CN110628789A - 一种抗虫低酚棉花品种的育种方法 - Google Patents

一种抗虫低酚棉花品种的育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，属于基因工程技术领域，包括对CAD1‑A基因进行克隆，得CAD1‑A‑1质粒；构建CAD1‑A基因的RNAi表达载体；采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；其中，RNAi表达载体中CAD1‑A基因由α‑球蛋白启动子驱动，α‑球蛋白启动子用Enh Ⅰ增强子进行修饰。该方法能够抑制Bt基因启动子及CAD1‑A基因种子特殊启动子的甲基化，从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1‑A基因转录水平的降低；能够减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。

Description

一种抗虫低酚棉花品种的育种方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗虫低酚棉花品种的育种方法。
背景技术
棉酚对细菌、真菌、昆虫等均具有毒性，是棉花防御机制的重要组成部分。然而，棉酚容易破坏人和单胃动物的胃粘膜，引起消化功能的紊乱，这成为长期阻碍人们更好地开发和利用棉籽的重要原因。虽然棉酚可经物理、化学等方法去除，但工艺复杂、投资大、耗能多、成本高，而且经过这些方法处理的棉籽饼，营养成分都有不同程度的丢失，其食用安全性也会降低。因此，世界各国的育种专家相继展开了低酚棉育种工作，希望通过遗传育种的手段能够选育出低酚的棉花新品种，使棉花不仅能生产纤维，还能生产可供直接利用的棉籽蛋白和棉籽油，成为棉粮油三位一体的新型作物。但是由于常规育种获得的低酚棉品种植株没有棉酚而导致抗虫性差，易受叶食性害虫以及鼠、兔的危害，在应用推广上受到了极大的限制。因此，后来的育种目标自然就集中在了棉株高酚而降低棉籽的棉酚含量的品种选育。一些研究员也尝试将外源Bt基因导入低酚棉来提高低酚棉的抗虫性，但是，直到目前为止，仍未看到具有显性低酚性状的转基因抗虫棉选育成功的报道。
现有技术如授权公告号为CN 103493728 B的中国发明专利，涉及一种抗虫低酚彩棉不育系选育及杂交种育种方法，该方法用低酚棉鲁棉12号为母本与抗虫棉鲁棉研21号为父本杂交配组，选择F2代群体中子叶、茎、叶均无酚的植株，连续自交种植3～4代，育成低酚棉系8HN538，用抗虫的核不育系品种鲁RH-1为母本与深棕色低酚彩棉亲本00S17为父本杂交配组，保留F2代群体中抗虫的植株，选择可育的低酚棉植株给低酚棉不育株授粉，选择深棕色的后代保留，连续选择杂交至第4代，育成抗虫的低酚彩棉核不育系0-173-3A；用抗虫低酚棉系8HN538做父本与低酚彩棉核不育系0-173-3A做母本进行杂交配组种植，获得的杂交种即为低酚彩色杂交种，本发明生产的低酚彩棉杂交种产量高、纤维品质优，色泽稳定一致，棉籽不含棉酚，综合利用价值大大提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，该方法能够抑制Bt基因启动子及CAD1-A基因种子特殊启动子的甲基化，从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1-A基因转录水平的降低；能够减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，利用RNAi技术沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，制得复合转基因棉花品种，具体步骤包括：
S1、对上述CAD1-A基因进行克隆，得CAD1-A-1质粒；
S2、构建上述CAD1-A基因的RNAi表达载体；
S3、采用根癌农杆菌介导法对上述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；
其中，上述步骤S2中RNAi表达载体中CAD1-A基因由α-球蛋白启动子驱动，上述α-球蛋白启动子用EnhⅠ增强子进行修饰。本发明提供的育种方法利用RNAi技术直接沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，能够获得具有抗虫性好，植株有酚、棉籽无酚优良品质的棉花品种，不受品种资源限制，与传统通过选育进行抗虫和低酚融合方法相比，具有耗时短，工作量少，操作简便的优点，同时也提高了抗病性能，且能够稳定遗传。复合转基因植株中，转基因启动子区67bp的同源序列足以引起基因沉默：相互靠近的不同基因启动子的同源序列容易结合配对，由于来自不同单链的两条同源序列甲基化程度不同，形成的杂交DNA双链多为半甲基化状态，因此能够为DNA甲基转移酶MET1及其辅因子在启动子CpG区域提供识别位点。通过用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够抑制启动子的同源序列结合成杂交DNA双链，抑制Bt基因启动子及CAD1-A基因α-球蛋白启动子的甲基化，从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1-A RNAi载体的表达，促进CAD1-A基因转录水平的降低，进而提高复合转基因植株的抗虫性，降低棉籽的棉酚含量。
在一些实施方式中，利用上述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体构建上述CAD1-A基因的RNAi表达载体。
在一些实施方式中，上述步骤S2的构建方法为：
使上述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的部分GUS缺失，得空白RNAi表达载体；
向空白RNAi表达载体插入CAD1-A基因正向序列，得CAD1-A-R的RNAi表达载体；
向CAD1-A-R的RNAi表达载体插入CAD1-A基因反向序列，得CAD1-A基因的RNAi表达载体。
在一些实施方式中，上述空白RNAi表达载体的制备方法，包含：
a、对上述GUS基因的内含子Intron1进行PCR扩增，回收纯化，得目的片段Ⅰ；
b、使用SacI对上述植物双元表达载体进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅱ；
c、使用XhoI对目的片段Ⅱ进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅲ；
d、将目的片段Ⅰ和目的片段Ⅲ进行连接，得空白RNAi表达载体。
在一些实施方式中，上述CAD1-A基因正向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.1，SEQID NO.2为引物对上述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因正向序列。
在一些实施方式中，上述CAD1-A基因反向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.3，SEQID NO.4为引物对上述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因反向序列。
在一些实施方式中，上述胚性愈伤组织进行遗传转化前预培养14-16d。胚性愈伤组织预培养14-16d时，分裂状态活跃，对农杆菌较为敏感，转化率较高。
在一些实施方式中，上述CAD1-A基因的RNAi表达载体通过电击转化或者热激法转入到上述根癌农杆菌中。
在一些实施方式中，上述步骤S3中进行遗传转化的具体步骤，包含：
根癌农杆菌的转化、菌液活化及侵染：将胚性愈伤组织接入容器中，加入活化后的根癌农杆菌菌液，侵染12-15min，期间不断振荡，弃去菌液，用无菌水重复清洗胚性愈伤组织，吸干，转入含有熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物的共培培养基上21-23℃暗培养22-26h；
筛选培养，分化培养，生根培养，练苗。农杆菌很容易滋生污染，在含有熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物的培养基上共培养，能够有效的抑制农杆菌的过度生长，使农杆菌的浓度保持在适宜浓度，减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。
本发明还提供一种抗虫低酚棉花品种的育种方法在培育集粮、棉、油三位一体的棉花品种中的用途。
本发明的有益效果为：
1)本发明利用RNAi技术直接沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，能够获得具有抗虫性好，植株有酚、棉籽无酚优良品质的棉花品种，不受品种资源限制，与传统通过选育进行抗虫和低酚融合方法相比，具有耗时短，工作量少，操作简便的优点，同时也提高了抗病性能，且能够稳定遗传；
2)本发明通过用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够抑制启动子的同源序列结合成杂交DNA双链，抑制Bt基因启动子及CAD1-A基因α-球蛋白启动子的甲基化，从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1-A RNAi载体的表达，促进CAD1-A基因转录水平的降低，进而提高复合转基因植株的抗虫性，降低棉籽的棉酚含量；
3)本发明通过对共培养培养基进行优化，能够有效的抑制农杆菌的过度生长，使农杆菌的浓度保持在适宜浓度，减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。
附图说明
图1为本发明的试验例1中35S启动子的甲基化率；
图2为本发明的试验例1中α-球蛋白启动子的甲基化率；
图3为本发明的试验例2中CAD1-A基因的转录水平；
图4为本发明的试验例2中Cry1Ac基因的转录水平；
图5为本发明的试验例3中褐化率、抗性愈伤组织率以及转化率；
图6为本发明的试验例4中棉籽中棉酚的含量以及幼虫死亡率。
具体实施方式
除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。
另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
本发明的实施方式，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方式以及本文下述的任何其他的实施方式，均可任意地进行组合。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，包括：
实验材料：转基因棉花MON531种子、棉花胚cDNA、pEASY-T1载体、筛选标记为GUS基因的pCAMBIA3301载体、棉花胚cDNA、在上海生工公司合成pGL3-HBV、根癌农杆菌LBA4404。
1.棉花种子α-球蛋白启动子的克隆：以棉花胚cDNA为模板，以正向引物：5’-AAGTCTGCAGGCTTGCGCATATTTTCTTACTATTTAGCTCTC-3’；反向引物：5’-GGCCGTCGGATCGGGAACGATAATCTCTGTATGTTG-3’，为引物对α-球蛋白启动子进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，将回收纯化后的PCR产物克隆至pEASY-T1载体，重组质粒命名为pEASY-T1-α-球蛋白启动子。
2.α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的构建：
1)含有infusion接头的α-球蛋白启动子片段的制备：正向接头引物为：GCAGGATCGCACGCTTCGATTTGCATCTTATCTAG；反向接头引物为：CTCACAGCTACCTTGGGATAACCATATGCTATGTA。以接头引物为引物，以pEASY-T1-α-球蛋白启动子为模板，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，将获得infusion接头的α-球蛋白启动子片段命名为P-Insert。
2)线性双元表达载体的制备：用NcoⅠ对质粒pCAMBIA3301进行酶切，产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，将获得的线性双元载体命名为P-Vector。
3)P-Insert和P-Vector的连接：使用融合克隆试剂盒将获得infusion接头的α-球蛋白启动子片段和线性双元载体进行连接，重组质粒命名为α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体。
4)EnhⅠ增强子修饰型α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的制备：上游引物：5’-TCGCTAGCTATACATCTGAGCC-3’，下游引物：5’-TGCTCGAGCAGCCTCGCAGGTA-3’，上下游引物中分别含NheⅠ和XhoⅠ酶切位点，以pGL3-HBV质粒为模板，以上下游引物为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为：1μL 10ng/μL pGL3-HBV，1μL 10pmol/μL上游引物，1μL10pmol/μL下游引物，4μL 2.5mM dNTP Mixture，10μL 5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)，0.5μL 2.5U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，补加双蒸水至50μL。反应条件：98℃10s、55℃10s、72℃30s(30个循环)、72℃10min。胶回收PCR产物，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切后，将PCR产物克隆至α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体，得EnhⅠ增强子修饰型α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体。
3.棉花CAD1-A基因的克隆：以棉花胚cDNA为模板，以CAD1-A F02，CAD1-AR02为引物，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，将回收纯化后的PCR产物克隆至pEASY-T1载体，重组质粒命名为CAD1-A-1。
4.CAD1-A基因的RNAi表达载体的构建：
1)空白RNAi表达载体的构建：以GUSI F01、GUSI R01为引物，GUSI F01引物序列为：TAACGTAATCTCATGCTAGTTC；GUSI R01引物序列为：ATTCCTCCTGGTCTCCGACAAGGCGTTTGTTCTCTAAC，以pCAMBIA3301为模板，进行PCR扩增，得到GUS基因的内含子Intron1，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，得目的片段Ⅰ；使用SacI对EnhⅠ增强子修饰型α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体进行酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，得目的片段Ⅱ；使用XhoI对目的片段Ⅱ进行酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，得目的片段Ⅲ；使用融合克隆试剂盒将目的片段Ⅰ和目的片段Ⅲ进行连接，得空白RNAi表达载体。
2)CAD1-A基因正、反向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2为引物对上述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，所得PCR产物即为CAD1-A基因正向序列；以SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4为引物对CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物，所得PCR产物即为CAD1-A基因反向序列。
3)使用Bst EⅡ对空白RNAi表达载体进行酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收酶切片段，使用融合克隆试剂盒将酶切片段与CAD1-A基因正向序列进行连接，得CAD1-A-R的RNAi表达载体；
4)使用NcoⅠ对CAD1-A-R的RNAi表达载体进行酶切，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收酶切片段，使用融合克隆试剂盒将酶切片段与CAD1-A基因反向序列进行连接，得CAD1-A基因的RNAi表达载体。
5.根癌农杆菌介导法对转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化：
1)受体材料的获得：暗培养6d的转基因棉花MON531种子无菌苗，将下胚轴中部切为0.5-0.8cm大小的切段，放于愈伤组织诱导培养基进行诱导，培养基由基本培养基MSB(MS无机盐+B5培养基的有机物+30g/L葡萄糖+0.75g/L MgCl2)+1.5g/L结冷胶辅以0.05mg/LKT，0.05mg/L 2,4-D组成，每28d继代一次，当大量愈伤组织出现以后，将其从下胚轴上剥离转移到转接到愈伤组织分化培养基(MSB+2.0g/L结冷胶+1.9g/L KNO3)上进行分化，每隔28d继代1次直至胚性愈伤出现，将胚性愈伤组织继代到胚性愈伤组织增殖培养基(MSB+1.9g/L KNO3+0.1g/L Asn+0.1g/L Gln)上预培养14d。
2)根癌农杆菌的转化、菌液活化及侵染：用电击转化法将CAD1-A基因的RNAi表达载体转入感受态根癌农杆菌LBA4404，挑取含有目的表达载体的农杆菌于50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养，直至OD600＝0.3-0.5，待用。将胚性愈伤组织接入平皿中，加入活化后的根癌农杆菌菌液，侵染12min，期间不断振荡，弃去菌液，用无菌水重复清洗胚性愈伤组织3次，吸干，将胚性愈伤组织转入共培培养基，共培培养基由基本培养基MSB+1.5g/L结冷胶+0.1g/L熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐+0.8g/L环糊精葡萄糖衍生物组成，21℃暗培养24h。
3)将胚性愈伤组织转入筛选培养基(MSB+1.9g/L KNO3+400mg/L Cef+50mg/L Kan+1.8g/L结冷胶)筛选出存活下来的抗性胚性愈伤，接入分化培养基(MSB+1.9g/L KNO3+0.1g/L Asn+0.1g/L Gln+2.0g/L结冷胶)，促进体细胞胚发生，将萌发的子叶胚在分化培养基上继代1次，进行生根培养，将根系发达正常子叶胚接种到成苗培养基(MSB+2.0g/L结冷胶)中，温度29℃，光照12h，光强2000lx。促进植株再生，获得完整的植株。
对比例1：
未用EnhⅠ增强子修饰型α-球蛋白启动子，其余部分和实施例1完全一致。
对比例2：
共培培养基中未加入熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐，其余部分和实施例1完全一致。
对比例3：
共培培养基中未加入环糊精葡萄糖衍生物，其余部分和实施例1完全一致。
对比例4：
共培培养基中未加入熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物，其余部分和实施例1完全一致。
对比例5：
未用EnhⅠ增强子修饰型α-球蛋白启动子，共培培养基中未加入熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物，其余部分和实施例1完全一致。
试验例1：
启动子DNA甲基化水平测序分析：
1)取获得的转基因阳性植株的幼叶，用基因组DNA提取试剂盒，提取棉花苗cDNA，用重亚硫酸盐转化试剂盒对DNA进行转化得硫酸化DNA。
2)目标启动子的PCR扩增：Cry1Ac基因35S启动子的甲基化PCR引物为：
MA-F：AAAGYAAAGGGATGTATGTAATGG；
MA-R：AATTRRTCCCAARTCRTTCTACACC。
CAD1-A基因α-球蛋白启动子的甲基化PCR引物为：
MC-F：AAGTYTGYAGGYTTGYGYATATTTTYTTAYTATTTAGYTYTY；MC-R：RRCCRTCRRATCRRRAACRATAATCTCTRTATRTTR。
3)PCR扩增及回收：分别以MA-F，MA-R为引物，以MC-F、MC-R为引物，以硫酸化DNA为模板，使用甲基化特异性PCR试剂盒分别进行PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物。
4)克隆测序：分别将35S启动子、α-球蛋白启动子与pMDTM载体进行克隆连接，连接完成后转化到大肠杆菌感受态细胞，将已转化的菌液涂布在抗生固体培养基(每300mL LB固体培养基中加入300μL 1％氨苄青霉素)上，倒置平板，37℃过夜培养，将长出的单个菌落转移至500μL抗生液体培养基(每50mL LB固体培养基中加入50μL 1％氨苄青霉素)中大量繁殖，菌液浑浊后进行PCR鉴定。将35S启动子PCR扩增约500bp的10个阳性克隆，α-球蛋白启动子PCR扩增约1100bp的10个阳性克隆送样测序。
5)数据处理：以启动子甲基化PCR引物位点为目标序列，运用Vector NTI 11.5对测序序列进行截取处理，使每一种启动子的序列大小相同；通过与35S启动子、α-球蛋白启动子原始序列比对，对CG，CHG，CHH区域位点的甲基化进行统计分析。35S启动子的甲基化率见图1，α-球蛋白启动子的甲基化率见图2。
由图1、图2可以看出，实施例1、对比例2、对比例3、对比例4转基因阳性植株幼叶中的35S启动子的和α-球蛋白启动子的CG、CHG、CHH区域的甲基化率和总甲基化率均明显低于对比例1，这说明，用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够抑制启动子的同源序列结合成杂交DNA双链，抑制Cry1Ac基因35S启动子及CAD1-A基因α-球蛋白启动子的甲基化。从而抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低，促进CAD1-A RNAi载体的表达，促进CAD1-A基因转录水平的降低，进而提高复合转基因植株的抗虫性，降低棉籽的棉酚含量。
试验例2：
CAD1-A基因、Cry1Ac基因转录水平的测定：
1.CAD1-A基因表达水平的测定：取转基因阳性植株幼嫩的根，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，以泛素蛋白酶为内参基因，以随机引物作为引物，用cDNA反转录试剂盒进行反转录。取得到的反转录产物作为RT-PCR的模板，在MJ公司的Option Real–time PCR仪上进行RT-PCR扩增。PCR扩增引物包括：
内参基因引物：Ub-F：GAAGGCGGACCACCTGTACAAC；Ub-R：CTTGATTCCCTTCTTCGTGTTCTT。
CAD1-A基因引物：CA-R：CCTTAATGATCTTGGGGTCACTGGC；CA-F：AGGCGATGATACGTCTTGCTCAAGC。
RT-qPCR反应体系共20μL：缓冲液Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)10μL，引物(10μmol/L)各1μL，荧光染料50×ROX 0.4μL，cDNA2μL，纯水5.6μL。反应程序：95℃2min；94℃5s，60℃34s，40个循环；60℃收集信号。
2.Cry1Ac基因表达水平的测定：总RNA提取自转基因T1代阳性植株幼苗的叶，PCR扩增引物包括：内参基因引物：Ub-F：GAAGGCGGACCACCTGTACAAC；Ub-R：CTTGATTCCCTTCTTCGTGTTCTT。Cry1Ac基因引物：CR-F：GATCCTTCGACGTGCTCAGC；CR-R：AATACGCCCGATGCTATCTTCG。其余部分和CAD1-A基因表达水平的测定方法相同。CAD1-A基因的转录水平见图3、Cry1Ac基因的转录水平见图4。
由图3可以看出，实施例1、对比例2、对比例3、对比例4的转基因阳性植株幼嫩的根中，CAD1-A基因的转录水平明显低于对比例1，这说明，用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够促进CAD1-A RNAi载体的表达，促进CAD1-A基因转录水平的降低；由图4可以看出实施例1、对比例2、对比例3、对比例4的转基因阳性植株幼苗的叶中，Cry1Ac基因的转录水平明显高于对比例1，这说明，用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够抑制复合转基因作物中Bt基因转录水平的显著降低。
试验例3：
统计共培养后未褐化的胚性愈伤组织及筛选培养后的抗性愈伤组织，计算褐化率和抗性愈伤组织率：
褐化率＝褐化胚性愈生组织数/胚性愈伤组织总数；
抗性愈伤组织率＝抗性愈伤组织数/胚性愈伤组织总数。
提取再生转基因植株叶片DNA，以所提的DNA为模板进行目的基因的检测，检测CAD1-A基因所用引物为：
CA-R：CCTTAATGATCTTGGGGTCACTGGC；
CA-F：AGGCGATGATACGTCTTGCTCAAGC。
PCR反应条件：95℃4min，95℃30s，59℃30s，72℃20s，28个循环；72℃5min。统计PCR检测结果为阳性的植株，计算转化率，转化率＝阳性植株/再生植株。褐化率、抗性愈伤组织率以及转化率的测定结果见图5。
由图5可以看出，实施例1，对比例1中的褐化率、抗性愈伤组织率以及转化率均明显大于对比例2、对比例3、对比例4，这说明，在含有熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物的培养基上共培养，能够有效的抑制农杆菌的过度生长，使农杆菌的浓度保持在适宜浓度，减少对胚性愈伤组织的毒害，抑制转化细胞的程序化死亡，增加转化频率。
试验例4：
1.转基因阳性植株抗虫性的室内生物测定：人工饲养1日龄棉铃虫；从转基因阳性植株上采集棉株上部侧枝顶部展开嫩叶；在每个养虫器皿中，放入1片棉叶，并保湿，每张叶片接棉铃虫1日龄幼虫5头；接虫后封闭养虫器皿，放于28℃的养虫室中饲养；接虫后第5d调查幼虫死亡情况。记录幼虫死亡数，检查时用毛笔尖轻触虫体，无反应则记为死亡虫。叶片受害程度级别按农业部953号公告-12.1-2007执行。幼虫死亡率按下式计算：
x＝n/N
式中，x为幼虫死亡率(％)；n为死亡虫数(头)；N为接虫数(头)。
2.转基因阳性植株棉籽中棉酚含量的检测：收取待测植株完全成熟的种子，晒干后直接磨样，保存在一70将冻干样品组织在液氮中研磨成细粉，取一定量的样品细粉(种子干重20-50mg，叶片干重100mg)于2mL离心管中，向离心管中加入1.5mL棉酚提取液(乙腈：水：磷酸V/V/V＝85：15：0.2)，4℃振荡15min；超声20分钟，每隔5分钟上下颠倒几次；4℃12000r/min离心15min，取上清于新离心管中；用0.22μm滤膜过滤上清，取200μL于棕色瓶内插管中，4℃保存。液相色谱仪条件：流动相(甲醇：水：磷酸V/V/V＝85：15：0.2)，进样量50μL，流速0.6mL/min，柱温50℃，DAD检测波长272nm。棉籽中棉酚的含量以及幼虫死亡率的测定结果见图6。
由图6可以看出，实施例1、对比例2、对比例3、对比例4转基因阳性植株的棉籽中棉酚的含量明显低于对比例1，实施例1、对比例2、对比例3、对比例4转基因阳性植株叶片用于饲养幼虫后幼虫死亡率明显高于对比例1，这说明，用EnhⅠ增强子对α-球蛋白启动子进行修饰，能够提高复合转基因植株的抗虫性，降低棉籽的棉酚含量。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 邯郸市农业科学院
<120> 一种抗虫低酚棉花品种的育种方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgactcggat gtgactcgag caagggaatt tctagt 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attcttcctg gtcgccatag atatctcaat tagctc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatccgaatc atatggctag taaactcacc tagctc 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcacatcga ccttgacgag ctagggaatt acaagt 36
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtctgcag gcttgcgcat attttcttac tatttagctc tc 42
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggccgtcgga tcgggaacga taatctctgt atgttg 36
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcaggatcgc acgcttcgat ttgcatctta tctag 35
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcacagcta ccttgggata accatatgct atgta 35
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgctagcta tacatctgag cc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctcgagca gcctcgcagg ta 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taacgtaatc tcatgctagt tc 22
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attcctcctg gtctccgaca aggcgtttgt tctctaac 38
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaagyaaagg gatgtatgta atgg 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aattrrtccc aartcrttct acacc 25
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagtytgyag gyttgygyat attttyttay tatttagyty ty 42
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
rrccrtcrra tcrrraacra taatctctrt atrttr 36
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggcggac cacctgtaca ac 22
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttgattccc ttcttcgtgt tctt 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccttaatgat cttggggtca ctggc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggcgatgat acgtcttgct caagc 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatccttcga cgtgctcagc 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatacgcccg atgctatctt cg 22

Claims (10)

1.一种抗虫低酚棉花品种的育种方法，利用RNAi技术沉默转Bt基因抗虫棉中的杜松烯合成酶基因CAD1-A，制得复合转基因棉花品种，具体步骤包括：
S1、对所述CAD1-A基因进行克隆，得CAD1-A-1质粒；
S2、构建CAD1-A基因的RNAi表达载体；
S3、采用根癌农杆菌介导法对所述转Bt基因抗虫棉的胚性愈伤组织进行遗传转化；
其中，所述步骤S2中RNAi表达载体中CAD1-A基因由α-球蛋白启动子驱动，所述α-球蛋白启动子用EnhⅠ增强子进行修饰。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：利用所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体构建所述CAD1-A基因的RNAi表达载体。
3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于：所述步骤S2的构建方法为：
1)使所述α-球蛋白启动子+GUS报告基因的植物双元表达载体的部分GUS缺失，得空白RNAi表达载体；
2)向1)中所得载体插入CAD1-A基因正向序列，得CAD1-A-R的RNAi表达载体；
3)向2)中所得载体插入CAD1-A基因反向序列，得CAD1-A基因的RNAi表达载体。
4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述步骤1)中空白RNAi表达载体的制备方法，包含：
a、对所述GUS基因的内含子Intron1进行PCR扩增，回收纯化，得目的片段Ⅰ；
b、使用SacI对所述植物双元表达载体进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅱ；
c、使用XhoI对目的片段Ⅱ进行酶切，回收纯化，得目的片段Ⅲ；
d、将目的片段Ⅰ和目的片段Ⅲ进行连接，得空白RNAi表达载体。
5.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因正向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2为引物对所述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因正向序列。
6.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因反向序列的制备方法为：以SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4为引物对所述步骤S1中CAD1-A-1质粒进行PCR扩增，所得PCR产物即为CAD1-A基因反向序列。
7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织进行遗传转化前预培养12-18d，优选14-16d。
8.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述CAD1-A基因的RNAi表达载体通过电击转化或者热激法转入到所述根癌农杆菌中。
9.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于：所述步骤S3中进行遗传转化的具体步骤，包含：
1)根癌农杆菌的转化、菌液活化及侵染：将胚性愈伤组织接入容器中，加入活化后的根癌农杆菌菌液，侵染12-15min，期间不断振荡，弃去菌液，用无菌水重复清洗胚性愈伤组织，吸干，转入含有熊果酸邻苯二甲酸单酯二钠盐和环糊精葡萄糖衍生物的共培培养基上21-23℃暗培养22-26h；
2)筛选培养，分化培养，生根培养，练苗。
10.权利要求1-9任一项中所述的育种方法在培育集粮、棉、油三位一体的棉花品种中的用途。
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