KR101810356B1 - MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 개화시기가 촉진된 식물체 - Google Patents

MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 개화시기가 촉진된 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명에 개시된 일반식 I의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산인 글루타민이 루신으로 치환된 MADS-box 도메인을 포함하는 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체는 개화시기가 촉진되고, 개화 이후에도 생장이 유지되기 때문에 꽃과 종자를 단기간 내에 생산할 수 있으며 생산량이 증가한다.

Description

MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 개화시기가 촉진된 식물체{Method For Controlling Promoting Time of Plants using MADS-box Protein and Plants Thereof}
본 발명은 MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 개화시기가 촉진된 식물체에 관한 것이다.
식물의 생장은 뿌리와 잎, 줄기 등의 영양기관이 생장하여 식물 개체의 길이 및 부피 생장을 이끄는 영양생장(vegetative growth)과 자손을 생산하여 번식하기 위해 꽃을 발달시키고 수분과 수정 과정을 거쳐 종자를 생산하는 생식생장(reproductive growth) 과정으로 이루어져 있다. 영양생장에서 생식생장으로의 전이과정은 개화(flowering) 과정을 통해 이루어지며 개화 과정은 식물이 꽃을 피울 준비 단계부터 꽃의 소기관 형성을 완료하는 단계까지를 이른다. 식물에서 생식생장으로의 전이 및 개화는 식물의 내외적 신호에 의해 조절되며, 식물은 외적으로 빛이나 온도의 변화를 감지하고 내적으로 식물의 발달 상황을 인식함으로써 프로그래밍화되어 있는 개화조절 메카니즘에 의해 개화시기를 결정한다. 수년간의 연구 결과, 식물은 외부의 환경 요인들, 일장(photoperiod)과 저온(vernalization)에 대해 반응하는 개별적인 메카니즘을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다(Poething et al.,Science, 250:923-930, 1990).
이러한 환경 요인에 반응하는 유전적 경로 및 조절 단백질의 동정과 기능 규명은 모델식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 대해 집중되어 있다. 애기장대의 개화 조절 유전자들은 약 100개의 복잡한 구조로 연계를 이루고 있지만, 돌연변이 스크린을 통해서 오직 FRI(FRIGIDA) 및 FLC(FLOWERING LOCUS C)와 같은 몇몇의 유전자들만이 주요 조절자로 환경신호를 인지하는 것으로 알려져 있다(Burn et al., 1993; Lee et al., 1993; Clarke and Dean, 1994; Lempe et al., 2005). 일 예로 환경 신호를 인지하는 유전자 중 하나인 FLC는 MADS-box를 암호화 하고 있으며, FLC는 개화 촉진 유전자의 전사를 억제하여 개화시기를 조절한다(Michaels and Amasino, 1999). 개화시기 조절자인 FLC의 기능을 상실한 FLC 돌연변이체는 FRI 감수성이 떨어져 개화시기가 촉진된다는 사실이 알려져 있으며(Amasino, 2004), FLC-SVP 복합체는 FT(flowering locus T) 및 SOC1(suppressor of overexpression of conseans 1)의 발현을 직접적으로 억제하여 개화를 지연시키는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2007, 2008; Li et al., 2008).
본 발명자들은 애기장대에서 SVP 단백질의 MADS-box 도메인에 돌연변이가 발생한 경우 개화가 촉진되고, 조기개화 이후에도 생체량의 손해가 없으며, 저온에서 배양하더라도 고온에서 배양한 효과를 얻을 수 있는 식물을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1664451호
본 발명의 일 양상은 돌연변이 MADS-box 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 MADS-box 단백질은 하기 일반식 I의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산인 글루타민이 루신으로 치환된 MADS-box 도메인을 포함하는 것인 재조합 벡터를 제공하는 것이다:
[일반식 I]
Arg-Gln-Val-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Lys-Arg
상기 일반식 I에서 Xaa1은 Thr 또는 Ser이고,
Xaa2는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3는 Ser, Phe, Leu, Ala 및 Thr로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 도입한 식물체에서 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체를 회수하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 양상은 상기 방법에 의하여 제조된 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 돌연변이 MADS-box 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 MADS-box 단백질은 하기 일반식 I의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산인 글루타민이 루신으로 치환된 MADS-box 도메인을 포함하는 것인 재조합 벡터를 제공한다:
[일반식 I]
Arg-Gln-Val-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Lys-Arg
상기 일반식 I에서 Xaa1은 Thr 또는 Ser이고,
Xaa2는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3는 Ser, Phe, Leu, Ala 및 Thr로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
본 명세서에서 용어, "MADS-box 단백질(MADS-box protein)"은 MADS-box 유전자에 의하여 암호화되는 단백질을 의미하며, MADS-box 유전자는 동물과 식물, 양치류, 균류 등에 존재한다. 상기 MADS-box 유전자는 생물의 발달과 세포 분화를 조절하는 전사인자 기능을 가진 유전자로(Riechmann, 1997), 효모의 MCM1(Passmore, 1988), 애기장대(Arabidopsis)의 AGAMOUS(Yanofsky, 1990), 금어초(Antirrhinum)의 DEFICIENS(Sommer,1990) 및 사람의 SRF 유전자(Norman, 1998)에서 앞글자를 따서 명명되었다. MADS-box 유전자는 MADS-box 도메인으로 불리는 보존된 영역을 가지는 전사인자를 암호화하며 30개 내지 그 이상으로 구성되는 유전자 패밀리를 포함한다. 상기 유전자들은 전사 수준에서의 조절을 통하여 식물의 형태형성 (morphogenesis) 및 기관형성(organogenesis)을 조절하는 것으로 알려져 있다 (akai, H., "Molecular genetics of floral morphogenesis"; "Molecular Mechanisms for Determination of Plant Morphology, (Shujunsha Inc.)).
본 명세서에서 용어, "MADS-box 도메인(MADS-box domain)"은 MADS-box 유전자 내의 보존된 영역(conserved region)을 의미하며, DNA-binding 도메인을 암호화한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 MADS-box 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 MADS-box 단백질은 SVP(Short Vegetative Phase), AGL(AGAMOUS-like) 및 MADS-box 전사인자로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 SVP 단백질은 서열번호 5 내지 50으로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 AGL 단백질은 서열번호 122 및 124로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, MADS-box 전사인자는 서열번호 53 내지 71로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 재조합 벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium) 바이너리 벡터를 이용하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "바이너리 벡터(binary vector)"는 야생형 Ti(tumor inducible) 플라스미드를 이동에 필요한 부분인 LB(left border) 및 RB(right border)를 가지는 플라스미드 및 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드 두 개로 나누어 놓은 벡터를 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 바이너리 벡터는 실험의 목적에 따라 pDONR221(insert DNA용 벡터) 및 pK2GW7(과발현 Ti-vector), 또는 pDONR221 및 pB7GWIWG2(RNAi Ti-vector) 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 도입한 식물체에서 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체를 회수하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법을 제공한다.
상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계는 아그로박테리움 방법, 원형질체 융합법(protoplast fusion), 전기천공법(electroporation), 및 유전자총 방법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으며, 아그로박테리움 방법을 이용하는 경우 형질전환용 아그로박테리움은 본 발명의 MADS-box 단백질의 발현에 적합한 것이면 어느 것이든 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔시스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 형질전환시키고, 형질전환된 GV3101을 식물체에 형질전환시키는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체를 회수하는 단계는 항생제 선별 또는 제초제 선별 방법을 이용할 수 있다. 일 예로 재조합 벡터를 도입한 식물체를 카나마이신이 포함된 배지에서 배양하는 방법 또는 재조합 벡터를 도입한 식물체를 배양하면서 Basta를 처리하여 생존하는 개체를 회수하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 방법에 의하여 제조된 개화시가 촉진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, '개화시기(flowering time)가 촉진된 형질전환 식물체'는 본 발명의 재조합 벡터의 도입에 의하여 야생형과 비교하여 개화시기가 빨라진 식물체를 의미한다. 개화시기가 촉진되면 영양생장에서 생식생장으로의 전이가 빨리 일어나기 때문에 식물체의 생산량 및 종자 생산량이 증가하는 장점이 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체는 SVP1(Short Vegetative Phase 1), SVP2(Short Vegetative Phase 2) 및 EFM(early flowering MYB)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현이 증가되어 있으며, 결과적으로 식물체의 정상적인 개화 조절 과정을 회피할 수 있다.
본 발명에 개시된 일반식 I의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산인 글루타민이 루신으로 치환된 MADS-box 도메인을 포함하는 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체는 개화시기가 촉진되고, 개화 이후에도 생장이 유지되기 때문에 꽃과 종자를 단기간 내에 생산할 수 있으며 생산량이 증가한다.
도 1은 애기장대 유래의 SVP 및 mSVP(Q18L) 단백질의 3차원 구조 및 형태적 유사도를 비교한 도이다.
도 2는 pK2GW7 재조합 벡터 및 pB7GWIWG2 재조합 벡터에 제한효소를 처리하여 라이게이션 여부를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 3은 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔시스 GV3101을 YEP 고체 배지에서 배양한 결과를 보여주는 도이다.
도 4는 아그로박테리움 투메파시엔시스 GV3101로 형질전환한 애기장대를 카나마이신 또는 Basta로 선별하는 과정을 보여주는 도이다.
도 5는 아그로박테리움 투메파시엔시스 GV3101로 형질전환한 애기장대를 발아 후 1주 동안 배양한 결과를 보여주는 도이다.
도 6은 아그로박테리움 투메파시엔시스 GV3101로 형질전환한 애기장대를 발아 후 2주 동안 배양한 결과를 보여주는 도이다.
도 7은 아그로박테리움 투메파시엔시스 GV3101로 형질전환한 애기장대를 발아 후 1주 동안 배양한 결과를 보여주는 도이다.
도 8은 mSVP 돌연변이 애기장대의 최초 개화시기를 보여주는 도이다.
도 9는 배양 온도에 따른 야생형 및 돌연변이 애기장대의 평균 개화시기를 보여주는 도이다.
도 10은 야생형 및 돌연변이 애기장대에서 LHP, FRI, FLM1 및 VRN의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 11은 야생형 및 돌연변이 애기장대에서 FLM2, FLM3, EFM 및 JMJ30 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 12는 야생형 및 개화 연관 유전자 과발현 애기장대에서 LHP1, SVP1, SVP2 및 FLC1 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 13은 야생형 및 개화 연관 유전자 과발현 애기장대에서 FLC4, FRI, VRN2-like 및 FLM2 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 14는 야생형 및 개화 연관 유전자 과발현 애기장대에서 FLM3, FLM4, FLM5 및 EFM 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 15는 야생형 및 개화 연관 유전자 과발현 애기장대에서 JMJ30 및 Actin8 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 16는 야생형 애기장대에서 개화 관련 유전자들의 조절 기작을 개략적으로 보여주는 도이다.
도 17은 RNA 발현 분석 결과를 이용하여 mSVP 돌연변이 애기장대에서 개화 관련 유전자들의 예상 조절 기작을 개략적으로 보여주는 도이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 식물 개화 관련 유전자가 삽입된 재조합 벡터 제작
1-1. 애기장대 배양 및 cDNA 합성
애기장대( Arabidopsis thaliana)는 야생형인 Columbia-0(Col-0)를 사용하여 첫 파종시 2 내지 3일 동안 4에서 저온 순화처리를 통해 발아시켰다. 배양 조건은 장일조건인 16시간 광조건 및 8시간 암조건의 광주기, 조도 2800 내지 3000 LUX, 습도는 주간 40 내지 45%, 야간에는 45 내지 55%로 유지하였다. 온도 조건은 각각 17℃, 22℃ 및 27℃로 야외에서 배양하였다.
애기장대의 무균 배양은 종자를 살균하여 진행하였다. 애기장대 종자를 100% 및 70% 에탄올로 순차적으로 세척하고, 멸균된 증류수로 2 내지 3회 정도 세척하였다. 그후 멸균된 여과지 위에서 종자를 완전히 건조시키고, 건조된 종자는 MS 평판배지에 뭉치지 않게 뿌려주었다. 종자가 뿌려진 MS 평판배지를 파라필름(Parafilm)으로 완전히 밀봉하고, 호일을 이용하여 빛을 완전히 차단한 후 4℃에서 2 내지 3일 동안 순화처리하였다. 이후 호일을 제거하고 16-8시간의 광주기 조건으로 22℃에서 애기장대를 배양하였으며, 나머지 조건은 야외 배양과 동일하게 조성하였다. MS 배지의 조성을 하기 표 1에 기재하였다.
Ingredients Concentration of stock solution(g/ℓ) Put volume of stock solution in medium(㎖/ℓ) Final concentration of plant medium(㎎/ℓ)
NH4NO3 82.5 15 1237.5
KNO3 95 15 1425.0
KH2PO4 34 3 102
MgSO47H2O 74 3 222
KI 0.5 1 0.498
H3BO3 3.72 1 3.72
MnSO4 .4H2O 3.38 3 10.14
ZnSO37H2O 5.16 1 5.16
Na2MoO4.2H20 0.15 1 0.15
CuSO4.5H20 0.015 1 0.015
C℃l2.6H2O 0.015 1 0.015
Na2.EDTA 3.42 6 20.52
FeSO4.7H2O 2.78 6 16.68
CaCl2.2H2O 88 3 264
Nicotinicacid 300 ㎎ 1 0.3
Pyridoxine.HCl 300 ㎎ 1 0.3
Thiamine.HCl 60 ㎎ 1 0.06
Glycine 1200 ㎎ 1 1.2
etc.
Inositol 60 ㎎
Sucrose 30 g/10 g
Agar 8 g
pH pH 5.8
발아 후 2주된 애기장대의 상단부 잎(resette leave) 3 g을 곱게 마쇄하여 당업계에 알려진 Phenol/SDS/LiCl 방법을 이용하여 RNA를 추출하였다. SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase kit(Invitrogen, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출한 RNA(500 ng)로 cDNA를 합성하였다.
1-2: cDNA에서 개화 연관 유전자 증폭
상기 1-1에서 제조한 cDNA에서 식물의 개화 시기와 관련 있는 것으로 알려진 유전자인 LHP1, SVP, FLC, FRI, VRN2-LIKE, FLM 및 EFM 유전자를 GoTaq polymerase(Promega, 미국)를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)로 증폭하였다. 이때 재조합이 용이하도록 프라이머에 12attB1 (AAAAAGCAGGCTGG) 서열 및 12attB2 (AGAAAGCTGGGTGAG) 서열을 포함시켰다. PCR 반응 조건 및 사용한 프라이머 서열을 하기 표 2 및 표 3에 기재하였다.
PCR reaction mixture PCR reaction condition
dNTPs mixture 2.5 mM Denaturation 95℃, 2 min
MgCl2 15 mM Denaturation 94℃, 1 min 28 ~ 35 cycles
KCl 50 mM
Tris-HCl (pH 9.0) 10 mM Annealing 55℃, 1 min
Triton X-100 0.1%(v/v)
Taq polymerase 0.5 U Extension 72℃, 1 min
cDNA 1 ㎕
Sterile water Final extension 72℃, 5 min
Total 20 ㎕
Target gene Product size(bp) Insert-
DNA type 		Forward primer Reverse primer
LHP1 1338 OX AAAAAGCAGGCTGGATGAAAGGGGCAAGTGGTGC (서열번호 73) AGAAAGCTGGGTGAGGCGTTCGATTGTACTTGA (서열번호 74)
SVP 723 OX AAAAAGCAGGCTGGATGGCGAGAGAAAAGATTCA (서열번호 75) AGAAAGCTGGGTGACCACCATACGGTAAGCCGA (서열번호 76)
SVP 60 RNAi AAAAAGCAGGCTGGGTTCGAGTTCTGTAGCTCC (서열번호 77) AGAAAGCTGGGTGTTTGACTGCAAGTTATGC (서열번호 78)
FLC 591 OX AAAAAGCAGGCTGGATGGGAAGAAAAAAACTAGA (서열번호 79) AGAAAGCTGGGTGATTAGTAGTGGGAGAGTCA (서열번호 80)
FLC 60 RNAi AAAAAGCAGGCTGGGAGATGTCACCTGCTGGAC (서열번호 81) AGAAAGCTGGGTGATTAAGAAGTGGGAGAGT (서열번호 82)
FRI 945 OX AAAAAGCAGGCTGGATGTCCAATTATCCACCGAC (서열번호 83) AGAAAGCTGGGTGTACCTGAAACTGTGACCGCT (서열번호 84)
VRN2 -LIKE 1395 OX AAAAAGCAGGCTGGATGGACAGGTACAAGTTAAT (서열번호 85) AGAAAGCTGGGTGTCCGGCGACTTTCCTAGAGT (서열번호 86)
FLM 579 OX AAAAAGCAGGCTGGATGGGAAGAAGAAAAATCG (서열번호 87) AGAAAGCTGGGTGCTAATTGAGCAGCGGGAG (서열번호 88)
EFM 1299 OX AAAAAGCAGGCTGGATGGCGTCCTCATCAGAACT (서열번호 89) AGAAAGCTGGGTGTTAGAATTTGAGAGTTATTT (서열번호 90)
PCR 산물은 전기영동으로 확인하였으며, attB1 및 attB2 서열을 삽입하기 위하여 attB1 프라이머(GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC) 및 attB2 프라이머(GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)를 이용하여 상기 표 2와 동일한 조건으로 2차 PCR을 수행하였다.
1-3: 재조합 Ti -vector 제작(gateway cloning)
상기 1-2에서 합성한 2차 PCR 산물(LHP1, SVP, svp, FLC, flc, FRI, VRN2-LIKE, FLM 및 EFM; svp 및 flc는 RNAi용 PCR 산물을 의미함) 15 내지 150 ng과 pDONR221 벡터 150 ng을 혼합하고, TE buffer(pH 8.0)를 이용하여 최종 부피를 4 ㎕로 조정하였다. 이후 Gateway BP Clonase Ⅱ Enzyme (Invitrogen, 미국) 1 ㎕를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시키고, proteinase K 0.5 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 BP Clonase의 반응을 종료시켰다. 재조합 pDONR221 벡터는 E. coli 형질전환에 이용하였다.
재조합 pDONR221 벡터 50 내지 150 ng과 pK2GW7(과발현 Ti-vector; Invitrogen, 미국) 또는 pB7GWIWG2(RNAi용 Ti-vector; Invitrogen, 미국) 150 ng을 혼합하고, TE buffer(pH 8.0)를 이용하여 최종 부피를 4 ㎕로 조정하였다. LR clonase Ⅱ enzyme mix(Invitrogen, 미국) 1 ㎕를 혼합액에 첨가하여 잘 섞어준 후 25℃에서 1시간 동안 반응시키고, proteinase K 0.5 ㎕를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 LR Clonase의 반응을 종료시켰다. pK2GW7 및 pB7GWIWG2 재조합 벡터는 E. coli 형질전환에 이용하였다.
1-4: E. coli 형질전환 및 재조합 벡터 추출
상기 1-3에서 제작한 각각의 재조합 벡터(pDONR221, pK2GW7 및 pB7GWIWG2) 1 ㎍과 E. coli 컴피턴트 셀(competent cell)을 혼합하여 얼음에 30분 동안 방치하고, 42℃에서 1분 30초 동안 열충격(heat shock)을 가한 후 얼음에 5분 동안 다시 방치하였다. 이후 LB 배지 1 ㎖를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, LB 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 선별배지로 pDONR221 재조합 벡터는 카나마이신(kanamycin) 50 ug/㎖을 첨가한 LB 배지를 이용하고, pK2GW7 또는 pB7GWIWG2 재조합 벡터는 스펙티노마이신(spectinomycin) 100 ug/㎖를 첨가한 LB 배지를 이용하였다.
24시간 후 LB 평판배지에서 콜로니를 취하여 선별 항생제가 포함된 LB 액체배지에서 배양한 후 당업계에 알려진 알칼리 용해법(alkalin lysis)을 이용하여 재조합 벡터 DNA를 추출하였다. 추출한 pK2GW7 또는 재조합 pB7GWIWG2재조합 벡터 5 ㎕, Xba I 0.5 ㎕, Hind Ⅲ 0.5 ㎕ 및 10X M buffer 1 ㎕를 잘 섞어준 뒤 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후에 제한효소 반응 산물을 전기영동하여 라이게이션 여부를 확인하였다.
2. 형질전환 애기장대 제작
2-1. 아그로박테리움 투메파시엔시스 ( Agrobacterium tumefaciens ) GV3101 컴피턴트 셀 제조
YEP 액체 배지(peptone 10 g/ℓ, yeast extract 10 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 고체배지일 경우 agar 15 g/ℓ 첨가) 2 ㎖에 GV3101을 접종하여 28℃, 100 내지 200 rpm으로 15 내지 24시간 동안 진탕배양(shake culture)하였다. 이후 YEP 액체배지 50 ㎖에 상기 GV3101 배양액 2 ㎖를 접종하고, OD600이 0.6 내지 1.0이 될 때까지 약 5시간 동안 28℃에서 200 내지 300 rpm으로 진탕배양하였다. 배양이 끝난 후 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 차가운 0.15 M NaCl 용액 10 ㎖를 첨가하여 가볍게 흔들어 주면서 펠렛(pellet)을 풀어주었다. 펠렛을 완전히 풀어준 후 얼음에 10분 동안 방치하고, 5,000 rpm 및 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 차가운 20 mM CaCl2 용액 1 ㎖를 첨가하여 펠렛을 충분히 풀어준 후 멸균된 E-tube에 100 ㎕씩 분주하고, -70℃ 이하에서 보관하였다.
2-2. GV3101 형질전환
상기 2-1에서 제조한 GV3101 컴피턴트 셀과 재조합 벡터 pK2GW7 또는 재조합 벡터 pB7GWIWG2 1 ㎍을 혼합하고, 액체 질소에 넣어 2분 동안 얼린 후 37℃ 항온수조(water-bath)에서 5분 동안 녹여 주었다. 컴피턴트 셀을 가볍게 섞어준 후 액체 질소에서 다시 2분 동안 얼리고, 37℃ 항온수조에서 1분 동안 녹인 후 얼음에 30분 동안 방치하였다. 30분 후 YEP 액체배지 1 ㎖를 첨가하여 28℃ 배양기에서 수평으로 흔들어 주면서 2시간 동안 배양하고, 3,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상층액을 완전히 제거하였다. YEP 액체배지 100 ㎕를 첨가하여 펠렛을 충분히 풀어준 후 스펙티노마이신이 포함된 YEP 평판배지에 도말하고, 평판배지를 파라필름으로 밀봉하여 28℃에서 48시간 동안 배양하였다.
48시간 후에 YEP 평판배지에서 콜로니를 하나 취하여 스펙티노마이신이 포함된 YEP 액체배지에서 배양한 후 당업계에 알려진 알칼리 용해법을 이용하여 재조합 벡터 DNA를 추출하였다.
2-3. 애기장대 형질전환
pK2GW7 또는 pB7GWIWG2 재조합 벡터로 형질전환된 GV3101을 스펙티노마이신이 포함된 YEP 평판배지에서 2일 동안 배양한 후 콜로니 하나를 YEP 액체배지 2 ㎖에 접종하고, 28℃에서 100 내지 200 rpm으로 진탕배양하였다. 새로운 YEP 액체배지 50 ㎖에 GV3101 배양액 2 ㎖를 접종하여 20 내지 24시간 동안 배양하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전된 GV3101 펠렛에 IM(infiltration medium; 1/2 MS medium, 50 g/L sucrose, 0.5 g MES, pH 5.7, 사용하기 직전 silwet L-77 200 ㎕ 첨가)을 첨가하여 OD600이 1.2 내지 2.0이 되도록 혼합액을 만들고, 개화 시기 애기장대의 꽃대 및 잎 조직의 일정 부분을 혼합액에 담궈 약 1분 동안 침지시킨 후 깨끗한 비닐 봉투에 담아 밀봉하였다. 이후 28℃ 및 약광(dim light) 조건에서 2일 동안 방치한 뒤 비닐 봉투를 제거하고, 22℃ 및 일반 광조건에서 형질전환된 애기장대를 배양한 후 종자(형질전환 1세대 종자)를 수급하였다(화아침지법, floral dipping method).
화아침지법의 경우 심한 악취 등의 문제점이 있기에 당업게에 알려진 pipetting 방법을 이용한 꽃대 말단 부위에 형질전환을 시키는 방법도 사용하였다.
2-4. 형질전환체 선별
상기 2-3에서 수급한 형질전환 1세대 종자를 소독한 후 GM(germination medium; 1/2 MS medium, sucrose 10 g/ℓ, MES 0.5 g/ℓ, 9 g/ℓ phyto-agar, pH 5.7 with NaOH, kanamycin 10 ㎎/ℓ) 배지에 뭉치지 않게 뿌려주고, 파라필름으로 완전히 밀봉한 후 4℃에서 2 내지 3일 동안 순화처리하였다. 순화처리 후 16시간-8시간의 광주기 조건으로 22℃에서 배양하였다. 배양 1주차에 형질전환 개체는 뚜렷한 녹색으로 보이고, 야생형인 경우 연녹색으로 보였으며, 배양 2주차에는 형질전환 개체는 확실하게 식물체로 크지만 야생형인 경우 노랗게 되거나, 백화현상으로 고사하였다. 형질전환 개체는 배양 1주일 후에 토양으로 옮겨 배양하고, 배양 3주차에 염색체 DNA를 추출하여 PCR로 형질전환체 여부를 검증하였다.
형질전환체 선벽을 위한 다른 방법으로 BASTA(glufosinate ammonium)를 이용하였다. 멸균된 상토가 담긴 직경 8.5 cm의 모종용 화분에 200 내지 300개의 형질전환 1세대 종자를 뿌린 후 비닐봉투로 완전히 밀봉하여 4℃에서 3일 동안 순화처리하였다. 순화처리 후 16-8시간 광주기 조건으로 22℃에서 배양하고, 1주일 뒤 모든 개체가 발아하면 0.1% Basta 제초제를 골고루 뿌려주고, 2일에 한 번씩 총 4회 반복하였다.
2-5. 형질전환 애기장대의 염색체 DNA 추출 및 형질전환 여부 확인
식물 염색체 DNA를 추출하기 위하여 Grind buffer를 이용한 소량 genomic DNA 추출 방법을 이용하였다. Grind buffer는 Homogeniztion buffer(1 M NaCl, 0.2 M sucrose, 0.01 M EDTA, 0.03 M Tris-HCl, pH 8.0)와 Lysis buffer(0.25 M EDTA, 2.5% SDS, 0.5 M Tris-HCl, pH 9.2)를 4:1 비율로 섞어 만들었다.
막자사발에 애기장대 잎 100 ㎎을 넣은 후 액체질소를 부으면서 곱게 갈고, 애기장대 잎 분말을 e-tube로 옮긴 후 grind buffer 400 ㎕를 첨가하였다. 버퍼와 애기장대 잎 분말을 잘 섞어준 뒤 65℃에서 30분 동안 방치하고, 30분 후에 3 M potassium acetate(pH 4.7) 13 ㎕를 첨가하여 얼음에 30분 동안 방치하였다. 이후 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액만 회수하고, 회수한 상층액에 2 내지 2.5 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 잘 혼합시켰다. 상온에서 2분 동안 방치한 후 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액은 제거하고, 침전물은 70% 에탄올을 이용하여 세척한 후 얼음에 2분 동안 방치하였다. 이후 4℃에서 12,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 상층액을 완전히 제거하고, 침전물은 진공 원심분리기에서 10분 동안 건조시켰다. DDW 40 ㎕에 건조된 침전물을 녹인 후 RNase(10 ㎎/㎖) 1 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 1분 동안 반응시킨 후 PCR에 이용하였다.
구체적인 PCR 조건은 하기 표 4에 기재하였다.
PCR reaction mixture PCR reaction condition
dNTPs mixture 2.5 mM Denaturation 95℃, 5 min
Primer 10 pM
MgCl2 15 mM Denaturation 94℃, 1 min 30 cycles
KCl 50 mM
Tris-HCl(pH 9.0) 10 mM Annealing 55℃, 1 min
Triton X-100 0.1%(v/v)
Taq polymerase 0.5 U Extension 72℃, 1 min
DNA 1 ㎕ (150 ng)
Sterile water Final extension 72℃, 5 min
Total 20 ㎕
3. 형질전환 애기장대의 특성 확인
3-1. 배양 온도에 의한 형질전환 애기장대의 표현형 변화 분석
배양 온도에 의한 형질전환 애기장대의 개화 시기 및 잎의 개수 변화를 측정하기 위하여 3세대 형질전환 개체를 1/2 MS 평판배지에서 배양하고, 발아하는 즉시 화분에 50 개체를 옮겨 심었다. 16-8시간의 광주기 조건에서 온도를 각각 27℃, 22℃ 또는 17℃로 유지하면서 각 배양조건에서 개화시기를 측정하였고, 개화시기에 상단부 잎(rosette leave)의 개수를 측정하였다. 또한 모든 개체에서 개화가 시작한 시기부터 끝나는 시기까지 꽃대의 개수와 노화가 시작되는 시기까지의 결과를 기록하였다. 기록된 데이터를 이용하여 평균 개화시기 및 분산값, 평균 오차율 등을 분석하였다.
3-2. 형질전환 애기장대 유묘의 뿌리 및 하배축의 길이 측정
배양 온도에 의한 형질전환 애기장대의 개화 시기 및 잎의 개수 변화를 측정하기 위하여 3세대 형질전환 개체를 1/2 MS 평판배지에서 배양하여 발아하는 즉시 MS 평판배지(1% sucrose 포함)로 옮겨주었다. 총 20개의 평판배지에서 하나의 평판배지당 형질전환체 5개체씩 옮겨 총 3가지 다른 개체 종류를 배양하였다. 배양조건은 16-8시간 광주기, 50°의 기울기, 각각의 온도 조건인 27℃, 22℃ 및 17℃에서 지속적으로 배양하였으며, 1주차 및 2주차에서 하배축 및 뿌리의 길이를 측정하였다.
3-3. 유전자의 RNA 발현율 측정
각 온도 조건(27℃, 22℃ 및 17℃)에서 배양한 발아 후 2주 및 6주 시기의 형질전환 애기장대에서 상단부 잎 2 g을 수거하고, 당업계에 알려진 Phenol/SDS/LiCl 방법으로 총 RNA를 추출하였다. 정량 후, RNA 500 ng으로 cDNA를 합성하고, 각각의 개화 연관 유전자에 맞는 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물은 흡광도 측정과 전기영동으로 확인하여 RNA 발현율을 측정하였다. 대조군인 actin8 PCR 산물의 흡광도 평균값을 1로 기준하여 다른 개화 시기 관련 유전자들의 발현율을 산출하였다.
실험 결과
1. cDNA 서열 분석
PCR 산물의 경우 염기 서열 수준의 돌연변이가 쉽게 일어나는 단점이 있기 때문에 pDONR221 벡터에 삽입한 cDNA를 서열분석하였고, 그 결과 cDNA에서 1,000 bp당 평균적으로 약 1.2 bp의 변이가 나타난 것을 확인할 수 있었다. 비정상적 종결코드 혹은 틀이동 돌연변이가 발생한 cDNA가 삽입된 pDONR221 재조합 벡터는 제외하고, 기존 아미노산에서 친수성, 소수성, 산성, 염기 등의 변화가 없거나 또는 서열변화가 없는 cDNA가 삽입된 pDONR221 재조합 벡터를 Ti-vector(과발현용 pK2GW7 벡터 또는 knock out용 pB7GWIWG2 벡터) 제작에 이용하였다.
SVP 유전자는 723 bp 크기로 pDONR221-SVP 재조합 벡터 10개의 염기서열을 분석한 결과 99.99% 이상 서열이 일치하였으며, SVP 유전자 서열과 전체적으로 동일한 cDNA 및 일부 서열이 치환된 cDNA를 선정하였다. 이에 SVP 과발현체, mSVP 돌연변이체 및 svp 돌연변이체(RNAi 용도)를 선정하였다.
FLC 유전자는 591 bp 크기로 pDONR221-FLC 재조합 벡터 10개의 염기서열을 분석한 결과 10개 중에서 1개 벡터만이 치명적인 돌연변이체로 확인되어 제외하고, 9개는 염기서열이 동일하여 FLC 과발현체 형질전환에 사용하였다.
2. 형질전환 애기장대 제작 및 선별
2-1. 단백질 구조 분석을 통한 재조합 pDONR221 벡터 선별
cDNA 염기서열을 분석한 후 아미노산 서열이 동일한 비극성 혹은 극성 등을 가지고 있더라도 아미노산 곁사슬의 형태로 인해 단백질 구조에 오류가 발생할 수 있기 때문에 위해 단백질 구조 비교 모형(protein structure homology-modelling)을 이용하여 단백질의 3차원적 구조를 분석하고, 문제가 발생하지 않는 cDNA 서열만선별하여 Ti-vector(과발현용 pK2GW7 벡터 또는 knock out용 pB7GWIWG2 벡터) 제작에 이용하였다.
돌연변이 유전자 중 mSVP 돌연변이는 SVP 단백질에서 MADS-box 도메인에 해당하는 18번 아미노산이 극성인 글루타민(Gln)에서 비극성인 루신(Leu)으로 변형되었으나, 단백질 수준에서 3D 모델링을 한 경우 형태적으로 큰 문제점이 발생하지 않았다. 또한, MADS-box 도메인의 형태적 유사도를 비교한 결과 SVP 단백질은 형태적 유사값이 0.65(Gln)이고, mSVP 단백질은 0.63(Leu)으로 유사도가 감소하는 것을 확인하였다(도 1). 형태적 유사도가 감소하지만 구조적으로 정상적인 이량체가 형성될 것으로 예상되어 형질전환에 이용하였다.
도 1은 애기장대 유래의 SVP 및 mSVP(Q18L) 단백질의 3차원 구조와 형태적 유사도를 비교한 것으로, A 및 C는 SVP 단백질 결과, B 및 D는 mSVP 단백질 결과를 보여준다.
2-2. 제한효소 처리에 의한 Ti -vector 선별
Ti 바이너리 벡터의 경우 제한효소에 의한 접착성 절단 삽입부위가 길기 때문에 pDONR221에 삽입된 목적 DNA(insert DNA)를 각각의 조건에 맞는 Ti-vector에 삽입시킬 때 자체적으로 라이게이션(ligation)된 Ti-vector가 만들어질 수 있다. 따라서 재조합 벡터에 제한효소를 처리하여 목적 DNA의 삽입 여부를 확인하였다(도 2). 그 결과, pB7GWIWG2-FLC 재조합 벡터의 경우 1개 샘플에서 목적 DNA가 없는 것을 확인할 수 있었다.
도 2는 재조합 벡터에 제한효소를 처리하여 목적 DNA의 삽입 여부를 확인한 것으로, A는 재조합 pK2GW7 벡터, B는 재조합 pB7GWIWG2 결과를 보여주며, SM은 size marker를 의미한다.
목적 DNA가 올바르게 삽입되고, 단백질 모델링을 통하여 올바른 염기서열을 포함하는 것으로 확인된 재조합 벡터를 GV3101에 형질전환시켰다. 형질전환된 GV3101은 스펙티노마이신이 첨가된 YEP 고체 배지에서 2일 동안 배양하고, 선별하여 애기장대의 형질전환에 사용하였다(도 3).
도 3은 형질전환된 GV3101를 YEP 고체 배지에서 배양한 결과를 보여주는 사진으로, SVP는 과발현용 pK2GW7-SVP; FLC는 과발현용 pK2GW7-FLC; P-Control은 pBI121 벡터; svp는 RNAi용 pB7GWIWG2-svp; flc는 RNAi용 pB7GWIWG2-flc 및 mSVP는 과발현용 pK2GW7-mVP로 형질전환한 것을 의미한다.
2-3. 형질전환 애기장대 선별
카나마이신 선별의 경우 생존한 개체가 모두 형질전환체로 판별 되었지만 Basta 선별의 경우 실제로 검증된 비율은 생존개체에서 57.4%가 형질전환체가 아닌 것으로 확인되었다. 최종적으로 형질전환을 시도한 모든 개체 중에서 2.19% 만이 형질전환 개체로 판별되었다.
도 4는 GV3101로 형질전환한 애기장대를 선별하는 과정을 보여주고 있으며, A 내지 C는 카나마이신에 의한 선별, D 내지 F는 Basta를 이용한 선별이다. A 및 D는 대조군이고, B는 SVP 과발현체, C는 FLC 과발현체, E는 svp 돌연변이체 및 F는 flc 돌연변이체이다.
3. 형질전환된 애기장대의 특성 분석
3-1. SVP 및 FLC 과발현체와 svp 및 flc 돌연변이체의 표현형 및 생체량 분석
배양 온도 27℃, 16시간 광조건 및 8시간 암조건의 주기로 형질전환된 애기장대를 배양하여 표현형(개화시기, 생체량, 잎의 개수 등)을 분석하였다.
SVP, FLC 및 mSVP 과발현체와 svp, flc 돌연변이 식물체의 표현형을 분석하고자 1세대 형질전환체에서 세대 검증을 거쳐 3세대 종자의 형질전환체를 확보하여 애기장대의 잎(Rossete leaf), 꽃대(Internode stem), 꽃대의 분지가지(Branches of an internode) 및 꽃대의 잎(Cauline leaf)의 개수 등의 표현형과 개화시기에 따른 생체량의 변화를 분석 하였다. 애기장대 잎 개수의 경우 개체들의 개화기 중 생체량을 측정하기 위하여 개화가 시작되고 1주일 후의 개체를 선택하여 측정하였다.
애기장대 잎의 경우 개화 시기에 야생형은 16.54개, SVP 과발현체는 23.6개, FLC 과발현체는 21.64개, mSVP 과발현체는 19.32개, svp 돌연변이체는 10.06개 및 flc 돌연변이체는 15.47개로 측정되었다. 특히, 개화 직전 시기의 잎의 개수 및 생체량은 SVP 또는 FLC 과발현체가 야생형, mSVP 과발현체, svp 또는 flc 돌연변이 개체보다 많은 것을 알 수 있었다.
꽃대의 개수는 각각 야생형 1.7개, SVP 과발현체 2.3개, FLC 과발현체 2.2개, mSVP 과발현체 2.1개, svp 돌연변이체 1.4개 및 flc 돌연변이체 1.3개로 측정되었다. 꽃대 분지가지의 경우 각각 야생형 2.7개, SVP 과발현체 3.1개, FLC 과발현체 3.2개, mSVP는 2.9개, svp 돌연변이체와 flc 돌연변이체는 평균 1.7개와 1.5개였다. 꽃대의 잎은 보통 분지가지가 발생한 부위와 말단 부위에서 잎의 개수를 포함한 평균 개수는 야생형 2.9개 SVP 과발현체 3.5개, FLC 과발현체 3.1개, mSVP 2.8개 이며, svp 돌연변이체 2.5개, flc 돌연변이체는 2.3개로 과발현체보다 줄어든 경향이 있었다.
애기장대 형질전환체의 표현형 분석 결과를 하기 표 5에 기재하였다
표현형 야생형 SVP
과발현체		 svp
돌연변이체		 mSVP
과발현체		 FLC
과발현체		 flc
돌연변이체
애기장대 잎 16.54±0.51 23.6±0.83 10.06±0.85 19.32±0.42 21.64±0.77 15.47±0.54
꽃대 1.7±0.21 2.3±0.21 1.4±0.22 2.1±0.31 2.2±0.2 1.3±0.15
꽃대의 분지가지 2.7±0.21 3.1±0.23 1.7±0.21 2.9±0.16 3.2±0.13 1.5±0.22
꽃대의 잎 2.9±0.23 3.5±0.17 2.5±0.22 2.8?0.27 2.5±0.22 2.3±0.21
또한, 개화시기를 분석한 결과, svp 및 flc 돌연변이체는 발아 후 각각 37.3일 및 25.6일에 개화가 시작되었고, 야생형은 46.1일, SVP 과발현체는 야생형에 비해 약 15일이 증가한 61.8일에 개화가 시작되는 것을 확인하였다. mSVP 과발현체의 개화시기는 32.1일로 기존의 SVP 과발현체나 svp 돌연변이체보다 개화시기가 빠른 것을 알 수 있었다. 또한, svp 및 flc 돌연변이체의 경우 개화시기는 빨라지지만 야생형의 개화시기에 측정되는 생체량 및 종자의 수확은 svp 돌연변이체가 현저히 뛰어나고, flc 돌연변이체는 생체량 및 종자수도 더욱 떨어지는 것을 알 수 있었다. SVP 및 FLC 과발현체의 경우 개화시기가 늦어지기 때문에 개화 소요일당 생체량은 오히려 떨어지는 것을 확인하였다.
야생형의 개화시기인 46.1일에 건물량(dry weight)이 29.5 ㎎인 경우를 100% 라고 가정할 때 야생형의 생장률은 100%이고, SVP, mSVP 및 FLC 과발현체의 생장률은 각각 95.59%, 131.3% 및 80.98%인 것을 확인하였다. svp 및 flc 돌연변이체는 각각 111% 및 55.55%의 생장률을 보여주었다. 표 6에 나타난 것과 같이 생장률은 mSVP 과발현체가 가장 높고, flc 돌연변이체는 개화시기는 가장 빠르나 생장률은 낮은 것을 확인할 수 있었다.
야생형 SVP 과발현체 svp
돌연변이체		 mSVP
과발현체		 FLC
과발현체		 flc
돌연변이체
건물량 (㎎) 29.5 37.8 26.5 27.1 32.7 9.1
개화시기 (day) 46.1 61.8 37.3 32.1 63.1 25.6
생장률 (%) 100 95.6 111 131.3 81 55.5
3-2. svp 및 mSVP 돌연변이체에서 온도 변화에 의한 개화시기 및 생체량 변화 분석
야생형 애기장대, svp 돌연변이체 및 mSVP 돌연변이체 각각을 17℃, 22℃ 및 27℃에서 배양하면서 2일 단위로 생체량 및 개화시기를 측정하고, 표현형을 확인였다.
27℃에서 배양한 경우 야생형은 평균 37.1일에 개화가 시작되었고, mSVP 돌연변이체는 31일, svp 돌연변이체는 32.4일에 개화가 시작되어 돌연변이체가 5 내지 6일 정도 빨리 개화되는 것을 알 수 있었다. 개화시기 잎의 개수는 야생형은 8.67개, mSVP 돌연변이체는 3.85개, svp 돌연변이체는 5.4개였다.
22℃에서 배양한 경우 야생형은 47.48일에 개화가 시작되었고, mSVP 돌연변이체는 33.2일, svp 돌연변이체는 38.37일에 개화가 시작되었다. 개화시기 잎의 개수는 야생형은 12.89개, mSVP 돌연변이체는 5.23개 및 svp 돌연변이체는 8.12개였다.
17℃에서 배양한 경우 야생형은 평균 62.75일에 개화가 시작되고, mSVP 돌연변이체는 47.96일, svp 돌연변이체는 58.93일에 개화가 시작되어 야생형과 비교하여 mSVP 돌연변이체의 개화시기가 약 15일 정도 빠른 것을 알 수 있었다. 또한, 잎의 개수에 의한 개화시기를 비교할 경우 mSVP 돌연변이체는 18.6개의 잎(Rosette leave)이 있는 시기에 개화가 시작되고, svp 돌연변이체는 22.3개, 야생형은 25.3개의 잎이 있는 시기에 개화가 시작되어 차이가 있는 것을 알 수 있다.
돌연변이 식물체의 개화시기는 야생형과 마찬가지로 온도에 좌우되는데 svp 돌연변이체는 27℃에서는 mSVP 돌연변이체에 가까운 개화시기를 보이나 22℃에서는 개화 시기가 늦어지고, 17℃에서는 오히려 야생형에 가까운 개화시기를 보였다. 반면 mSVP 돌연변이체는 22℃까지는 빠른 개화시기를 보이나 야생형의 개화시기 증가 기간과 비슷하게 개화기간이 증가하였다. 그러나 장일 식물의 경우 저온 상태에서는 개화시기가 강력하게 억제되는 것을 고려하면 mSVP 돌연변이체의 개화시기가 많이 줄어들지 않았음을 알 수 있다. 즉 17℃에서 mSVP 돌연변이체는 22℃에서 배양한 야생형과 비슷한 개화시기를 보이는 것을 알 수 있다. 또한 17℃에서 야생형이 개화시기에 mSVP 돌연변이체는 노화가 시작되는 것을 알 수 있으며, mSVP 돌연변이체가 야생형 및 svp 돌연변이체보다 생장주기가 더 짧고, 종자수도 야생형보다 52.5% 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
종자 수확량의 경우 야생형은 개체당 평균 0.25 g, mSVP 돌연변이체는 평균 0.41 g, svp 돌연변이체는 평균 0.18 g의 종자를 수확하여 mSVP 돌연변이체의 종자 생산량이 야생형과 비교하여 64% 우수한 것을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통하여 모든 배양 온도에서 mSVP 돌연변이체는 개화시기까지 야생형이나 svp 돌연변이체보다 높은 생장율을 보였으며, 개화시기도 야생형이나 svp 돌연변이체보다 빠른 것을 알 수 있었다. 시기별 생장율을 비교하면 mSVP 돌연변이체가 svp 돌연변이체보다 생장율이 높고, 생체량 또한 야생형보다 많기 때문에 종자의 수 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5 내지 7은 애기장대 배양 결과를 보여주는 사진으로, 도 5는 발아 후 1주, 도 7은 발아 후 2주 및 도 9는 발아 후 3주 동안 배양한 사진이다.
도 8은 mSVP 돌연변이체의 개화시기를 보여주는 사진으로, 27℃에서는 배양 후 18일에 최초로 개화하였고, 22℃ 및 17℃에서는 각각 24일 및 47일에 최초로 개화하였다.
도 9는 배양 온도에 따른 야생형 및 돌연변이 애기장대의 평균 개화시기를 보여주는 그래프이다.
표 7 내지 9는 야생형, mSVP 돌연변이체 및 svp 돌연변이체의 개체별 개화시기를 정리한 것으로, 표 7은 27℃, 표 8은 22℃, 표 9는 17℃에서 배양한 것이다.
Days after
germination

Transformants		 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 N M V s SE
Wild-type 0 0 1 0 1 1 3 8 6 4 5 6 4 4 3 1 0 1 48 37.13 37.77 6.15 6.93
35S:mSVP 1 1 3 7 1 4 9 7 4 2 3 3 2 1 1 0 0 0 49 31.02 43.02 6.56 7
svp 0 0 1 3 1 1 11 8 4 2 5 2 2 0 0 0 0 0 40 32.4 24.04 4.903 6.32
Days after
germination

Transformants		 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 N M V s SE
Wild-type 0 0 0 0 1 0 1 1 1 5 9 5 4 3 5 2 1 0 2 1 1 42 47.48 45.47 6.74 1.04
35S:mSVP 3 0 2 7 8 10 3 3 1 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 40 33.2 23.34 4.83 0.76
svp 0 0 0 2 5 7 5 3 5 9 3 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 43 38.37 24.62 4.96 0.76
Days after
germination

Transformants		 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 N M V s SE
Wild-type 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 2 3 5 7 6 5 4 1 2 0 1 40 62.75 28.65 5.35 0.85
35S:mSVP 1 0 1 2 5 16 4 6 4 1 2 1 0 1 0 2 1 1 0 0 1 0 49 47.96 64.58 8.04 1.14
svp 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 3 4 8 4 3 7 3 2 1 0 0 0 41 58.93 38.62 6.21 0.97
(상기 표 7 내지 9에서 N은 샘플수(total plant number); M은 평균(average); V는 분산(variance); S는 표준편차(standard deviation); 및 SE는 표준오차(sndard error of mean)를 의미한다.
3-3. svp 및 mSVP 돌연변이체에서 온도 변화에 의한 유전자 발현 변화 분석
mSVP 돌연변이체 및 svp 돌연변이체는 야생형과 비교하여 각 온도 조건에서 개화시기가 빠르기 때문에 개화 연관 유전자인 LHP1, FRI, VRN-like, FLM-1, 2, 3, EFM 및 JMJ30을 선정하여 RNA의 발현 변화를 확인하였다.
개화가 시작되지 않은 발아 3주차의 mSVP 돌연변이체, svp 돌연변이체 및 야생형 애기장대에서 각각 잎을 3g씩 채취한 후 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 표 3에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 대조군으로는 actin8을 이용하였다.
도 10 및 도 11은 개화 연관 유전자들의 cDNA를 PCR로 증폭한 결과를 UV illumination으로 수치화한 그래프이다.
LHP1은 야생형 및 mSVP 돌연변이체에서 비슷한 발현 정도를 보이고, svp 돌연변이체는 17℃에서는 발현 정도가 비슷하지만 22℃ 및 27℃에서는 1/2 정도 발현이 억제되었다.
FRI는 야생형의 경우 저온에서 고온으로 올라 갈수록 발현율이 증가하지만, mSVP 돌연변이체는 17℃에서 야생형보다 발현이 50% 정도 억제되고, 22℃에서는 야생형과 비슷하고, 27℃에서는 17℃와 마찬가지로 억제되었다.
VRN-like의 발현율은 전체적으로 약하게 발현되며, FLM1 유전자는 22℃일 경우 svp돌연변이체에서 억제되었다.
FLM2는 야생형의 경우 27℃에서 억제되는 것과 유사하게 mSVP 돌연변이체나 svp 돌연변이 개체에서 억제되었다.
FLM3는 야생형의 경우 저온일 경우에 발현이 억제되지만 22℃에서 27℃로 온도가 증가될수록 발현율도 증가하며, mSVP 돌연변이체도 야생형과 비슷한 발현율을 보였다. 그러나 svp 돌연변이체는 온도가 상승함에 따라 발현이 억제되었다.
EFM은 저온에서 고온으로 올라갈 경우 야생형은 발현율이 증가하지만 mSVP 돌연변이체는 22℃에서만 발현이 촉진되었으며, 반대로 svp 돌연변이체는 22℃에서 발현이 억제되었다.
JMJ30은 야생형의 경우 22℃에서 발현이 촉진되었으며, mSVP 돌연변이체 또한 마찬가지로 22℃에서 발현이 촉진되었다. 그러나 17℃ 및 27℃에서의 발현율은 야생형에 비해 증가하였다. 반면에 svp 돌연변이체는 17℃ 및 27℃에서 발현이 더욱 증가하였으며, 22℃에서는 발현이 억제되었다.
상기 결과들을 통하여 mSVP 돌연변이체에서 발현 정도가 변하는 유전자는 FRI, FLM2, EFM 및 JMJ30인 것을 확인할 수 있었으며, svp 돌연변이체에서는 LHP1, FLM1, FLM3 및 JMJ30의 발현 정도가 변하는 것을 알 수 있었다.
3-4. 형질전환 개체에서 유전자 수준에서의 전사율 조절 분석
개화시기와 연관된 유전자를 과발현 시켰을 경우 연관된 유전자를 분석하기 용이하기 때문에 각각의 과발현 개체인 LHP1, SVP1, FLC1, FRI, VRN2-like, FLM2, EFM 및 mSVP 과발현체에서 RNA 수준의 발현 변화를 측정하였다. PCR 산물을 전기영동한 후 UV illumination를 이용하여 PCR 산물의 양을 수치화하였다.
도 12 내지 15는 개화 연관 유전자의 과발현 개체에서 개화 연관 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
야생형 애기장대의 경우 SVP1 및 SVP2의 발현비율이 0.18 내지 0.21 수준임을 알 수 있었고, SVP1의 과발현체의 경우 SVP1 및 SVP2의 발현이 야생형에 비해 1.5배 정도 증가하였으나 큰 비율로 증가하지 않는 것을 확인하여 개화 시기에는 SVP 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다(도 12). 또한, SVP1의 과발현체의 경우 야생형과 비교하여 FLC4, FLC1, FLM2 및 FLM3의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12 내지 도 14).
mSVP 과발현체의 경우 유전자의 발현 양상이 SVP 과발현체와 상이하게 나타났다. SVP1 과발현체에서 SVP1 발현비율은 0.29인 반면에 mSVP 과발현체에서는 0.87이었고, SVP2 발현비율의 경우 SVP1 과발현체는 0.28인 반면 mSVP 과발현체에서는 SVP2 유전자는 2.14로 현저하게 과량으로 발현되었다(도 12). 이는 개화시기에 SVP1 과발현체에서는 SVP의 발현이 RNA 수준에서 억제되나, mSVP 과발현체의 경우 RNA 수준의 발현 억제가 개화시기와 무관하다는 것을 의미한다.
또한, SVP 과발현체 및 mSVP 과발현체에서 FLC1의 발현비율은 비슷하나 FLC4 및 FLM3의 발현비율은 mSVP 과발현체에서 감소하였고, SVP 과발현체와 달리 mSVP 과발현체에서는 EFM의 발현 비율이 현저하게 증가하였다(도 12 내지 도 14).
상기 유전자 발현 분석 결과를 통하여 mSVP 돌연변이체는 SVP-FLC 사이의 상호작용이 불가능하여 개화가 촉진되고, 개화 이후의 FLC 발현은 SVP 발현과 별도로 작동하기 때문에 mSVP 돌연변이체의 개화 후 생장률은 야생형의 개화 전 생장률과 비슷한 것을 알 수 있었다. 또한, mSVP 돌연변이체의 경우 FLM의 발현 비율이 SVP 과발현체보다 낮아 정상적으로 mSVP를 조절하는 것이 불가능하기 때문에 mSVP 유전자가 지속적으로 발현되는 것으로 판단된다.
mSVP 돌연변이체는 개화시기가 촉진되고, 개화 후에도 지속적인 성장이 이루어지는 것을 특징으로 하며, 이는 SVP의 MADS-box 도메인에 발생한 돌연변이에 의하여 식물체의 정상적인 개화 조절이 이루어지지 않는 것을 의미한다. 따라서, 상기 MADS-box 도메인에 발생한 돌연변이를 재배작물에 적용할 경우 수확시기 단축 및 생산량 증가 등의 이점을 얻을 수 있을 것이다. 즉, MADS-box 도메인의 'RQVTFSKRRRGLFKKAEEL'서열(서열번호 72)에서 두번째 아미노산인 글루타민(glutamine, Q)을 루신(leucin, L)으로 변형하여 특정 유전자의 과발현체나 돌연변이체가 가지는 한계를 벗어날 수 있으며, 외래유전자를 도입함으로써 발생하는 위험을 줄일 수 있다.
도 16는 야생형 애기장대에서 개화 관련 유전자들의 조절 기작을 개략적으로 보여주는 것이다.
도 17은 RNA 발현 분석 결과를 이용하여 mSVP 돌연변이체의 유전자 조절 기작을 개략적으로 보여주는 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Mokpo National University <120> Method For Controlling Flowering Time of Plants using MADS-box Gene and Plants Thereof <130> PN170016 <160> 90 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 722 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggcgagag aaaagattca gatcaggaag atcgacaacg caacggcgag acaagtgacg 60 ttttcgaaac gaagaagagg gcttttcaag aaagctgaag aactctccgt tctctgcgac 120 gccgatgtcg ctctcatcat cttctcttcc accggaaaac tgttcgagtt ctgtagctcc 180 agcatgaagg aagtcctaga gaggcataac ttgcagtcaa agaacttgga gaagcttgat 240 cagccatctc ttgagttaca gctggttgag aacagtgatc acgcccgaat gagtaaagaa 300 attgcggaca agagccaccg actaaggcaa atgagaggag aggaacttca aggacttgac 360 attgaagagc ttcagcagct agagaaggcc cttgaaactg tttgacgcgt gtgattgaaa 420 caaagagtga caagattatg agtgagatca gcgaacttca gaaaaaggga atgcaattga 480 tggatgagaa caagcggttg aggcagcaag gaacgcaact aacggaagag aacgagcgac 540 ttggcatgca aatatgtaac aatgtgcatg cacacggtgg tgctgaatcg gagaacgctg 600 ctgtgtacga ggaaggacag tcgtcggagt ctattactaa cgccggaaac tctaccggag 660 cgcctgttga ctccgagagc tccgacactt cccttaggct cggcttaccg tatggtggtt 720 ag 722 <210> 2 <211> 722 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> mutation <222> (53) <223> A53T <400> 2 atggcgagag aaaagattca gatcaggaag atcgacaacg caacggcgag actagtgacg 60 ttttcgaaac gaagaagagg gcttttcaag aaagctgaag aactctccgt tctctgcgac 120 gccgatgtcg ctctcatcat cttctcttcc accggaaaac tgttcgagtt ctgtagctcc 180 agcatgaagg aagtcctaga gaggcataac ttgcagtcaa agaacttgga gaagcttgat 240 cagccatctc ttgagttaca gctggttgag aacagtgatc acgcccgaat gagtaaagaa 300 attgcggaca agagccaccg actaaggcaa atgagaggag aggaacttca aggacttgac 360 attgaagagc ttcagcagct agagaaggcc cttgaaactg tttgacgcgt gtgattgaaa 420 caaagagtga caagattatg agtgagatca gcgaacttca gaaaaaggga atgcaattga 480 tggatgagaa caagcggttg aggcagcaag gaacgcaact aacggaagag aacgagcgac 540 ttggcatgca aatatgtaac aatgtgcatg cacacggtgg tgctgaatcg gagaacgctg 600 ctgtgtacga ggaaggacag tcgtcggagt ctattactaa cgccggaaac tctaccggag 660 cgcctgttga ctccgagagc tccgacactt cccttaggct cggcttaccg tatggtggtt 720 ag 722 <210> 3 <211> 240 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu Glu Leu Gln Leu Val Glu Asn Ser Asp His Ala Arg 85 90 95 Met Ser Lys Glu Ile Ala Asp Lys Ser His Arg Leu Arg Gln Met Arg 100 105 110 Gly Glu Glu Leu Gln Gly Leu Asp Ile Glu Glu Leu Gln Gln Leu Glu 115 120 125 Lys Ala Leu Glu Thr Gly Leu Thr Arg Val Ile Glu Thr Lys Ser Asp 130 135 140 Lys Ile Met Ser Glu Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Gly Met Gln Leu 145 150 155 160 Met Asp Glu Asn Lys Arg Leu Arg Gln Gln Gly Thr Gln Leu Thr Glu 165 170 175 Glu Asn Glu Arg Leu Gly Met Gln Ile Cys Asn Asn Val His Ala His 180 185 190 Gly Gly Ala Glu Ser Glu Asn Ala Ala Val Tyr Glu Glu Gly Gln Ser 195 200 205 Ser Glu Ser Ile Thr Asn Ala Gly Asn Ser Thr Gly Ala Pro Val Asp 210 215 220 Ser Glu Ser Ser Asp Thr Ser Leu Arg Leu Gly Leu Pro Tyr Gly Gly 225 230 235 240 <210> 4 <211> 722 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide <220> <221> MUTAGEN <222> (18) <223> Q18L <400> 4 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 355 360 365 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 530 535 540 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 545 550 555 560 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 565 570 575 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 580 585 590 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 595 600 605 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 610 615 620 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 625 630 635 640 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 645 650 655 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 660 665 670 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 675 680 685 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 690 695 700 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 705 710 715 720 Ala Ala <210> 5 <211> 82 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Boechera stricta <400> 5 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro <210> 6 <211> 84 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Brachypodium stacei <400> 6 Met Ala Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Glu Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Ala 35 40 45 Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met 50 55 60 Asn Gln Ile Ile Asp Arg Tyr Asn Ser His Ser Lys Ile Leu Gln Arg 65 70 75 80 Ala Asp Glu Pro <210> 7 <211> 86 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 7 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Asn Ser Ser Met Arg Glu 50 55 60 Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu Glu Leu 85 <210> 8 <211> 84 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 8 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Ser Ser Ser Met Arg Glu 50 55 60 Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 9 <211> 86 <212> PRT <213> Brassica rapa <400> 9 Met Ala Arg Glu Lys Ile Arg Ile Lys Lys Ile Asp Asn Leu Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Ile Ile Lys Lys Ala 20 25 30 Asn Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly 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sinensis <400> 14 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ile Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Val Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Glu Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ile Thr 50 55 60 Leu Trp Phe His Lys Ser Ser His Ile Thr Ser Phe Leu Glu Ser Lys 65 70 75 80 Met Lys Val Lys Lys Ala Tyr 85 <210> 15 <211> 83 <212> PRT <213> Citrus sinensis <400> 15 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ile Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Val Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Glu Ser Ser Ser Ser Ser Met Lys Asp 50 55 60 Ile Ile Ala Arg Tyr Asn Met His Ser Ser Asn Ile Ser Lys Leu Asn 65 70 75 80 His Pro Ser <210> 16 <211> 86 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Capsella grandiflora <400> 16 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Thr Asn Ala 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Ser Ser Ser Ser Met Asn Asp 50 55 60 Ile Val Thr Lys Tyr Ser Thr His Ser His Gly Ile Asn Lys Leu Asp 65 70 75 80 Lys Pro Ser <210> 21 <211> 82 <212> PRT <213> Gossypium raimondii <400> 21 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Lys Lys Ile Asp Asn Leu Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Ala Ser Ser Ser Met Lys Asp 50 55 60 Thr Leu Gly Arg Tyr Asn Leu His Ser Ser Asn Ile Asn Lys Leu Gly 65 70 75 80 Gln Pro <210> 22 <211> 82 <212> PRT <213> Gossypium raimondii <400> 22 Met Ser Leu Asp Trp Val Ser Ile Asn Ser Asn Pro Gly Ser Glu Met 1 5 10 15 Thr Arg Gln Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Asp Asn Thr Ala Ala Arg 20 25 30 Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala Tyr 35 40 45 Glu Leu Ser Thr Leu Cys Asp Ala Glu Ile Ala Leu Leu Val Phe Ser 50 55 60 Asn Thr Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Ser Thr Ser Thr Arg Gln Val 65 70 75 80 Ile 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laxiflora <400> 25 Met Ser Val Asn Ser Met Asp Phe Phe Lys Lys Asn Val Pro His Arg 1 5 10 15 Leu Glu Arg Glu Lys Arg Val Ser Glu Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln 20 25 30 Ile Lys Lys Ile Asp Asn Thr Thr Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys 35 40 45 Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala Glu Glu Leu Ala Val Leu Cys 50 55 60 Asp Ala Asp Val Gly Leu Val Val Phe Ser Ser Thr Gly Lys Cys Phe 65 70 75 80 Glu Tyr Ser <210> 26 <211> 83 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Kalanchoe laxiflora <400> 26 Met Ser Val Asn Ser Met Asp Phe Phe Lys Lys Asn Val Pro His Arg 1 5 10 15 Leu Glu Arg Glu Lys Arg Val Ser Glu Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln 20 25 30 Ile Lys Lys Ile Asp Asn Thr Thr Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys 35 40 45 Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala Glu Glu Leu Ala Val Leu Cys 50 55 60 Asp Ala Asp Val Gly Leu Val Val Phe Ser Ser Thr Gly Lys Cys Phe 65 70 75 80 Glu Tyr Ser <210> 27 <211> 83 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Kalanchoe laxiflora <400> 27 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Leu Lys Lys Ile Asn Asn 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Ile Asp Arg Tyr Asp Ser His Ser Lys Thr Leu Gln Lys 65 70 75 80 Ser Glu Ala Ser <210> 45 <211> 84 <212> PRT <213> Setaria viridis <400> 45 Met Ala Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Asp Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Val 35 40 45 Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Asn Phe Ala Ser Ser Ser Met 50 55 60 Lys Gln Ile Ile Asp Arg Tyr Asp Ser His Ser Lys Thr Leu Gln Lys 65 70 75 80 Ser Glu Ala Ser <210> 46 <211> 84 <212> PRT <213> Setaria viridis <400> 46 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 47 <211> 84 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 47 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser His Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Asn Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 48 <211> 83 <212> PRT <213> Vitis vinifera <400> 48 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Ile Leu Glu Lys His Ser Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser <210> 49 <211> 83 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Vitis vinifera Genoscope <400> 49 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Arg Lys Ile Asp Asn Val Ser Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Met Lys Asp 50 55 60 Ile Leu Gly Arg Tyr Thr Met His Ser Asn Asn Leu Glu Lys Leu Glu 65 70 75 80 Gly Pro Ser <210> 50 <211> 83 <212> PRT <213> Zea mays <400> 50 Met Val Gly Thr Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Asp 1 5 10 15 Asn Leu Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu 20 25 30 Phe Lys Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly 35 40 45 Leu Val Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe His Phe Ala Ser Ser 50 55 60 Ser Met Lys Gln Val Ile Asp Arg Tyr Asp Ser His Ser Lys Thr Leu 65 70 75 80 Gln Arg Ser <210> 51 <211> 86 <212> PRT <213> Brachypodium distachyon <400> 51 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Arg Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Val Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Ser Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ser Asp 65 70 75 80 Gln Gln Pro Ser Ile Asp 85 <210> 52 <211> 84 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Brachypodium stacei <400> 52 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Arg Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Val Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Ser Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ser Asp 65 70 75 80 Gln Gln Pro Ser <210> 53 <211> 84 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 53 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Arg Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Cys Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Val Leu Glu Arg His Asn Leu Gln Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 54 <211> 86 <212> PRT <213> Brachypodium distachyon <400> 54 Met Ala Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Glu Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Ala 35 40 45 Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met 50 55 60 Asn Gln Ile Ile Asp Arg Tyr Asn Ser His Ser Lys Ile Leu Gln Arg 65 70 75 80 Ala Asp Glu Pro Ser Gln 85 <210> 55 <211> 84 <212> PRT <213> Brachypodium distachyon <400> 55 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Ser Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Asp 65 70 75 80 Lys Pro Ser Leu <210> 56 <211> 84 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Kalanchoe laxiflora <400> 56 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Ser Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Asp 65 70 75 80 Lys Pro Ser Leu <210> 57 <211> 84 <212> PRT <213> Musa acuminata <400> 57 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Ser Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Ile Leu Glu Lys His Thr Thr His Ser Lys Asn Leu Glu Lys Ala Glu 65 70 75 80 Ala Pro Leu Ile <210> 58 <211> 84 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 58 Met Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Glu Gly Glu Gly Arg 1 5 10 15 Ala Ala Thr Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Asp Asn 20 25 30 Leu Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe 35 40 45 Lys Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu 50 55 60 Val Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Gln Phe Ala Ser Thr Ser 65 70 75 80 Met Glu Gln Ile <210> 59 <211> 84 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 59 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser His Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Asn Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 60 <211> 96 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Kalanchoe laxiflora <400> 60 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu Asp Leu Asn Leu Glu His Ser Lys Tyr Ala Asn Leu 85 90 95 <210> 61 <211> 86 <212> PRT <213> Panicum virgatum <400> 61 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Pro Pro Ser Leu Asp Leu 85 <210> 62 <211> 85 <212> PRT <213> Panicum virgatum <400> 62 Met Val Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Ala Lys Tyr Asn Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Glu Glu 65 70 75 80 Pro Pro Ser Leu Asp 85 <210> 63 <211> 80 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Salix purpurea <400> 63 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Lys Lys Ile Asp Asn Val Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Val Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Ser Ser Ser Met Lys Asp 50 55 60 Val Leu Ala Arg Tyr Asn Leu His Ser Asn Asn Leu Asp Lys Ile Asn 65 70 75 80 <210> 64 <211> 84 <212> PRT <213> Setaria italica <400> 64 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Asn Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 65 <211> 80 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 65 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Asp Asn Ser Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Asp Tyr Cys Asn Ser Ser Met Lys Gln 50 55 60 Ile Leu Glu Arg Arg Asp Leu His Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 <210> 66 <211> 80 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 66 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Lys Lys Ile Asp Asn Ile Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Asp Phe Ala Ser Thr Ser Met Lys Asp 50 55 60 Ile Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Gln Ser Ala Ser Leu Glu Lys Val Asp 65 70 75 80 <210> 67 <211> 82 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <400> 67 Met Ala Gly Lys Arg Glu Arg Ile Ala Ile Arg Arg Ile Asp Asn Leu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys 20 25 30 Lys Ala Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Val 35 40 45 Val Phe Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe His Phe Ala Ser Thr Ser Met 50 55 60 Lys Gln Val Ile Asp Arg Tyr Asp Ser His Ser Lys Asn Leu Gln Lys 65 70 75 80 Ser Glu <210> 68 <211> 85 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Spirodela polyrhiza <400> 68 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Arg Lys Ile Glu Asn Thr Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Val Ile Val Val 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Ser Asn Ser Met Lys Glu 50 55 60 Thr Ile Asn Arg Arg Asn Lys His Leu Arg Asp Asp Leu Glu Ser Val 65 70 75 80 Pro Pro Ser His Glu 85 <210> 69 <211> 84 <212> PRT <213> Theobroma cacao <400> 69 Met Ala Arg Glu Lys Ile Gln Ile Lys Lys Ile Asp Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Ile Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Val Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Phe Gln Tyr Ala Ser Ser Ser Met Lys Glu 50 55 60 Ile Leu Glu Arg His Asn Leu His Ser Lys Asn Leu Glu Lys Leu Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 70 <211> 84 <212> PRT <213> Theobroma cacao <400> 70 Met Ala Arg Glu Lys Ile Lys Ile Arg Lys Ile Asp Asn Val Thr Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe 35 40 45 Ser Ala Thr Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ala Ser Ser Ser Met Arg Asp 50 55 60 Ile Leu Gly Arg Tyr Asn Val His Ser Asn Asn Leu Asn Lys Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Ser Leu <210> 71 <211> 83 <212> PRT <213> Zea mays <400> 71 Met Ala Arg Glu Arg Arg Glu Ile Lys Arg Ile Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Asp Val Ala Leu Ile Val Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu Ser Gln Phe Ala Ser Ser Ser Met Asn Glu 50 55 60 Ile Ile Asp Lys Tyr Ser Thr His Ser Lys Asn Leu Gly Lys Ala Glu 65 70 75 80 Gln Pro Ser <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> MUTAGEN <222> (2) <223> Q2L <400> 72 Arg Leu Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Ala 1 5 10 15 Glu Glu Leu <210> 73 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 73 aaaaagcagg ctggatgaaa ggggcaagtg gtgc 34 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 74 agaaagctgg gtgaggcgtt cgattgtact tga 33 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 75 aaaaagcagg ctggatggcg agagaaaaga ttca 34 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 76 agaaagctgg gtgaccacca tacggtaagc cga 33 <210> 77 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 77 aaaagcaggc tgggttcgag ttctgtagct cc 32 <210> 78 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 78 agaaagctgg gtgtttgact gcaagttatg c 31 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 79 aaaaagcagg ctggatggga agaaaaaaac taga 34 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 80 agaaagctgg gtgattagta gtgggagagt ca 32 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 81 aaaaagcagg ctgggagatg tcacctgctg gac 33 <210> 82 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 82 agaaagctgg gtgattaaga agtgggagag t 31 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 83 aaaaagcagg ctggatgtcc aattatccac cgac 34 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 84 agaaagctgg gtgtacctga aactgtgacc gct 33 <210> 85 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 85 aaaaagcagg ctggatggac aggtacaagt taat 34 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 86 agaaagctgg gtgtccggcg actttcctag agt 33 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 87 aaaaagcagg ctggatggga agaagaaaaa tcg 33 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 88 agaaagctgg gtgctaattg agcagcggga g 31 <210> 89 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 89 aaaaagcagg ctggatggcg tcctcatcag aact 34 <210> 90 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 90 agaaagctgg gtgttagaat ttgagagtta ttt 33

Claims (9)

  1. 돌연변이 MADS-box 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로서, 상기 돌연변이 MADS-box 단백질은 하기 일반식 I의 아미노산 서열에서 2번째 아미노산인 글루타민이 루신으로 치환된 MADS-box 도메인을 포함하는 것인 재조합 벡터:
    [일반식 I]
    Arg-Gln-Val-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Lys-Arg
    상기 일반식 I에서 Xaa1은 Thr 또는 Ser이고,
    Xaa2는 Phe, Tyr 및 Leu으로 이루어진 군에서 선택되며,
    Xaa3는 Ser, Phe, Leu, Ala 및 Thr로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MADS-box 도메인은 서열번호 72의 아미노산 서열인 것인 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 MADS-box 단백질은 SVP(Short Vegetative Phase), AGL(AGAMOUS-like) 및 MADS-box 전사인자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 SVP 단백질은 서열번호 5 내지 50으로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 AGL 단백질은 서열번호 51 및 52로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 벡터.
  6. 제3항에 있어서, 상기 MADS-box 전사인자는 서열번호 53 내지 71로 이루어진 군에서 선택되는 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 벡터.
  7. 제1항의 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 및
    상기 재조합 벡터를 도입한 식물체에서 돌연변이 MADS-box 단백질을 발현하는 식물체를 회수하는 단계를 포함하는 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법.
  8. 제7항의 방법에 의하여 제조된 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 SVP1(Short Vegetative Phase 1), SVP2(Short Vegetative Phase 2) 및 EFM(early flowering MYB)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현이 증가된 것인 식물체.
KR1020170026771A 2017-02-28 2017-02-28 MADS-box 단백질을 이용하여 식물체의 개화시기를 촉진하는 방법 및 그에 따른 개화시기가 촉진된 식물체 KR101810356B1 (ko)

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