca aagcaactca agaagttgtc tgcgatacaa 660

tcaagcttga agactgtgaa gaacattatt tacattgaag aagatggagt tgaggttgct 720

tctagtgagg tgaatggtct tggtgatata acggtttcgt ccatctctga agttgagaaa 780

ctggggaagg agagacctgt tgagccgagc tttccttcca agaatggagt tgcggttata 840

atgtttacaa gtggtagtac cggtctacca aagggagtta tgattaccca cgggaatcta 900

atcgcaactg ctgcaggagt tatgaaggtg attccaaagc tgaataagaa tgatgtgtat 960

attgcatatt tacctttggc gcatgtgttt gagctggaag ctgagattgt ggtctttaca 1020

tggggtagtg ccatcggtta tggctcagca atgactttaa ctgacacttc aaataaagtt 1080

aagaaaggaa ccaaaggaga tgtttcagtt cttaacccaa ctctcatgac tgcagttcca 1140

gctattctgg atcgcgtccg tgatggagtt ctaaaaaagg ttgaggaaaa gggaggcatg 1200

gcgaagactc tctttaactt tgcatacaat cgccggttag cagctgtgaa cggaagttgg 1260

tttggtgcct ggggtttgga gaaaatgttt tgggacactc tagtcttcac aaaaatacgc 1320

gctgtgcttg gtggacgcat ccgatttatg ctcgttggag gggctcctct gtctcctgat 1380

tcgcaacgct tcatcaatat ctgcatgggg tctcccatcg gtcaaggata tggattaact 1440

gaaacgtgtg ctggagctac gttttctgag tgggacgatc ctactgctgg acgcgtggga 1500

ccaccacttc catgcggtta cattaagctt gtttcttggg aagaaggtgg ctatagagtt 1560

tcagacaaac caatgcctcg gggggagatt gtggtaggtg gtaacagtgt aacagcaggt 1620

tacttcaaca atcaagaaaa aacagatgag gtttacaagg ttgatgagaa tggcacgagg 1680

tggttttaca caggagacat tgggagattc caccctgatg gatgtcttga agttattgac 1740

agaaagaaag atatcgttaa acttcaacac ggggaatatg tatcccttgg aaaggtggag 1800

gcagctttgg gttcaagtaa ttacgttgac aacattatgg tacacgcaga cccaatgaac 1860

agctactgtg tagctcttgt tgtaccatca cacggagcat tagagaaatg ggcagaggaa 1920

gcaggcgtta aatccagcga cttctctgag ctatgtgaga acggtgaagc agtcaaggag 1980

gttcagcaat ctcttatcaa ggcagcaaag acggcaaagc tagaaaagtt tgagatccca 2040

gcaaagataa agttattgcc ggagcagtgg acaccagagt cggggctagt cacagctgct 2100

ctcaagttaa agagggagca aataaaggcc aagttcaaag atgaactcca caagctatat 2160

gcctaa 2166

<210> 2

<211> 721

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 2

Met Glu Asp Pro Pro Met Ala Ser Ser Phe Leu Glu Asn Ser Lys Ile

1 5 10 15

Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Thr Ile Val Ala Gly Gly Val Ala Ala Leu

20 25 30

Leu Val Pro Val Leu Leu Ser Val Val Leu Thr Gly Thr Lys Lys Gly

35 40 45

Lys Lys Arg Gly Val Pro Val Lys Val Gly Gly Glu Glu Gly Tyr Ala

50 55 60

Met Arg His Ala Arg Gly Pro Asp Leu Val Asp Val Pro Trp Pro Gly

65 70 75 80

Ala Thr Thr Met Ala Ala Leu Phe Glu Gln Ala Cys Lys Lys Tyr Ser

85 90 95

Ser Asn Arg Leu Leu Gly Thr Arg Glu Phe Ile Asp Lys Glu Ile Val

100 105 110

Thr Ser Ser Asp Gly Arg Lys Phe Glu Lys Leu His Leu Gly Glu Tyr

115 120 125

Arg Trp Gln Ser Tyr Gly Glu Val Phe Glu Arg Val Cys Asn Phe Ala

130 135 140

Ser Gly Leu Val Gly Val Gly His Asn Val Asp Thr Arg Val Ala Ile

145 150 155 160

Phe Ser Asp Thr Arg Ala Glu Trp Phe Ile Ala Phe Gln Gly Cys Phe

165 170 175

Arg Gln Asn Leu Thr Val Val Thr Ile Tyr Ala Ser Leu Gly Glu Glu

180 185 190

Ala Leu Ile Tyr Ser Leu Asn Glu Thr Gln Val Ser Thr Leu Ile Cys

195 200 205

Asp Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Ser Ala Ile Gln Ser Ser Leu Lys

210 215 220

Thr Val Lys Asn Ile Ile Tyr Ile Glu Glu Asp Gly Val Glu Val Ala

225 230 235 240

Ser Ser Glu Val Asn Gly Leu Gly Asp Ile Thr Val Ser Ser Ile Ser

245 250 255

Glu Val Glu Lys Leu Gly Lys Glu Arg Pro Val Glu Pro Ser Phe Pro

260 265 270

Ser Lys Asn Gly Val Ala Val Ile Met Phe Thr Ser Gly Ser Thr Gly

275 280 285

Leu Pro Lys Gly Val Met Ile Thr His Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ala

290 295 300

Ala Gly Val Met Lys Val Ile Pro Lys Leu Asn Lys Asn Asp Val Tyr

305 310 315 320

Ile Ala Tyr Leu Pro Leu Ala His Val Phe Glu Leu Glu Ala Glu Ile

325 330 335

Val Val Phe Thr Trp Gly Ser Ala Ile Gly Tyr Gly Ser Ala Met Thr

340 345 350

Leu Thr Asp Thr Ser Asn Lys Val Lys Lys Gly Thr Lys Gly Asp Val

355 360 365

Ser Val Leu Asn Pro Thr Leu Met Thr Ala Val Pro Ala Ile Leu Asp

370 375 380

Arg Val Arg Asp Gly Val Leu Lys Lys Val Glu Glu Lys Gly Gly Met

385 390 395 400

Ala Lys Thr Leu Phe Asn Phe Ala Tyr Asn Arg Arg Leu Ala Ala Val

405 410 415

Asn Gly Ser Trp Phe Gly Ala Trp Gly Leu Glu Lys Met Phe Trp Asp

420 425 430

Thr Leu Val Phe Thr Lys Ile Arg Ala Val Leu Gly Gly Arg Ile Arg

435 440 445

Phe Met Leu Val Gly Gly Ala Pro Leu Ser Pro Asp Ser Gln Arg Phe

450 455 460

Ile Asn Ile Cys Met Gly Ser Pro Ile Gly Gln Gly Tyr Gly Leu Thr

465 470 475 480

Glu Thr Cys Ala Gly Ala Thr Phe Ser Glu Trp Asp Asp Pro Thr Ala

485 490 495

Gly Arg Val Gly Pro Pro Leu Pro Cys Gly Tyr Ile Lys Leu Val Ser

500 505 510

Trp Glu Glu Gly Gly Tyr Arg Val Ser Asp Lys Pro Met Pro Arg Gly

515 520 525

Glu Ile Val Val Gly Gly Asn Ser Val Thr Ala Gly Tyr Phe Asn Asn

530 535 540

Gln Glu Lys Thr Asp Glu Val Tyr Lys Val Asp Glu Asn Gly Thr Arg

545 550 555 560

Trp Phe Tyr Thr Gly Asp Ile Gly Arg Phe His Pro Asp Gly Cys Leu

565 570 575

Glu Val Ile Asp Arg Lys Lys Asp Ile Val Lys Leu Gln His Gly Glu

580 585 590

Tyr Val Ser Leu Gly Lys Val Glu Ala Ala Leu Gly Ser Ser Asn Tyr

595 600 605

Val Asp Asn Ile Met Val His Ala Asp Pro Met Asn Ser Tyr Cys Val

610 615 620

Ala Leu Val Val Pro Ser His Gly Ala Leu Glu Lys Trp Ala Glu Glu

625 630 635 640

Ala Gly Val Lys Ser Ser Asp Phe Ser Glu Leu Cys Glu Asn Gly Glu

645 650 655

Ala Val Lys Glu Val Gln Gln Ser Leu Ile Lys Ala Ala Lys Thr Ala

660 665 670

Lys Leu Glu Lys Phe Glu Ile Pro Ala Lys Ile Lys Leu Leu Pro Glu

675 680 685

Gln Trp Thr Pro Glu Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Leu Lys Leu Lys

690 695 700

Arg Glu Gln Ile Lys Ala Lys Phe Lys Asp Glu Leu His Lys Leu Tyr

705 710 715 720

Ala

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<400> 3

tcagacaaac caatgcctcg gggggagatt gtggtaggtg gtaacagtgt aacagcaggt 60

tacttcaaca atcaagaaaa aacagatgag gtttacaagg ttgatgagaa tggcacgagg 120

tggttttaca caggagacat tgggagattc caccctgatg gatgtcttga agttattgac 180

agaaagaaag atatcgttaa acttcaacac ggggaatatg tatcccttgg aaaggtggag 240

gcagctttgg gttcaagtaa ttacgttgac aacattatgg tacacgcaga ccca 294

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagaacacgg gggactctag aatggaagat cctccaatgg cttc 44

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgatcgggga aattcgagct cttaggcata tagcttgtgg agttcatc 48

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccaggagcc acgacta 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accaacaagc ccagacg 17

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacctcagac aaaccaatgc ctcg 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgggtctgcg tgtaccata 19

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctaacagaac tcgccgtgaa gact 24

Claims

1.BnaLACS8A03基因在调控油料作物中的硫甙葡萄糖苷含量的应用，所述BnaLACS8A03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；调控所述基因能改变油料作物中的硫甙葡萄糖苷含量；通过对BnaLACS8A03基因特异性序列片段沉默或抑制表达来降低硫苷的含量，所述特异性序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示

所述油料作物为甘蓝型油菜。

2.一种重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03，其特征在于，所述重组表达载体含有BnaLACS8A03基因中核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的特异性序列片段。

3.权利要求2所述重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03在改善油料作物品质方面的用途；所述油料作物为甘蓝型油菜。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述改善油料作物品质为降低硫苷含量，提高油料作物榨油后作为饲料的营养价值。

5.一种农杆菌细胞的转化体，其特征在于，所述转化体为权利要求2重组表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03转化宿主细胞获得。

6.一种改善油料作物品质的方法，其特征在于，包括：构建如权利要求3所述的BnaLACS8A03基因的抑制表达载体pHellsgate12-BnaLACS8A03，通过权利要求5所获的农杆菌侵染油料作物，降低甘蓝型油菜中硫甙葡萄糖苷的含量；所述BnaLACS8A03基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。