CN110760526A

CN110760526A - 甜橙CsMYB120基因及其应用

Info

Publication number: CN110760526A
Application number: CN201911165875.6A
Authority: CN
Inventors: 张金智; 胡春根; 侯小进
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-02-07
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110760526B

Abstract

本发明公开了供甜橙CsMYB120基因及其应用。本发明分离到甜橙1R‑MYB基因家族中的一个成员CsMYB120基因，其基因组DNA和cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，序列长度分别为2181bp和1485bp，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为494aa。将CsMYB120的基因组超表达拟南芥后，可促进拟南芥提前开花。本发明的CsMYB120基因明显缩短了植物的营养生长期，进一步可为柑橘品种的遗传改良提供了新的基因资源。

Description

甜橙CsMYB120基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及甜橙CsMYB120基因及其应用。

背景技术

植物的开花是植物生殖生长最为重要的一个环节，花的发育需要许多基因的参与，在合适的时间和空间下精准表达形成的一个复杂的生物学过程。而转录因子在调控植物发育过程具有普遍性。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育的各个环节都发挥重要作用。随着花发育的关键基因及调节机理的深入研究，越来越多的研究表明MYB转录因子参与植物花发育的过程。

植物花发育的过程分为3个阶段；开花诱导、花的启动和花器官的形成。MYB转录因子功能广泛，在这3个阶段都有不同转录因子的参与。两个1R-MYB转录因子LHY和CCA1是植物中维持生物钟中连锁负向调节环中的重要因子(Niwa et al 2007)，产生正常的昼夜节律，并将光信号进行整合传递给输出基因GI。它们的突变导致整个生物钟节律的改变，从而影响植物的开花时间。有些R2R3-MYB转录因子也参与果实或花的颜色的调控，分离了梨中的PyMYB114(Yao et al 2017)、芹菜OjMYB1(Feng et al 2018)、猕猴桃AcMYB75(Li et al2017)和苹果中的MdMYB3(Vimolmangkang et al 2013)参与花青素的生物合成途径中，从而影响果实和花中花青素的积累。MYB转录因子在花粉和花药的发育上有重要作用，如R2R3-MYB转录因子AtMYB80和棉花中GhMYB80突变或抑制该基因的表达后，在花药发育的后期小孢子会发生降解，最终导致雄性不育(Phan et al 2012,Xu et al 2014)；AtMYB33和AtMYB65的双突变体会有花药发育的缺陷(Millar and Gubler 2005)；AtMYB21和AtMYB24缺失突变体中，花药开裂延迟、花粉成熟晚，双突变体会更加明显，最终导致雄性不育(Cheng et al 2009,Song et al 2011)。

柑橘是我国南方重要的果树，且在亚热带地区的国家均有栽培。柑橘一般需要经历较长时间的童期才能开花结实，部分柑橘的童期长达10年。如能发掘调控柑橘提前开花的关键基因，则可缩短植物营养生长期，对于加快多年生木本果树的育种和遗传改良将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供甜橙CsMYB120基因及其应用。

本发明分离到甜橙1R-MYB基因家族中的一个成员CsMYB120基因，基因组DNA和cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，序列长度分别为2181bp和1485bp，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为494aa。

采用Real-time PCR检测了CsMYB120基因在甜橙不同组织根、茎、叶、花和果及花不同部位(萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊)中表达量，发现CsMYB120基因为组成型表达，但在营养器官中表达高于生殖器官，表明CsMYB120参与对植物营养生长和生殖生长的调控。

同时采用Real-time PCR又检测了在不同激素(PP333、NAA、GA和ABA)处理下，CsMYB120基因在花芽分化中的表达模式。结果发现CsMYB120在花芽分化的后期表达量很高，PP333和GA的处理明较对照明显增加CsMYB120在花芽分化的后期的表达量，NAA的处理却没有明显变化，ABA处理后明显降低CsMYB120在花芽分化的后期的表达水平，任何激素的处理在前期阶段都不促进CsMYB120的表达，表明CsMYB120通过响应激素特异性地在后期(S5阶段)进行调控柑橘的花芽分化。

CsMYB120的基因组DNA在拟南芥中超表达后均可明显使植物提前开花。因此申请人获得了可使植物早花的超表达重组载体pBI121+CsMYB120，所构建的载体含有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，同时还获得了CsMYB120超表达的转基因植株。

因此，本发明的第一个目的是提供甜橙CsMYB120基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供所述的甜橙CsMYB120基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明还提供含有所述的甜橙CsMYB120基因的表达载体。

优选，所述的表达载体为重组表达载体pBI121+CsMYB120，是用内切酶BamH I和Sac I酶切载体pBI121和上下游含有内切酶BamH I和Sac I位点的甜橙CsMYB120基因，再进行连接反应，使甜橙CsMYB120基因插入到酶切位点BamH I和Sac I之间，得到重组表达载体pBI121+CsMYB120。

本发明还提供所述的甜橙CsMYB120基因或其蛋白、含有所述的甜橙CsMYB120基因的表达载体在植物花期调控中的应用。

优选，所述的应用是在促进植物提早开花中的应用。

优选，所述的植物为拟南芥。

优选，所述的植物为柑橘/甜橙。

本发明通过转化拟南芥表明CsMYB120可明显促进植物的成花，缩短了植物的开花时间，该基因可应用于多年生木本果树的提早开花(即缩短童期)，从而缩短育种进程，在植物的遗传改良中发挥着重要作用。

附图说明

图1是甜橙CsMYB120基因结构示意图；附图标记说明：CsMYB120基因组DNA与cDNA的序列比对结构图，cDNA上标记4个外显子(exon)及每个外显子在DNA序列上的位置。

图2是采用实时定量PCR检测CsMYB120的表达模式；A图是CsMYB120在甜橙不同组织根(root)、茎(stem)、叶(leaf)、花(flower)和果(fruit)中的表达模式；B图是CsMYB120在甜橙花不同部位萼片(sepal)、花瓣(petal)、雄蕊(stamen)和雌蕊(carpel)中的表达模式。

图3是采用实时定量PCR检测不同激素处理下CsMYB120在甜橙花芽分化过程中的表达模式；A-B图分别是通过实时定量的方法检测PP333、NAA、GA和ABA处理下CsMYB120在花芽分化不同阶段的表达量；横坐标S1-S5表示花芽分化不同的阶段，以正常生长的植株为对照，β-actin为内参基因。

图4是CsMYB120在烟草表皮细胞中的瞬时转化；附图标记说明：Bright表示在明场条件下；DAPI用来标记细胞核，在紫外条件(358nm)下呈现出蓝光；GFP是融合基因，在395nm波长呈现出绿光；Merge是前三者的合成图，35S::GFP为正对照。

图5是35S::CsMYB120超表达株系I类表型；附图标记说明：A图是野生型的花序；B图是35S::CsMYB120的叶片，细长且肥厚；C图和F图是35S::CsMYB120的花序败育，不能产生正常的种子(E图)；D图是WT和35S::CsMYB120花结构的比较；G图和H图分别为7棵转基因植株开花时的莲座叶数和开花天数。

图6是35S::CsMYB120超表达株系II类表型；附图标记说明：A图是WT与株系L2和L3的表型；B图和C图分别是(A图)中开花时间和莲座叶数的统计；D图和E图是WT和II类转基因株系花器官和叶片形态的观察；F图是35S::CsMYB120株系中花粉活力测定；L表示株系。

图7是原始载体pBI121的图谱和本发明构建的重组载体pBI121+CsMYB120的图谱；A图是原始载体pBI121的图谱；B图是本发明构建的重组载体pBI121+CsMYB120的图谱。

图8是经过改造的pBI121+EGFP的载体图谱和本发明构建的重组载体pBI121+CsMYB120-GFP的图谱；A图是经过改造的pBI121+GFP的载体图谱；B图是构建的重组载体pBI121+CsMYB120-GFP的图谱。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：甜橙CsMYB120基因的分离与克隆

申请人前期对甜橙(Citrus sinensis)中MYB基因家族进行生物信息学分析，其中聚类分析的结果显示1R-MYB类转录因子中共分为6个分支，有一分支上只有甜橙中的MYB成员，不含有拟南芥中任何一个MYB基因，表明这些MYB基因(包括CsMYB120基因)特异性存在于柑橘中，可能是共同的祖先在分化过程中，拟南芥中这些基因的功能丧失或者是甜橙中这些基因获得了某些新的功能(Hou et al 2014)。因此来探究这些基因的功能具有重要的意义。

参考甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中Cs4g17160的转录本序列，在克里曼丁基因组数据库中匹配度最高的为Ciclev10008096m，两者除了在CDS区有5个SNP和3’-UTR长短不一致外，其余序列完全一致，并在柑橘EST数据库中有很高的匹配。鉴于前期对甜橙MYB基因家族的分析，Cs4g17160为CsMYB120，因此在本发明中均用CsMYB120进行命名。甜橙CsMYB120基因的分离与克隆的具体步骤如下：

1.甜橙叶片总RNA提取：植物样品经过液氮充分磨样后，RNA的提取采用Fruit-mate^TM for RNA Purification试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司，Code No.9192)，按照试剂盒说明书进行抽提，并用RAase-free DNase I(购自宝生物工程大连有限公司，CodeNo.2270A)于37℃中消化20min去除基因组DNA。RNA提取的整个过程必须要戴口罩和手套，并在超净工作台上进行操作。溶解后的RNA用1.2％琼脂糖凝胶，在电压为121V、电流为90mA条件下电泳20min检测总RNA的完整性及是否有基因组DNA的污染；同时用NANODROP 2000超微量分光光度计仪检测RNA的浓度及纯度。检测质量好的RNA于-80℃保存备用或直接进行反转录合成cDNA。

2.第一条cDNA链的合成：cDNA第一条链的合成采用ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录试剂盒(购于东洋纺上海生物科技有限公司,Code No.FSQ-101)。在RNase-free的0.2mL离心管中加入5μl(约1μg)总RNA，1μl Oligo dT，混匀后70℃变性5min，取出后迅速置于冰上冷却2min；再依次加入dNTP 2μl，5×RT Buffer 4μl，42℃放置2min；最后加入ReverTra Ace反转录酶1μl，反复吸打混匀后42℃孵育60min，70℃加热10min以终止反应。反转录后的cDNA为模板，用β-actin引物进行PCR检测cDNA质量，-20℃保存备用。

3.CsMYB120基因的扩增：采用Primer Primer 5.0软件分别在CsMYB120的5’-UTR和3’-UTR设计正反向引物(正向引物：5’-GGGCATGAGCGTTAAAGAC-3’，反向引物：5’-CCTAAACCCTAATCCGAGAAGT-3’)对CsMYB120全长CDS进行扩增，以及扩增CsMYB120的基因组序列，基因组DNA的提取参考采用前期报道的方法(Cheng et al 2003)。扩增到的基因片段采用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的片段利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购于上海捷瑞生物工程有限公司，Code No.GK2042)回收纯化(方法按照试剂盒说明书)。对回收产物进行AT克隆，连接体系(10μl)：回收片段7.5μl，pMD18-T 0.5μl，10×T₄ Buffer 1μl，T₄ ligase1μl，置于16℃连接过夜，并转化大肠杆菌DH5α。阳性菌落先进行PCR检测(按常规方法)，然后再送样并进行测序(由武汉天一辉远生物科技有限公司完成)。随后将测序结果与已知数据库里面的DNA序列进行对比，以保证基因序列的一致性。

结果分析：测序结果显示CsMYB120基因组(起始密码子至终止密码子)序列2181bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；cDNA序列长度为1485bp，对应核苷酸序列如SEQID NO.2所示；编码494个氨基酸的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。采用GeneStructure Display Server(GSDS)在线分析网站进行序列比对发现CsMYB120基因含有4个外显子和3个内含子的基因结构(图1)。四个外显子分别在基因上位置为1-196，552-1241，1406-1482和1660-2181。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)对CsMYB120编码蛋白的结构域进行预测，其保守结构域位于271-324处。

实施例2：CsMYB120基因的表达分析

为了探究CsMYB120基因如何来调控植物的生长发育，我们首先采用实时荧光定量PCR的方法检测CsMYB120基因在甜橙不同组织(根、茎、叶、花和果)及花不同部位(萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊)的表达。又探究了CsMYB120基因是否参与植物的花芽分化过程，植物的花芽分化易受到植物激素的影响，因此我们对花芽分化期的植株进行PP333、NAA、GA和ABA的处理，分析这些激素对CsMYB120在花芽分化中的表达变化。具体步骤如下：

1.采集样品：研究所用的甜橙(Citrus sinensis)材料来自于华中农业大学国家育种中心种质资源圃，根为成年态树体的侧根；春梢生长约一个月后采集的幼嫩新鲜的茎和叶片；花是完全开花的花；果为盛花期一个月后采集的幼果。花不同部位的分离在冰上进行操作。柑橘自剪是成花转变的重要标志，花芽的采集以春梢自剪后为临界点，采集枝条的顶芽和其后的5个花芽进行混合。在2016年5月27日(Stage1)开始，用激素PP333(800pM)、NAA(400μM)、GA(60μM)和ABA(100μM)对整个成年态植株进行喷施，每隔9d采样，共采集5次样记为Stage1-5。每个处理设置三个重复，以不喷施激素为对照，在相同的环境条件下生长及管理一致，同时期进行取样。采完后立即用液氮速冻，并保存于-80℃冰箱内备用。

2.RNA的提取及反转录：对采集后的样品进行RNA的提取及反转录，具体方法见实施例1。

3.实时荧光定量PCR(RT-PCR)：在LightCycler 480上进行实时荧光定量PCR，反应程序为：95℃预变性2min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，循环次数为45。每个样品4个重复，以β-actin基因(Ciclev10025866m)为内参，反应体系如表1。

表1 RT-PCR反应体系

结果分析：从图2所显示的定量结果来看，CsMYB120在甜橙所有检测组织中均有表达，但在营养组织茎和叶片中的表达量较高，表明CsMYB120参与对植物营养生长和生殖生长的调控，CsMYB120基因在花不同部位也均为组成型表达。

从图3所显示的定量结果来看，CsMYB120在花芽分化的前期的表达一致维持在较低的水平，而在花芽分化的后期表达迅速升高，具有较前期高很多倍的表达水平，表明CsMYB120参与到花芽分化的过程。PP333和GA的处理较对照明显增加在S5阶段的表达量，NAA的处理却没有明显变化，ABA处理后明显降低在S5阶段的表达水平，任何激素的处理在S1-S4阶段都不促进CsMYB120的表达，表明CsMYB120通过响应激素特异性地在花芽分化的后期(S5阶段)进行调控柑橘的花芽分化。

实施例3：CsMYB120蛋白的亚细胞定位

1.载体的构建：通过使用PSORT程序预测到CsMYB120蛋白可能定位于细胞核中，为验证这一预测结果，构建了CsMYB120的编码序列与GFP蛋白融合的载体。具体为：利用经过改造并携带GFP的pBI121载体上的多克隆位点，去除CsMYB120基因的终止密码子实现与EGFP的融合。在正向引物和反向引物的5'端分别加入含有Xba I和Sma I酶切位点的重组位点；引物序列为：正向引物：5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGCATCCCCTTCAGAAC-3'；反向引物：5'-GCCCTTGCTCACCATCCCGGGGAACTTGAGAGTAATCTCAC-3'(注：下划线标记为加入的酶切位点)；以实施例1获取的CsMYB120连pMD18-T载体的菌液为模板进行CsMYB120重组片段的扩增。载体pBI121-EGFP(图8)进行酶切，酶切体系40μl：质粒(1000ng/μl)10μl，10×TBuffer 4μl，BSA 4ul，Xba I和Sma I各1μl，双蒸水20μl。在37℃酶切2h后纯化回收。将经Xba I和Sma I酶切的CsMYB120片段、pBI121-EGFP载体进行连接，重组反应采用南京诺唯赞生物技术有限公司的一步重组法试剂盒，具体方法参考说明书。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，测序确定没有突变，获得含有插入目的片段的中间载体，将其命名为中间载体pBI121+CsMYB120-GFP(图8)，提取质粒并转化农杆菌菌株GV3101，挑取单菌落于-80℃保存。

2.浸染液的配置：配置母液1M MgCl₂和1M MES(KOH调至pH＝5.7)。浸染液(50ml)的组分：500μl 1M MgCl₂，500μl 1M MES和100μl 20mg/ml AS。

3.浸染液的准备及烟草注射：用勺子轻轻在表面刮取少量农杆菌于1ml浸染液中，测定菌液的OD₆₀₀＝0.5，准备好的菌液置于28℃培养箱中放置2-4h。在烟草的背面用1ml注射器缓慢的注射，使液体充满整个叶片组织，浇充足的水，置于23℃光照培养室中生长3d。使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光并进行成像。

结果分析：在35S启动子的驱动下进行组成型表达，采用农杆菌介导的35S::CsMYB120-GFP和阳性对照35S::GFP在烟草下表皮细胞中进行瞬时转化，并用DAPI标记细胞核，检测GFP荧光蛋白的定位情况。图4的结果表明35S::CsMYB120-GFP融合蛋白定位在细胞核中，而阳性对照35S::GFP在细胞核、细胞质、细胞膜中均有分布，定位广泛。由此，我们推测CsMYB120蛋白主要是定位在细胞核中且可能具有转录因子的特性来发挥作用的。

实施例4：CsMYB120基因的功能验证

1.载体的构建：为了探究CsMYB120基因的功能，依据pBI121载体的多克隆位点，用Primer 5.0软件设计重组引物，在正向引物和反向引物的5'端分别加上含有BamH I和SacI酶切位点的重组位点，引物序列为：

正向引物：5'-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGCATCCCCTTCAGAACT-3'；

反向引物：5'-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAGAACTTGAGAGTAATCT-3'(注：下划线标记为加入的酶切位点)。

载体的构建方法同实施例3中的方法。抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有突变，从而获得含有目的片段的重组载体pBI121+CsMYB120(图7)。应用冻融法将重组载体导入农杆菌菌株GV3101中，并对农杆菌菌液进行-80℃下保存备用，以便后续的转化应用。

2.拟南芥的转化：

(1)拟南芥的种植：在2ml离心管中加入适量的拟南芥种子，加入1ml水浸泡，置于4℃三天，打破种子的休眠；用枪头吸取种子并点播到营养基质的表面，一般每盆点播10棵种子左右，避免有的种子活力差不能发芽；盖上薄膜保湿，同时戳几个孔保持透气；3d后揭膜，在23℃的培养室(16h光照/8h黑暗)中生长约30d，期间进行疏苗保持每盆4株苗子；待花序抽出约1cm时即可进行农杆菌的浸染。

(2)农杆菌菌液准备：取出储存于-80℃保存含有重组载体pBI121+CsMYB120的农杆菌菌液，在28℃培养箱中振荡活化2h；将鉴定为阳性的农杆菌在含有50mg/L Rif和50mg/L Kan的固体LB平板上划线，28℃倒置培养2d；用勺子轻轻在表面刮取农杆菌于50ml的5％蔗糖(现用现配)溶液中，避免刮入培养基，置于28℃摇床中振荡分散菌体约30min。测定并用蔗糖溶液调至菌液的OD₆₀₀为0.8左右，加入少量的Sliwet L-77表面活化剂至终浓度为0.02％，混匀后即可进行拟南芥的转化。

(3)拟南芥的转化：将待转的拟南芥苗倾斜，花序在农杆菌菌液中浸染1min，期间不断转动菌液保证花序与菌液充分接触；转化完之后用黑色的塑料袋避光保湿24h，提高转化的效率；然后置于正常条件下生长，每5d转化一次，约转化2-3次即可。待种子成熟后收种即T₀代种子置于37℃干燥箱中干燥7d，后置于4℃保存。

(4)拟南芥的抗性筛选及鉴定：将保存在4℃中T₀代种子分装到2ml离心管中，每管约100μl；在无菌条件下，每管中加入1.5ml 75％酒精，上下颠倒5min；吸出75％酒精，加入1ml100％酒精，用剪过的枪头吸取种子至灭菌滤纸上，风干5min；消毒完毕后，用镊子夹取滤纸使种子均匀地散在含有50mg/L Kan和100mg/L Tim的1/2MS筛选培养基上；筛选后的培养基置于23℃光照培养室中培养，约10d即可看出阳性苗；挑选生长健壮、根系发达的苗子移栽到营养基质中；待阳性苗生长到7-8片真叶时进行RNA水平和DNA水平的鉴定，确保每个基因至少有三个阳性株系；对在T₁代有明显表型的转基因苗做重要标记。由于T₁代种子较少且遗传不稳定，故播种T₂代转基因种子中的3个系和野生型种子，统计其开花时间并对花序的形态特征进行相机拍照或显微镜拍照。开花时间的统计为花序长到1cm时，记录植株的莲座叶及开花时间。

结果分析：根据转基因植株产生的表型，分为两种类型：I类和II类。在获得的16棵转CsMYB120基因组的T₁阳性植株中有7棵植株出现严重的表型，即I类(图5)，苗子矮小、生长较弱、莲座叶细长且肥厚。I类植株与野生型相比除了营养形态上差异外，在花器官上也有严重的异常现象，顶端花序败育不能在产生种子，并且转基因株系的花比野生型小，缺少花瓣结构且萼片和雄蕊较野生型缩小，导致整朵向外开张(图5C-F)。这些植株开花时不仅在莲座叶数上少于野生型，而且从移栽到主枝花序为1cm时的开花时间早于野生型(图5G和H)。由于这些植株的种子败育，无法播种T₂代进行表型的进一步观察和统计，故这些表型的差异是在T₁代中进行观察的。此外，还有两个T₁株系属于中度表型，即II类(图6)，在植株的形态和花器官上类似于野生型，但T₂代和T₃代的开花时间明显早于野生型，并且在T₂代和T₃代会出现表型的分离，部分植株的表型在营养形态上跟野生型相同，但花器官上类似严重表型的花。有的植株在较野生型提前开花(图6A-C)，花器官缺陷的表型不太严重，虽然在萼片、花瓣和雄蕊都短小，莲座叶面积变小成细条状，但可以正常结种(图6D和E)。通过亚历山大染色进行花粉活性的观察，花粉均有很强的活性(图6F)，这些植株可以形成正常的种子繁殖下一代。

以上结果表明CsMYB120不仅调控植物的开花时间，而且在植株形态和花器官上起一定的作用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 甜橙CsMYB120基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> 甜橙(Citrus sinensis)

<400> 1

atggcatccc cttcagaact cagtttagat tgcaaaccgc atagctattc tatgctctta 60

aaagctttcg gtgaccaggc tgctgatcat gagacacaaa agcttgaaga ggtccttgct 120

cgtcttgagg aagaacggtt caagatcgat ggtctgaagc gcgagctgcc cctttgcatg 180

caacttctta ccaatggtat tgttttttgt atttttcagt tgttcttaaa attaaaaaat 240

aaatttctca ttatatcaat aatcatttct tttgatgaat tattcaagcc ggaatcttgg 300

ataatataaa gaaattgttt ttaccctatt ggtggatttt ttatctattc tatggcgttt 360

agcctctaat ctttttcttt aattttatcc tcctttttgt tttctctctc ccatttttat 420

agaagagagt gattgctttc tgttagtccc gtctctttaa attcaaaaga actaaagcta 480

cgagcatgaa aataacttcc aaaagaaaac cttacacact aatgacccta ttccattttt 540

taattcctca gctgtggagg tttcaaggca gcaactacaa gcctacagag caacaaatca 600

agggccaagg ccagttcttg aagaattcat acctctgaaa aattcaagct ctgaaatctc 660

agaaaccaag tctcaaaata tctctgacaa ggcaaactgg atgaccactg ctcaactgtg 720

gagccaaaca ggcaacaatg aaacaaaatc acaaaacaca atagcagcat cccctaagga 780

aactactact gatattgtag ggttcaatgt gattagtccc aagctggcct tggataccaa 840

acagagaaat ggaggagctt ttgtcccatt ctcaaaagaa cggaactcct gtccaagtcc 900

aactttacgg gctctcccag atctggctct tgcctctcct gataaagaaa tggatcacca 960

agataacagg tgctctgaaa atgaaaatgg aaggagagag aatcttggca atcataataa 1020

taataataag attagcaatt gcaatggggg agctgtgctt catgaacaaa tgaaaggtgt 1080

tgctggtaat tcaacggaag ggcaaacaaa ttccaacaac cctacaaaca acaacaacaa 1140

caacaataat aataatactc acaggaaagc aagaaggtgt tggtcaccgg acttgcaccg 1200

ccgatttgtc agtgctcttc agatgcttgg tggttctcaa ggtaataata ataacacaac 1260

gaactttttt aatttttttt aatttttggc agttagtttc ctgttatcaa gttcttcatc 1320

atgataatga tagtcaaact atgattgtca taatgattat ctgtcaaata tgtggctgat 1380

tttatggggc catgcatgga tacagtggcc acaccaaaac aaatcagaga actgatgaag 1440

gttgacggtt tgaccaatga cgaagttaaa agtcatttgc aggtaactaa ctaactctca 1500

ctttctattc tctctactga gacatgaaac tgattttgtc ctgtttctaa aaactgacaa 1560

cgtaccaagt accaaagtac ccagatacta catgttcagt caaatattgg taaaagtctc 1620

atgttttttt tttttcctct cttttttggg tgcacgcaga aatacaggct tcacacaagg 1680

cgaccaagtc cgagtccaca acaagccgga gctccggctc cgcagctggt ggtcttgggt 1740

ggcatctggg tcccctcaga gtacaccacc gcagcagctg cagcccacag tgggacccct 1800

gctctctatc atcacccatc tccacaccca ccctcccact tctgtgctgc atccccagtg 1860

ccacaagact tttacactac agcagcgccg gcagcaccac aaccaccacc accattacca 1920

cctctgtcgc cagcccacca ccagttgcac ctccataacc aaatccacat gtacaaggcc 1980

acgtcacagg gccacggctc accggaatcg gacatcaggg gcattggaga tcggtcagag 2040

agcatagaag atggcaagtc agaaagcagc agctggaaag gtgagagtgg tgataatggt 2100

gttgcagaga gaaaaggatt agctgctctg agagaagatg gcgaagagag taacggaagt 2160

gagattactc tcaagttcta a 2181

<210> 2

<211> 1485

<212> DNA

<213> 甜橙(Citrus sinensis)

<400> 2

atggcatccc cttcagaact cagtttagat tgcaaaccgc atagctattc tatgctctta 60

aaagctttcg gtgaccaggc tgctgatcat gagacacaaa agcttgaaga ggtccttgct 120

cgtcttgagg aagaacggtt caagatcgat ggtctgaagc gcgagctgcc cctttgcatg 180

caacttctta ccaatgctgt ggaggtttca aggcagcaac tacaagccta cagagcaaca 240

aatcaagggc caaggccagt tcttgaagaa ttcatacctc tgaaaaattc aagctctgaa 300

atctcagaaa ccaagtctca aaatatctct gacaaggcaa actggatgac cactgctcaa 360

ctgtggagcc aaacaggcaa caatgaaaca aaatcacaaa acacaatagc agcatcccct 420

aaggaaacta ctactgatat tgtagggttc aatgtgatta gtcccaagct ggccttggat 480

accaaacaga gaaatggagg agcttttgtc ccattctcaa aagaacggaa ctcctgtcca 540

agtccaactt tacgggctct cccagatctg gctcttgcct ctcctgataa agaaatggat 600

caccaagata acaggtgctc tgaaaatgaa aatggaagga gagagaatct tggcaatcat 660

aataataata ataagattag caattgcaat gggggagctg tgcttcatga acaaatgaaa 720

ggtgttgctg gtaattcaac ggaagggcaa acaaattcca acaaccctac aaacaacaac 780

aacaacaaca ataataataa tactcacagg aaagcaagaa ggtgttggtc accggacttg 840

caccgccgat ttgtcagtgc tcttcagatg cttggtggtt ctcaagtggc cacaccaaaa 900

caaatcagag aactgatgaa ggttgacggt ttgaccaatg acgaagttaa aagtcatttg 960

cagaaataca ggcttcacac aaggcgacca agtccgagtc cacaacaagc cggagctccg 1020

gctccgcagc tggtggtctt gggtggcatc tgggtcccct cagagtacac caccgcagca 1080

gctgcagccc acagtgggac ccctgctctc tatcatcacc catctccaca cccaccctcc 1140

cacttctgtg ctgcatcccc agtgccacaa gacttttaca ctacagcagc gccggcagca 1200

ccacaaccac caccaccatt accacctctg tcgccagccc accaccagtt gcacctccat 1260

aaccaaatcc acatgtacaa ggccacgtca cagggccacg gctcaccgga atcggacatc 1320

aggggcattg gagatcggtc agagagcata gaagatggca agtcagaaag cagcagctgg 1380

aaaggtgaga gtggtgataa tggtgttgca gagagaaaag gattagctgc tctgagagaa 1440

gatggcgaag agagtaacgg aagtgagatt actctcaagt tctaa 1485

<210> 3

<211> 494

<212> PRT

<213> 甜橙(Citrus sinensis)

<400> 3

Met Ala Ser Pro Ser Glu Leu Ser Leu Asp Cys Lys Pro His Ser Tyr

1 5 10 15

Ser Met Leu Leu Lys Ala Phe Gly Asp Gln Ala Ala Asp His Glu Thr

20 25 30

Gln Lys Leu Glu Glu Val Leu Ala Arg Leu Glu Glu Glu Arg Phe Lys

35 40 45

Ile Asp Gly Leu Lys Arg Glu Leu Pro Leu Cys Met Gln Leu Leu Thr

50 55 60

Asn Ala Val Glu Val Ser Arg Gln Gln Leu Gln Ala Tyr Arg Ala Thr

65 70 75 80

Asn Gln Gly Pro Arg Pro Val Leu Glu Glu Phe Ile Pro Leu Lys Asn

85 90 95

Ser Ser Ser Glu Ile Ser Glu Thr Lys Ser Gln Asn Ile Ser Asp Lys

100 105 110

Ala Asn Trp Met Thr Thr Ala Gln Leu Trp Ser Gln Thr Gly Asn Asn

115 120 125

Glu Thr Lys Ser Gln Asn Thr Ile Ala Ala Ser Pro Lys Glu Thr Thr

130 135 140

Thr Asp Ile Val Gly Phe Asn Val Ile Ser Pro Lys Leu Ala Leu Asp

145 150 155 160

Thr Lys Gln Arg Asn Gly Gly Ala Phe Val Pro Phe Ser Lys Glu Arg

165 170 175

Asn Ser Cys Pro Ser Pro Thr Leu Arg Ala Leu Pro Asp Leu Ala Leu

180 185 190

Ala Ser Pro Asp Lys Glu Met Asp His Gln Asp Asn Arg Cys Ser Glu

195 200 205

Asn Glu Asn Gly Arg Arg Glu Asn Leu Gly Asn His Asn Asn Asn Asn

210 215 220

Lys Ile Ser Asn Cys Asn Gly Gly Ala Val Leu His Glu Gln Met Lys

225 230 235 240

Gly Val Ala Gly Asn Ser Thr Glu Gly Gln Thr Asn Ser Asn Asn Pro

245 250 255

Thr Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Thr His Arg Lys Ala

260 265 270

Arg Arg Cys Trp Ser Pro Asp Leu His Arg Arg Phe Val Ser Ala Leu

275 280 285

Gln Met Leu Gly Gly Ser Gln Val Ala Thr Pro Lys Gln Ile Arg Glu

290 295 300

Leu Met Lys Val Asp Gly Leu Thr Asn Asp Glu Val Lys Ser His Leu

305 310 315 320

Gln Lys Tyr Arg Leu His Thr Arg Arg Pro Ser Pro Ser Pro Gln Gln

325 330 335

Ala Gly Ala Pro Ala Pro Gln Leu Val Val Leu Gly Gly Ile Trp Val

340 345 350

Pro Ser Glu Tyr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala His Ser Gly Thr Pro

355 360 365

Ala Leu Tyr His His Pro Ser Pro His Pro Pro Ser His Phe Cys Ala

370 375 380

Ala Ser Pro Val Pro Gln Asp Phe Tyr Thr Thr Ala Ala Pro Ala Ala

385 390 395 400

Pro Gln Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Ser Pro Ala His His Gln

405 410 415

Leu His Leu His Asn Gln Ile His Met Tyr Lys Ala Thr Ser Gln Gly

420 425 430

His Gly Ser Pro Glu Ser Asp Ile Arg Gly Ile Gly Asp Arg Ser Glu

435 440 445

Ser Ile Glu Asp Gly Lys Ser Glu Ser Ser Ser Trp Lys Gly Glu Ser

450 455 460

Gly Asp Asn Gly Val Ala Glu Arg Lys Gly Leu Ala Ala Leu Arg Glu

465 470 475 480

Asp Gly Glu Glu Ser Asn Gly Ser Glu Ile Thr Leu Lys Phe

485 490

Claims

1.甜橙CsMYB120基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的甜橙CsMYB120基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

3.一种含有权利要求1所述的甜橙CsMYB120基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，为重组表达载体pBI121+CsMYB120。

5.权利要求1所述的甜橙CsMYB120基因、权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的表达载体在植物花期调控中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在促进植物提早开花中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为柑橘。