CN102191248A

CN102191248A - 用于转基因的种子特异性表达的棉花α-球蛋白启动子

Info

Publication number: CN102191248A
Application number: CN2011100637317A
Authority: CN
Inventors: K·S·拉瑟尔; G·苏尼库玛; J·P·康奈尔; A·S·雷迪
Original assignee: Texas A&M University System
Current assignee: Texas A&M University System
Priority date: 2001-12-13
Filing date: 2002-12-11
Publication date: 2011-09-21
Also published as: US7626081B2; AU2002364158A1; US20030154516A1; WO2003052111A9; WO2003052111A2; CN1871354A; WO2003052111A3; EP1458877B1; AU2002364158B2; EP1458877A2; CN1871354B

Abstract

本发明涉及用于转基因的种子特异性表达的棉花α-球蛋白启动子。本发明涉及棉花种子特异性基因α-球蛋白的5′调控区。当所述5′调控区或其部分可操作地连接于天然基因、异源基因的编码序列或者植物种子中的序列或互补序列时，该调控区可用在表达盒及表达载体中用于转化植物。同样提供的还有通过用本表达盒及表达载体转化植物来调节天然或异源基因例如脂肪酸合成或脂类代谢基因水平的方法。

Description

用于转基因的种子特异性表达的棉花α-球蛋白启动子

本申请是2002年12月11日提交的申请号为02827579.9(PCT/US02/39691)，发明名称为“用于转基因的种子特异性表达的棉花α-球蛋白启动子”申请的分案申请。

发明人：Keerti S.Rathore，Ganesan Sunilkumar，James P.Connell和Avutu S.Reddy

发明领域

本发明属于转基因表达的领域。更具体地，本发明属于用于植物转基因表达的基因转录启动子元件领域。

发明背景

种子特异性转基因表达是许多使用遗传工程的应用所必需的。这些应用包括通过操纵经由代谢途径的通量改善种子营养品质的转基因方法(Hitz等，1995；Kinney，1996；Shintani和DellaPenna，1998；Goto等，1999)以及在便利的包装即种子中生产具有工业或药用价值的新化合物(Cahoon等，2000)。这些转基因特征中某些可能需要在发育种子中表达不止一个转基因(Ye等，2000)。在其它情况下，改善种子品质的代谢工程可能需要在种子发育期间过表达和/或抑制多种基因。根据过表达或抑制的期望程度，每一步都将需要合适强度的启动子。另外，可能也需要具有合适的发育定时(developmental timing)的启动子。即使需要相同程度地表达不止一个基因，为多个引入的基因使用相同的启动子也是不明智的。在转基因高拷贝数整合的某些情况下，启动子同源性可导致基因沉默(Vaucheret，1993；Brusslan和Tobin，1995；Park等，1996)。

种子储藏蛋白在种子发育期间高水平表达，且它们在发育种子中的表达在空间上和时间上都被紧密地调控。因此，来自编码种子储藏蛋白的基因的调控序列代表了能够用于驱动转基因以种子特异性方式表达的启动子的有价值的来源。来自大豆β-conglycinin基因(Barker等，1988；Chen等，1988；Lessard等，1993)、法国菜豆菜豆蛋白基因(Bustos等，1989，1991；Kawagoe等，1994)、向日葵半日花素(helianthinin)基因(Bogue等，1990；Nunberg等，1995)的启动子以及胡萝卜Dc3启动子(Seffens等，1990；Kim等，1997)是来自双子叶植物的某些充分描述特征的种子特异性启动子的实例。尽管可获得此类系列的其它启动子，表达水平和基因沉默的问题依然是一个问题。因而，来自不止一个来源的长度不等的启动子的需求渐增，以满足将来调控种子中一种或多种转基因表达的需要。

发明概述

响应植物转基因领域对新启动子元件的持续需要，自棉花α-球蛋白基因分离了1144bp的5′调控区，包括1108bp的启动子序列和36bp的5′转录非翻译序列，并在功能上进行了特征描述。球蛋白是棉花主要的种子储藏蛋白，并在种子成熟期时构成总蛋白的大约60％(Dure，1989)。在棉花中，存在两个α-球蛋白基因，基因A和基因B，分别编码分子量为48和51kDa的蛋白(Chlan等，1987)。

本发明利用α-球蛋白基因启动子根据本文公开的教导提供植物中转基因的表达。本说明书中共开的α-球蛋白基因启动子解决了植物转基因领域对新启动子元件的持续需求。在至少一个实施方案中，所述转基因表达如本文公开的教导所定义的那样是种子特异性的。

在一个实施方案中，所述转基因表达利用含1108bpα-球蛋白基因启动子序列的启动子DNA实施。在不同的实施方案中，所述转基因表达利用包含不干扰所述1108bp序列的启动子功能的附加序列的启动子DNA。又在另一个实施方案中，所述转基因表达利用仅含部分所述1108bp序列分启动子DNA，从而在种子和植物发育期间，该部分序列的启动子功能能力在功能上类似于全长的1108bp序列。

在一个实施方案中，利用α-球蛋白基因启动子驱动编码多肽的RNA转录以在种子中表达。在另一实施方案中，所述RNA编码具有商业价值的多肽，例如酶、抗体和疫苗多肽。又在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致阻碍种子发芽的蛋白表达。在另一实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致改善种子营养品质的多肽的RNA转录。

在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子驱动具有目的特性的RNA如反义RNA或核酶转录。在一个特别的实施方案中，所述反义RNA与编码参与毒素即棉花中表达的棉酚(Gossypol)生物合成的酶的RNA互补。在另一个实施方案中，所述反义RNA与一个或多个参与脂肪酸合成的酶的RNA互补。在一个有利的实施方案中，此类RNA能够靶向病毒基因组或转录本以预防或减轻疾病。在另一个有利的实施方案中，此类RNA能够靶向并调控内源转录本的表达。

在另一个实施方案中，α-球蛋白启动子驱动其转录本将形成发夹结构的DNA序列转录，所述发夹结构通过RNA干预介导天然基因的转录后基因沉默。在不同的实施方案中，α-球蛋白基因启动子导致编码内源蛋白的RNA转录，以通过共阻遏机制沉默所述蛋白的基因(美国专利No.6,100,450；12栏，42-60行)。

又在另一个实施方案中，α-球蛋白基因启动子驱动调控双子叶植物种子脂肪酸含量的转录本表达。

附图的简短说明

参照附图中举例说明的且在文中描述的实施方案，将对上文简要概述的发明进行更加详细的描述。不过，应当指出，所述附图仅仅阐释了本发明的某些实施方案，因而不应当认为限制了其范围，因为本发明可允许其它等同有效的实施方案。

图1显示了α-球蛋白启动子的序列和报告基因构建体。A.启动子区的核苷酸序列。B.本发明实施方案中所用的双元载体pBIAGPGUS的T-DNA。

图2显示了在来自稳定转化的烟草、棉花和拟南芥属植物以及发芽的拟南芥属幼苗的发育中胚中的GUS活性的组织化学分布。A-E.来自T1-纯合的烟草植物的胚中的活性：A.开花后9天(dpa)的胚，B.10dpa的胚，C.13dpa的胚，D.17dpa的胚，E.来自干种子的成熟胚；F-N.来自T1-纯合的棉花植物的胚中的GUS活性：F.显示初始GUS活性的16dpa胚的高放大倍数图像，G.较低放大倍数下的相同胚，H.18dpa的胚，I.19dpa的胚，J.20dpa的胚，K.25dpa的胚，L.30dpa的胚，M.40dpa的胚，N.显示胚根和下胚轴区染色的分离自干种子且从中间切开的胚；O.来自零分离(null seqregant)棉花种子的胚；P-T：拟南芥(Arabidopsis thalia)种子中的GUS活性：P.鱼雷期胚(4dpa)，Q.手杖期胚(5dpa)，R.反转的U期胚(7dpa)，S.部分成熟的胚(9dpa)，T.来自干种子的成熟胚；U-Y：转基因拟南芥属种子发芽期间的 GUS活性：U.分离自干种子的胚，V.1天龄幼苗，W.3天龄幼苗，X.5天龄幼苗，Y.8天龄幼苗。尺度：A-E，P-T＝100μm；F-O，U-Y＝1mm。

图3显示了烟草中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。A.烟草种子中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。B.在吸涨(imbibition)后不同天数的发芽期间烟草幼苗中的GUS特异性活性。

图4显示了棉花胚中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。来自发育中棉花胚的提取物中的GUS特异性活性(实心圆)和总蛋白(空心圆)作为开花后天数(dpa)的函数。

图5显示了来自独立转基因世系的T0烟草、T1拟南芥和T0棉花种子中的GUS活性。

图6显示了分离自T1纯合子种子以及单T1半合子棉花植物种子的单个胚中的GUS特异性活性。

图7显示了α-球蛋白启动子驱动来自棉花的δ-12去饱和酶基因反义表达，以提高不同转基因世系的棉花种子中油酸的水平。C：未转化的对照植物。O：棉花籽油(Supelco，Bellefonte，USA)。

图8显示了四种世系的高油酸棉花种子单个种子水平上的脂肪酸水平。来自四种T0世系H50-2(A)、H41-1(B)、H4-2(C)和H42-2(D)的单个T1种子中的油酸(三角形)和亚油酸(空心正方形)水平。X轴数字代表单个种子。P：收集的30个种子。

图9显示了由两种高油酸转基因世系生长的T2棉花种子中的脂肪酸水平。来自两种高油酸世系H50-2(A)和H41-1(B)T1植物的T2种子中的油酸(三角形)和亚油酸(空心正方形)水平。测试了从每种世系15个不同T1植物收集的30个T2种子样品。

图10显示了图1中所划出的且独立地示于SEQ NO ID：3的336bp序列。

图11显示了图1中所示且独立地示于SEQ NO ID：2的1108bp序列。

优选实施方案的详细说明

接下来的讨论和实施例详细描述了实施本发明的最好的已知方法。应当理解该方法的变形可以包括所述调控序列的异源或天然基因或构建体或修饰，取决于靶植物物种和待转移到靶植物中的性状。在下列实施例中选择棉花、烟草和拟南芥物种作为靶植物；不过，下文概括的棉花α-球蛋白启动子的用途以及驱动天然或异源基因表达的方法适用于其它植物，而无需重大的实验或者偏离本发明的精神和范围。

已知球蛋白是双子叶植物中最普遍的种子储藏蛋白(Borroto和Dure，1987)，并且它们的调控序列潜在地是能够用于赋予广范围的双子叶物种中转基因的强种子特异性表达性质的启动子的有用来源。

本发明提供了分离的核酸，其编码种子特异性棉花α-球蛋白B(AG)基因的5′调控区，命名为α-球蛋白启动子或AGP。根据本发明，该5′调控区，当可操作地连接于异源基因的编码序列或者互补于天然植物基因的序列时，可指导所述编码序列或互补序列在植物种子中的表达。本发明的AG 5′调控区可用于构建表达盒，其在5′到3′方向上包括该AG 5′调控区、处于该调控区控制下的异源基因或互补于天然植物基因的序列以及3′终止序列。这种表达盒可掺入到许多自主复制的载体中以构建表达载体。

AG调控区的修饰，包括如SEQ NO ID：1和SEQ NO ID：2中所示的独立启动子和5′非翻译区，且保留了指导种子特异性表达的特征性性能，落在本发明的范围内。此类修饰包括插入、缺失以及一个或多个核苷酸的取代。

指导种子特异性表达的种子特异性5′调控区及其修饰或缺失片断的确认，可通过构建特定序列与异源基因编码序列的转录和/或翻译融合体，将该嵌合基因转移到合适的宿主中，并检测异源基因的表达实现。检测表达所用的测定法取决于异源序列的性质。例如，以氯霉素乙酰转移酶和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作为例证的报告基因，通常用来评价嵌合构建体的转录和翻译能力。标准测定法可用来灵敏地检测转基因生物体中的报告酶。β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因在转基因植物中可用作启动子活性的报告分子，因为该酶在植物细胞中具有高稳定性，高等植物中缺乏内在葡糖醛酸糖苷酶活性，并且可利用定量荧光测定和组织化学定位技术。Jefferson等(1987b)EMBO J 6：3901-3907已建立了用于在植物组织中生物化学和组织化学检测GUS活性的标准方法。生物化学测定通过将植物组织裂解物与4-羟甲基香豆素(methylumbelliferyl)β-D-葡糖苷酸(一种GUS荧光底物)混合，于37℃温育1小时，然后测量所得的4-甲基-7-羟基香豆素(umbelliferone)的荧光实施。GUS活性的组织化学定位通过于37℃在5-溴-4-氯-3-吲哚-葡糖苷酸(X-Gluc)中温育植物组织样品大约18小时并观察X-Gluc的染色模式测定。此类嵌合基因的构建能限定具体的调控序列，并证明这些序列能够指导异源基因以种子特异性的方式表达。

本发明的一个方面涉及表达盒和表达载体(文中也称之为“嵌合基因”)，其包含可操作地连接于异源基因编码序列的指导种子特异性表达的AG基因的5′调控区或其部分，从而该调控元件能够调节由所述异源基因编码的产物的表达。所述异源基因可以是AG之外的任何基因。如有必要，嵌合构建体中包括另外的来自AGP之外的基因的调控元件，或者足以导致表达产生有效量的由所述异源基因编码的多肽的此类元件的一部分。

从而，本发明提供了嵌合基因，其包含赋予种子特异性表达的AG5′调控区序列，可操作地连接于编码异源基因如脂类代谢酶的序列。可用于实施本发明的脂类代谢基因的实例包括脂类去饱和酶，例如δ6-去饱和酶、δ12-去饱和酶、δ15-去饱和酶及其它相关去饱和酶，例如硬脂酰-ACP去饱和酶、酰基载体蛋白(ACP)、硫酯酶、乙酰转酰酶、乙酰辅酶A羧化酶、酮脂酰合酶、丙二酰转酰基酶、以及延伸酶(elongase)。此类脂类代谢基因已从许多不同的细菌和植物物种中分离并描述了特征。它们的核苷酸编码序列以及分离此类编码序列的方法公开在出版的文献中，并广泛地为本领域技术人员所用。

本发明的嵌合基因通过将AG基因组DNA的5′调控区或其部分连接到异源基因的编码序列上构建。这些序列的并置可由许多方式实现。在一个实施方案中，5′到3′方向的序列次序是AG启动子、编码序列以及终止序列。在优选的实施方案中，5′到3′方向的序列次序是AG启动子、AG非翻译区、编码序列以及包括多聚腺苷酰化位点的终止序列。

构建此类嵌合基因的标准技术是本领域普通技术人员熟知的，并且可见于参考文献例如Sambrook等(1989)。许多策略可用于连接DNA片段，其选择取决于DNA片段末端的性质。本领域普通技术人员认识到为了表达异源基因，构建需要至少一个启动子以及转录本有效聚腺苷酰化的信号。从而，可以直接将含有称之为TATA框的保守启动子序列的AG 5′调控区连接到无启动子的异源编码序列上。

含AG TATA框的限制性或缺失片段正向连接于无启动子的异源基因如β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的编码序列上。熟练技术人员将会意识到该AG 5′调控区及其部分可通过其它方式提供，例如化学或酶促合成。

异源编码序列的3′端可操作地连接于包括多聚腺苷酰化位点的终止序列，所述终止序列例示为但不限于，胭脂碱合酶多聚腺苷酰化位点或者章鱼碱T-DNA基因7多聚腺苷酰化位点。或者，多聚腺苷酰化位点可以由异源基因提供。或者，含RNA定位信号(“拉链编码zipcode”)序列的3′UTR。这些决定因子可能对种子表达系统很重要。

本发明也提供了提高天然基因的表达或者在植物种子中表达异源基因的方法。根据此方法，将所述表达盒和表达载体引入植物中，以实现异源基因的表达。例如，提供了通过用包含可操作地连接于脂肪酸合成或脂类代谢基因的AG 5′调控区或其部分的表达载体转化植物细胞、并再生具有提高水平的所述脂肪酸合成或脂类代谢基因产物的植物，产生具有提高水平的脂肪酸合成或脂类代谢基因产物的植物的方法。

本发明的另一个方面提供了降低植物天然基因产物水平的方法，其包括用包含可操作地连接于与所述天然植物基因互补的核酸序列的AG 5′调控区或其部分的表达载体转化植物细胞。以这种方式，天然植物基因内源产物的水平通过称之为反义调控的机制降低。因而，举例来说，通过用包含可操作地连接于与编码天然脂肪酸合成或脂类代谢基因的核酸序列的互补的核酸序列的AG 5′调控区或其部分的表达载体转化植物，可降低脂肪酸合成基因或脂类代谢基因的产物水平。

本发明也提供了共阻遏(cosuppressing)植物天然基因的方法，其包括用包含可操作地连接于编码天然植物基因的核酸序列的AG 5′调控区的表达载体转化植物细胞。以这种方式，天然植物基因内源产物的水平通过称之为共阻遏的机制降低。因而，举例来说，通过用包含可操作地连接于编码天然脂肪酸合成或植物天然脂类代谢基因的核酸序列的AG 5′调控区或其部分的表达载体转化植物，可降低脂肪酸合成基因或脂类代谢基因的产物水平。虽然共阻遏的确切机制尚未完全了解，但本领域技术人员熟悉报道共阻遏相关实验条件和结果的公开著作(Napoli等1990；Van der Krol 1990)。

本发明也提供了调控天然基因表达的方法，其包括用包含可操作地连接于编码与天然植物基因反义部分相连的有义部分的核酸序列的AG 5′调控区的表达载体转化植物细胞。来自此具有自身互补臂的构建体的转录本形成双链RNA发夹结构，并引起来自天然基因的转录本的降解，导致转录后基因沉默(Waterhouse等，1998；Wang和Waterhouse，2000；Chuang和Meyerowitz，2000)。这类似于RNA干扰机制。

为提供异源或天然基因的调控表达，用本发明的嵌合基因构建体转化植物。基因转移的方法是本领域熟知的。嵌合基因可通过如Horsch等(1988)所述的叶盘转化-再生方法引入到植物中。也可以利用其它转化方法例如原生质体培养，其落在本发明的范围之内。在优选的实施方案中，用土壤杆菌(Agrobacterium)来源的载体例如Klee等(1987)描述的那些载体转化植物。其它熟知的方法可用来将本发明的嵌合基因插入到植物细胞中。此类替代方法包括生物轰击(biolistic)途径(描述于Klein等，1987中)、电转化、化学诱导的DNA摄取以及使用病毒或花粉作为载体。

对于转化方法，当必要时，可将本发明的嵌合基因插入到植物转化载体，例如由Bevan(1984)所述的双元载体中。植物转化载体可通过修饰天然根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因转移系统获得。所述天然系统包含含有大片段的大Ti(肿瘤诱导)质粒，称之为T-DNA，它被转移到转化的植物中。另一个Ti质粒片段vir区负责T-DNA的转移。所述T-DNA区邻接末端重复。在修饰的双元载体中，肿瘤诱导基因已被缺失，且利用vir区功能转移T-DNA边界序列邻接的外源DNA。所述T-区也含有可选择的抗生素抗性标志以及多克隆位点用于插入转移的序列。此类改造菌株被称之为“disarmed”根癌土壤杆菌菌株，并且允许将T-区邻接的序列有效地转移到植物的核基因组中。

表面消毒的叶盘及其它易感组织接种所述“disarmed”含外源DNA的根癌土壤杆菌，培养数天，然后转移到含抗生素的培养基中。在含合适抗生素的培养基中生根后，则选择转化的芽，并转移到土壤中。对转基因植物进行授粉，并从这些植物中收集种子且在抗生素培养基中培养。

异源或报告基因在发育种子、年轻幼苗和成熟植物中的表达可通过免疫学、组织化学或活性测定监控。如本文所讨论的，嵌合基因表达测定法的选择取决于异源编码区的性质。例如，如果可获得合适的核苷酸探针，则Northern分析可用于评价转录。如果可获得由异源基因编码的多肽的抗体，则可利用Western分析和免疫组织化学定位评价所述多肽的产量和分布。根据异源基因，可使用合适的生物化学测定法。例如，乙酰基转移酶通过测量标准底物的乙酰化检测。脂类去饱和酶基因的表达可通过分析脂肪酸甲酯(FAMES)测定。

本发明的另一个方面提供了包含本发明的嵌合基因的转基因植物或这些植物的子代。单子叶植物和双子叶植物都考虑在内。通过上述的任何植物转化方法用嵌合基因转化植物细胞。转化的植物细胞，通常为愈伤组织培养物、叶盘、外植块或全植物(介由Bechtold等，1993的真空浸润法)的形式，通过本领域普通技术人员熟知的方法再生为完整的转基因植物(如Horsh等，1985)。在优选的实施方案中，转基因植物是向日葵、棉花、油料油菜(oil seed rape)、玉米、烟草、拟南芥属植物、花生或大豆。由于转化植物的子代遗传得到该嵌合基因，因此利用来自转化植物的种子或插条维持该转基因世系。

定义

如本文所用的术语“α球蛋白基因启动子和5′非翻译区”(″AGP″)是指图1A中所示的1144bp DNA序列(SEQ ID NO：1)、包括该1144bp序列的任何更大的DNA序列以及由该1144bp序列的一部分构成的任何更小的DNA序列，且就时空发育(saptio-developmental)表达模式和/或表达水平而言，它们与全长1144bp序列以相同的方式或相似的方式行使转录方面的功能。

如本文所用的术语“α球蛋白基因启动子”是指图1A中所示的1108bp DNA序列(SEQ ID NO：2)、包括该1108bp序列的任何更大的DNA序列以及由该1108bp序列的一部分构成的任何更小的DNA序列，且就时空发育表达模式和/或表达水平而言，它们与全长1108bp序列以相同的方式或相似的方式行使转录方面的功能。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指调控区如启动子与编码区以一种方式连接，从而所述编码区的转录受所述调控区的调节和调控。将启动子可操作地连接于编码区的方法是本领域熟知的。

如本文所用，术语“盒”是指能够表达特定基因的核苷酸序列，如果所述基因插入从而可操作地连接于该核苷酸序列中存在的一个或多个调控区的话。因而，举例来说，表达盒可包含期望在植物种子中表达的异源编码序列。本发明的表达盒和表达载体因此可用于指导任何数目的异源基因的种子特异性表达。如本文所用，术语“种子特异性表达”是指在植物种子的胚部分表达。

实施例

图1显示了α-球蛋白启动子的序列和报告基因的构建体。图1A(SEQ ID NO.1)显示了本研究中分离且在功能上描述了特征的1144bp序列。推断的顺式作用元件在框内显示。转录起始位点以+1指示。5′非翻译区以斜体表示，并且额外的未公开的336bp序列以下划线标出。所述336bp序列示于图10(SEQ ID NO.3)中。按照Siebert等(1995)所述的方法，利用来自棉花分期胚cDNA文库的α-球蛋白克隆的序列信息克隆5′侧翼启动子区。该克隆朝此处所示序列3′端的772bp与公开的α-球蛋白基因B的5′基因组侧翼序列相匹配(Chlan等，1987)。进一步的PCR步行法产生了额外的上游序列的336个核苷酸(下划线)。根据启动子序列信息，设计引物扩增了1144个核苷酸长度的片段，含有组合的启动子和来自棉花cv.Coker 312)基因组DNA的α-球蛋白B基因非翻译前导区。所用的引物是：AGP5＝5′-aag-ctt-gca-tgc-ctg-cag-CTA-TTT-TCA-TCC-TAT-TTA-GAA-ATC-3′；AGP3＝5′-ggg-acg-cgt-atc-GAT-TAC-GAT-AAG-CTC-TGT-ATT-TTG-3′(掺入到引物中的唯一的限制性位点以小写字母表示)。将扩增的PCR产物克隆到TA克隆载体pCRII(Invitrogen)中产生pCRII-AGP。插入物的完整性通过测序证实。用所述的引物扩增基因组棉花DNA，接着进行常规克隆和测序，允许本领域任何技术人员无需过度实验就可获得该DNA片段。

然后将来自pCRII-AGP的α-球蛋白启动子以HindIII-XbaI片段引入到位于pBI101.3(Clontech)gusA基因上游的多聚接头序列中。在GUS编码序列上游发现的框外ATG(来自pCRII多聚接头)通过缺失NotI和SmaI位点之间的区域除去，产生测试构建体pBIAGPGUS。对全部推断的启动子和5′UTR进行测序，以证实最终构建体的完整性。然后利用An等(1988)描述的方法，将图1b所示的持有nptII作为植物选择性标记基因的双元载体pBIAGPGUS引入到土壤杆菌菌株LBA4404和GV3101中。

参照图1A，TATA框和CAAT框以粗体字母表示，而5′非翻译区以斜体表示。启动子序列的视觉分析揭示了许多推断的可能参与α-球蛋白基因B组织特异性转录调控的DNA基序。存在四个CANNTG基序(Kawagoe和Murai，1992)，一个CATGCACA(RY重复，Dickinson等，1988)以及两个AACACA基序(Goldberg，1986)。这些顺式元件据信赋予了启动子种子特异性表达的性质。瞬时表达测定提示了图11(SEQNO.ID：2)中所示的1108bp序列高度的组织(种子)特异性。该序列的功能分析通过用图1B中所示的双元载体构建体稳定转化3个不同物种实施，所述载体包含处于α-球蛋白启动子控制下的报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶。

在种子发育期间GUS活性的组织化学定位。处于α-球蛋白启动子调控下的葡糖醛酸糖苷酶基因的表达，首先在颗粒轰击介导转化高粱(sorghum)和棉花的发育中胚、胚乳及叶子之后，利用瞬时表达测定法测试。结果(未显示)表明启动子仅在棉花的发育中胚中具有活性。根据这些结果，对烟草、拟南芥和棉花进行稳定转化，以更详细地描述棉花α-球蛋白启动子活性的特征。

如Jefferson等(1987)所述，对烟草和棉花T1种子以及拟南芥T2种子进行GUS测定。这些代的种子将产生转基因的分离。为了使因零分离(null seqregant)和纯合子种子引入的差异最小化，用大量种子进行所述测定。对每种转基因世系进行一式三份测定，对每份棉花、烟草和拟南芥分别用25(～2gm)、150(～15mg)和300(～5mg)个种子。总蛋白利用Bradford(1976)的方法测量。GUS活性相对于总蛋白而被标准化，且结果表示为GUS比活(每mg蛋白每分钟释放的4-MU的纳摩尔数)。也在种子中表现出GUS活性的植物的叶子、根、茎和花组织中进行GUS表达分析。

T1纯合子烟草和T2纯合子拟南芥的种子在MSO培养基中发芽，并对发芽后不同天数的幼苗进行GUS活性的组织化学测定(在拟南芥的情况下)或荧光测定(在烟草的情况下)。在GUS染色后，幼苗在乙醇中处理，以清除叶绿素。在烟草和拟南芥的情况下，利用Kodak Elitechrome Tungsten 160T胶片对胚/幼苗进行拍照。扫描幻灯片并进行数值放大。棉花胚图像利用ZeissM²BIOZoom Stereo/Compound显微镜配置的Zeiss AxioCam数码相机捕获。图2利用Canvas 7.0软件编辑。

来自T0转基因棉花植物表现出种子特异性表达的种子首先在100mg/l卡那霉素中发芽以消除零分离。将发芽并在卡那霉素存在下生长的那些种子转移到土壤中并培养至成熟。通过对种子的GUS组织化学分析测定这些T1植物的接合状态。选择一个纯合子植物和一个半合子植物进行种子GUS活性的定量分析。利用早先描述的荧光测定方法对分离自种子的胚独立地进行GUS活性分析。

图2显示了在来自稳定转化的烟草、棉花和拟南芥属植物以及发芽的拟南芥幼苗的发育中胚中的GUS活性的组织化学定位。GUS活性的组织化学分析可用于鉴定α-球蛋白启动子调控的表达的定时和定位。分离自T1纯合子烟草植物不同胚发育阶段种子的胚中GUS活性的组织化学分析结果示于图2A-E中。AGP：在来自3种T1纯合子烟草植物的种子中评价gusA表达。烟草(Nicotiana tabacum cv.Havana)由土壤杆菌菌株LBA4404(pBIAGPGUS)利用叶盘转化方法(Horsch等，1988)转化。在含100mg/ml卡那霉素和500mg/ml羧苄青霉素的再生培养基(MS盐，100mg/l肌醇，0.4mg/l硫胺HCl，4μM BAP，0.5μMNAA，3％蔗糖，pH 5.6，由0.8％Dufci-Bacto琼脂固化)中选择转化株。将再生根切离并在MSO培养基(MS盐，B-5有机物，2％蔗糖，pH5.7，用0.8％Difco-Bacto琼脂固化)(含有100mg/l卡那霉素和500mg/l羧苄青霉素)中生长。将具有较好的根系统的植物转移到土壤并在温室中生长至成熟。自数个蒴果的种子分离胚，而且它们的显微镜观察显示胚在开花后9天(dpa)左右达到心期。在心期或晚心期的胚中检测不到可见的GUS活性。不过，在晚鱼雷期及发育较老阶段的胚中观察到GUS活性。

图2F-2N显示了T1-纯合子棉花植物胚中的GUS活性。在分离自T1-纯合子棉花植物种子的发育中的胚中进行GUS活性的组织化学分析。棉花(Gossypium hirsutum cv.Coker 312)下胚轴区段幼苗用土壤杆菌[LBA4404(pBIAGPGUS)]根据Sunilkumar和Rathore(2001)描述的方法转化。从卡那霉素抗性转基因愈伤组织(calli)再生植物并培养至成熟。GUS染色最早在16dpa的胚中检测到。在该阶段，如图2F和2G所示，子叶刚刚开始伸展，且GUS活性刚好出现在子叶下方，处于子叶和下胚轴交接处。该活性随着种子发育进程提高并散布于整个胚中，如图2H-2N所示。在40dpa的胚和分离自干种子的成熟胚中观察到强烈染色。图2O显示了分离自零分离种子的胚，其在组织化学GUS测定后为阴性。来自3种植物物种的转基因植物的成熟胚的GUS活性的组织化学分布结果提示所述1108bp启动子区具有赋予胚中表达所需的顺式作用结构域。

图2P-2T显示了T2-纯合子拟南芥(Arabidopsis thaliana)C24植物种子的发育中的胚中的GUS活性。利用由AGP：gusA转化的拟南芥纯合子T2代的种子进行组织化学分析。拟南芥(Arabidopsis thaliana)C24植物利用土壤杆菌菌株GV3101(pBIAGPGUS)通过真空浸润法(Bechtold和Pelletier，1998)转化。在含50mg/ml卡那霉素的MSO培养基中选择转化的种子(T1)。将所述卡那霉素抗性植物转移到土壤并于培养室中生长至成熟(23℃，65％湿度，14小时/10小时光周期)。

在分离自不同发育阶段种子的胚中检测AGP：gusA的表达。GUS染色在心期和晚心期胚中不可见(结果未显示)。在鱼雷期胚中观察到低水平的GUS活性，如图2P所示，并且随着胚生长至成熟蓝染色的强度逐渐增强，如图2Q-2T所示。在分离自干种子的胚中观察到强烈的GUS染色。综合考虑，来自这三种双子叶物种的结果提示由AGP驱动的基因表达限于胚发育的中期到晚期。

图2U-2Y显示了转基因拟南芥种子发芽期间的GUS活性。为了确定AGP活性是否严格地限于发育中的胚/种子，在发芽的拟南芥幼苗中监测GUS活性。利用生物化学方法在发芽的幼苗中分析GUS活性。图2U-Y中所示的结果表明GUS染色的强度随着幼苗生长逐渐下降。在吸涨后5天，仍可见某些残余的GUS活性。不过，7天后，仅在下胚轴的两端观察到蓝染色的弱斑。GUS染色在子叶、根或下胚轴中央部分不可见。在吸涨后超过7天的幼苗中未观察到GUS活性(图2Y)。

图3介由定量分析显示了烟草中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。组织化学分析不能检测低水平的GUS活性，而且也不能给出GUS表达水平提高的精确测量。因此，通过在开花后不同时间点的定量荧光GUS测定，检测发育中种子(烟草)和发育的胚(棉花)中的GUS表达，来研究种子发育期间的AGP活性。如图3A所示，可检测的GUS特异性活性最早在12dpa在T1纯合子烟草植物的种子中检测到。该活性随之迅速升高，最后在20dpa达到最大。

图3B显示了烟草幼苗在吸涨后不同天数发芽期间的GUS活性。表面消毒的来自T1纯合子烟草植物的种子在MS培养基(Murashige和Skoog，1962)中发芽。利用吸涨后0、2、4、6、8和10天的全幼苗提取物进行GUS荧光测定。GUS活性在种子发芽后持续下降(图3B)，并且8天后仅发现初始活性的2％。在发芽后10天的幼苗中未检测到GUS活性。GUS活性在拟南芥(图2A-2E)和烟草(图3B)种子发芽后迅速跌至不可检测水平的事实提示启动子仅在种子发育期间有活性，而在种子发芽和成熟植物中失活。

图4介由定量分析显示了棉花胚中α-球蛋白启动子对GUS表达的发育调控。由于大的种子粒径、相对慢的胚发育进程、以及从发育种子中分离胚的容易性，棉花为在单个种子水平详细描述AGP：gusA表达特征提供了最好的系统。分离自T1纯合子棉花植物种子的发育中胚的GUS活性定量分析结果、蛋白水平以及鲜重示于图4。植物在温室中于4月份生长，并且在每年的这个时候，棉蒴在大约43dpa时打开。GUS表达最早在15dpa时检测到(60pmole/mg蛋白/分)。之后GUS活性缓慢升高直到20dpa，然后迅速上升直至40dpa。从该顶峰直到种子成熟，出现小但统计学显著的活性下降。在种子发育期间，蛋白水平(如在GUS抽提缓冲液中测量的)从15dpa到30dpa迅速升高，接着缓慢增长直至40dpa然后停止增加。在18dpa前不可能确切地称重胚。不过，自该时间点起，胚鲜重升高直至40dpa，紧接着随种子达到干态而下降。这些结果印证了组织化学分析。AGP：gusA在15dpa左右在棉花胚中开始表达，并且该活性在超过40dpa后或者停止增加或者下降。

表1显示了T1-纯合子转基因棉花植物不同组织和对照种子中的GUS特异性活性。对在胚中表达报告基因的3种不同T0转基因棉花植物的不同部分进行组织化学GUS分析。在转基因植物的组织例如茎、叶、叶柄、花柄(flower stock)、萼片、花瓣或棉蕾中未检测到GUS活性依赖性组织化学染色。另外，进行更灵敏的荧光测定分析检测一个转基因棉花植物不同器官和组织中的AGP活性。该分析的结果示于表1，清楚地证明在茎、叶、花蕾、花粉和根中没有可检测的GUS活性。仅在种子中检测到高水平的GUS活性。这些结果提示AGP驱动的转基因活性被紧密调控，并且是种子特异性的。

表1.T1纯合子转基因棉花植物不同组织和对照种子中的GUS比活

^a数值为三份重复实验的平均GUS活性±SE。^b重复实验的数目不足以计算SE(该测定中利用了5.7mg花粉)。^c对每一重复实验在混合10个种子的胚中进行测定。

图5显示了独立转基因世系T0烟草、T1拟南芥和T0棉花种子中以对数等级绘制的GUS活性。初步结果显示AGP驱动的GUS活性在这三种物种中区别极大。对许多来自拟南芥、烟草和棉花的独立转基因世系的种子(通过组织化学法测试为GUS活性阳性)进行的深入分析证实了这种观察结果。如图5所示，来自11个独立转基因烟草世系的种子的GUS活性范围从0.6到18nanomole 4-MU/mg蛋白/分。来自10个独立转基因拟南芥世系的种子的相似分析显示了从49到203nanomole 4-MU/mg蛋白/分的范围。10个独立转基因棉花世系的GUS活性范围从118到1777nanomole 4-MU/mg蛋白/分。也已在由谷蛋白启动子：gusA和玉米蛋白启动子：gusA转化株获得的玉米种子中报道了相似的高水平种子特异性启动子表达(Russell和Fromm，1997)。该结果提示棉花AGP虽然作为种子特异性启动子被不同的异源系统识别，但在棉花中表现出最高水平的活性。

图6显示了分离自T1纯合子种子以及单一半合子棉花植物种子的单个胚的GUS特异性活性。纯合子和半合子T1植物都来自于单一T0转基因世系。棉花大的种子粒径允许在单个种子水平分析GUS活性。这为我们提供了在由半合子T1植物产生的分离的T2种子群内定量检测单个种子的GUS活性，并将这些数值与由纯合子T1植物产生的单个种子的活性进行比较的机会。如图6所示，来自纯合子T1亲本的所有T2种子都表现出GUS活性(图6，底部柱形图)，提示再引入天然启动子，即使是在纯合子的条件下，不导致该世系的转基因沉默。来自半合子T1亲本的T2种子表现出清楚的转基因活性的表型分离(3∶1)(图6，顶部柱形图)。而且，在表现出GUS活性的种子中，在大多数情况下明显有两种不同的活性水平。大约四分之一来自半合子亲本的T2种子中的较高水平活性与来自纯合子亲本的T2种子中观察到的水平相似。因而，半合子植物种子中两种不同水平的GUS活性可能是单个种子半合子或纯合子转基因状态的结果，其揭示一种基因剂量效应。

图7显示α-球蛋白启动子驱动棉花δ-12去饱和酶基因反义表达，提高不同转基因世系棉花籽中油酸的水平。用其中来自Gossypium hirsutum的δ-12去饱和酶基因以反义方向处于棉花α-球蛋白启动子控制下的构建体转化棉花(Coker 312)。棉花转化如Sunilkumar和Rathore(2001)所述实施。总计45株植物由26个独立的转基因愈伤组织世系再生。利用研钵和研杵使单个T1棉花种子或者每株植物随机挑取的30个种子的混合样品的内核均质化为细粉。如Dahmer等(1989)所述从50mg该粉末样品中提取总脂肪酸。利用气相色谱进行脂肪酸分析。结果表达为总脂肪酸百分数。棉花籽油的脂肪酸组成为：肉豆蔻酸(0.9％)、棕榈酸(24.7％)、硬脂酸(2.3％)、油酸(17.6％)及亚油酸(53.3％)(White等，2000)。转基因植物T1种子的油酸水平范围在15％到29％(图7)。这些植物中亚油酸水平范围在53％到40％之间。亚油酸水平下降的世系表现出相伴的油酸水平的提高。这种负相关是预期的，如果这种改变是δ-12去饱和酶活性阻遏的结果的话。

图8显示了四种高油酸棉花种子世系在单个种子水平的脂肪酸水平。选择四种高油酸世系在单个种子水平进行脂肪酸分析。因为T1种子将发生转基因分离，预期少数种子(零分离)具有野生型水平的油酸/亚油酸。然而，大多数种子将表现出较高油酸/较低亚油酸表型。如图8所示，来自转基因世系H50-2和H41-1的某些种子分别具有高达34.2％和34.3％的油酸水平。正如预期的那样，来自所有四种世系的少数种子(很可能是零分离)表现出野生型水平的油酸/亚油酸。

图9显示了T2棉花种子中的脂肪酸水平。种子由两种高油酸世系萌发且植物生长至成熟。对随机挑取的30个T2种子的混合样品进行脂肪酸分析。来自H50-2世系#13和#15植物的T2种子分别具有32.3％和32.8％的油酸含量(图9)。它们的亚油酸含量分别为35.9％和36.7％。在H41-1世系中，#1植物的T2种子含有32％油酸和37％亚油酸。

如图9所示，与野生型对照相比，某些转基因世系种子的油酸水平增长超过80％。这种油酸的增长与相伴的亚油酸水平大约30％的下降相关。如图7-9中所反映的，α-球蛋白启动子通过驱动基因沉默构建体的表达有效地操纵油料种子的脂肪酸水平。

表2显示了对照和AGP：gusA转基因棉花植物不同组织中的GUS活性，其反映了α-球蛋白启动子严谨的种子特异性表达。种子特异性启动子表达的紧密调控在营养部即使是最低水平的启动子活性也是不可接受的情况下很重要。为确定α-球蛋白启动子是否在种子中是绝对活性的，以及棉花α-球蛋白启动子是否能够用于在种子中表达不期望在非种子组织中表达的转基因，测量了对照和AGP：gusA转基因植物不同组织中的GUS活性。如表2所示，基于MU(一种荧光反应产物)定量的GUS测定表明AGP：gusA基因仅在种子中表达，并且营养和花组织中只记录了极低水平的荧光读数。

表2.来自对照和AGP：gusA转基因棉花植物的各种组织中的GUS活性

^*重复实验的数目不足以计算SE。

测定进行一式三份。数字为均值±标准误差。

表3A和3B显示了水胁迫(water-stressed)AGP：gusA转基因植物的GUS活性。已知某些Lea类种子特异性启动子成员因ABA以及干旱条件在营养组织中活化(Seffens等，1990；Vivekananda等，1992，Siddiqui等，1998)。外源ABA被证明可诱导β-菜豆球蛋白启动子，驱动分离的转基因烟草胚中的gusA基因(Bustos等，1998)。为排除，棉花α-球蛋白启动子(AGP)可能在已知导致内源ABA水平提高的水胁迫条件下在营养部活化的可能性，对通过禁止浇水置于水胁迫下的3种不同转基因世系植物的叶提取物进行GUS荧光测定。在末次浇水后直至它们表现出彻底的萎蔫不同的时间点分析叶样品的GUS活性。如表3A和3B所示，即使在它们彻底萎蔫后，这3种转基因植物的任何叶样品中未检测到可检测的GUS活性。该结果表明α-球蛋白启动子在种子中是绝对活性的，并且不因水胁迫条件在植物的营养部诱导。

表3A.水胁迫AGP：gusA转基因植物#1和#2的GUS活性。在叶提取物中进行测定。

表3B.水胁迫AGP：gusA转基因植物#3的GUS活性。在叶提取物中进行测定。

^*测定进行一式三份。数字为均值±标准误差。

显然在本研究中描述特征的1108bp棉花α-球蛋白启动子，能够赋予棉花籽及两种其它双子叶植物种子强有力的种子特异性表达。AGP将可用于双子叶植物种子发育期间涉及转基因介导的过表达或阻遏的任何应用，因而增加了种子特异性启动子的可获得性。

本文已阐述了本发明的各种原理。所公开的各种技术和设备代表了本领域技术人员由本申请的教导可容易理解的技术和设备的一部分。可由本领域普通技术人员添加执行之的细节。附图可能包含未在文本中具体讨论的附加信息，且此类信息可无需增加新主题而加以描述。另外，可创建并提出所有要素或应用的组合及排列。可实施一切以优化具体应用的功效。

本文描述的各种步骤可联合其它步骤，除非另行具体限定，能以许多顺序发生，不同步骤可插入所阐述的步骤中间，且所阐述的步骤可拆分为多个步骤。除非是上下文另有需要，措辞“包括”或该措辞的变形“包含”或“含”应理解为暗指包含所阐述的要素或步骤或要素或步骤构成的组，但不排除其它要素或步骤或要素或步骤构成的组。

此外，特此将本专利申请中提及的任何参考文献以及随本申请递交的参考文献列表中所列的所有参考文献并入作为参考。然而，就可能被认为与本发明的专利性不一致的陈述而言，此类陈述明显地不应当考虑为是由申请人作出的。

参考文献

An G，Ebert PR，Mitra A and Ha SB(1988)Binary vectors.In：Gelvin SB and Shilperoort RA(eds.)Plant Mol Biol Manual(pp.A3：1-19)Kluwer Academic Publishers，Dordrecht.

Barker S J，Harada JJ and Godberg RB(1988)Cellular localization of soybean storage protein mRNA in transformed tobacco seeds.Proc Natl Acad Sci USA 85：458-462.

Bechtold N and Pelletier G(1998)In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration.Methods Mol Biol 82：259-266.

Bevan M(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Res.12：8711-8721

Bogue MA，Vonder Haar RA，Nuccio ML，Griffing LR and Thomas TL(1990)Developmentally regulated expression of a sunflower 11S seed protein gene in transgenic tobacco.Mol Gen Genet 222：49-57.

Borroto K and Dure III L(1987)The globulin seed storage proteins of flowering plants are derived from two ancestral genes.Plant Mol Biol 8：113-131.

Bradford MM(1976)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72：248-254.

Brusslan JA and Tobin EM(1995)Isolation of new promoter-mediated co-suppressed lines in Arabidopsis thaliana.Plant Mol Biol 27：809-813.

Bustos MM，Begum D，Kalkan FA，Battraw MJ and Hall TC(1991)Positive and negative cis-acting DNA domains are required for spatial and temporal regulation of gene expression by a seed storage protein promoter.EMBO J 10：1469-1479.

Bustos MM，Guiltinan MJ，Jordano J，Begum D，Kalkan FA and Hall TC(1989)Regulation of β-glucuronidase expression in transgenic tobacco plants by an A/T-rich，cis-acting sequence found upstream of a French bean β-phaseolin gene.Plant Cell 1：839-853.

Bustos MM，Iyer M and Gagliardi SJ(1998)Induction of a β-phaseolin promoter by exogenous abscisic acid in tobacco：developmental regulation and modulation by external sucrose and Ca²⁺ions.Plant mol Biol 37：265-274.

Cahoon EB，Marillia E-F，Stecca KL，Hall SE，Taylor DC and Kinney AJ(2000)Production of fatty acid components of meadowfoam oil in somatic soybean embryos.Plant Physiol 124：243-251.

Chen Z-L，Pan N-S and Beachy RN(1988)A DNA sequence element that confers seed-specific enhancement to a constitutive promoter.EMBO J 7：297-302.

Chlan CA，Borroto K，Kamalay JA and Dure III L(1987)Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination.XIX.Sequences and genomic organization of the α-globulin (vicilin)genes of cottonseed.Plant Mol Biol 9：533-546.

Chuang C-F.and Meyerowitz E.M.(2000)Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990.

Dahmer M.L.，P.D.Fleming，G.B.Collins，and D.F.Hildebrandt.1989.A rapid screening technique for determining the lipid composition of soybean seeds.J.Amer.Oil Chem.Soc.66：543-548.

Dickinson CD，Evans RP and Nielsen NC(1988)RY repeats are conserved in the 5’-flanking regions of legume seed-protein genes.Nucleic Acids Res 16：371.

Dure III L(1989)Characteristics of the storage proteins of cotton.J Am Oil Chem Soc 66：356-359.

Dure III L and Chlan C(1981)Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination.XII.Purification and properties of principal storage proteins.Plant Physiol 68：180-186.

Goldberg RB(1986)Regulation of plant gene expression.Phil Trans R Soc Lond 314：343-353.

Goldberg RB，Barker SJ，and Perez-Grau L(1989)Regulation of gene expression during plant embryogenesis.Cell 56：149-160.

Goldberg RB，de Paiva G and Yadegari R(1994)Plant embryogenesis：zygote to seed.Science 266：605-614.

Goossens A，Dillen W，De Clercq J，Van Montagu M and Angenon G(1999)The arcelin-5 gene of Phaseolus vulgaris directs high seed-specific expression in transgenic Phaseolus acutifolius and Arabidopsis plants.Plant Physiol 120：1095-1104.

Goto F，Yoshihara T，Shigemoto N，Toki S and Takaiwa F(1999)Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene.Nat Biotechnology 17：282-286.

Higgins TJV(1984)Synthesis and regulation of major proteins in seeds.Ann Rev Plant Physiol 35：191-221.

Hitz WD，Yadav NS，Reiter RS，Mauvais CJ and Kinney AJ(1995)Reducing polyunsaturation in oils of transgenic canola and soybean.In：Kader J-C and Mazliak(eds.)Plant Lipid Metabolism(pp.506-508)Kluwer Academic Publishers，Dordrecht.

Horsch RB，Fry JE，Hoffmann N，Neidermeyer J，Rogers SG and Fraley RT(1988)Leaf disc transformation.In：Gelvin SB and Schilperoort RA(eds.)Plant Mol Biol Manual(pp.A5：1-9)Kulwer Academic Publishers，Dordrecht.

Jefferson RA，Kavanagh TA and Bevan MW(1987)GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J 6：3901-3907.

Kawagoe Y，Campell BR and Murai N(1994)Synergism between CACGTG(G-box)and CACCTG cis-elements is required for activation of the bean seed storage protein β-phaseolin gene.Plant J5：885-890.

Kawagoe Y and Murai N(1992)Four distinct nuclear proteins recognize in vitro the proximal promoter of the bean seed storage protein β-phaseolin gene conferring spatial and temporal control.Plant J 2：927-936.

Kim SY，Chung H-J and Thomas TL(1997)Isolation of a novel class of bZIP transcription factors that interact with ABA-responsive and embryo-specification elements in the Dc3 promoter using a modified yeast one-hybrid system.

Plant J 11：1237-1251.

Kinney AJ(1996)Development of genetically engineered oilseeds：From molecular biology to agronomics.In：Williams JP，Khan MU，Lem NW(eds.)，Physiology，Biochemistry and Molecular Biology of Plant Lipids (pp.298-300)Kluwer，Dordrecht.

H Klee，R Horsch，and S Rogers(1987)Agrobacterium-mediated plant transformation and its further applications to plant biology.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.38：467-486.

Klein et al.(1987)High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells.Nature 327：70.

Lessard PA，Allen RD，Fujiwara T and Beachy RN(1993)Upstream regulatory sequences from two β-conglycinin genes.Plant Mol Biol 22：873-885.

Murashige T and Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15：473-497.

Napoli et al.(1990)Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.The Plant Cell 2：270-289.

Nunberg AN，Li Z，Bogue MA，Vivekananda J，Reddy AS and Thomas TL(1994)Developmental and hormonal regulation of sunflower helianthinin genes：Proximal promoter sequences confer regionalized seed expression.Plant Cell 6：473-486.

Nunberg AN，Li Z，Chung H-J，Reddy AS and Thomas TL(1995)Proximal promoter sequences of sunflower helianthinin genes confer regionalized seed-specific expression.J Plant Physiol 145：600-605.

Park Y-D，Papp I，Moscone EA，Iglesias VA，Vaucheret H，Matzke AJM and Matzke MA(1996)Gene silencing mediated by promoter homology occurs at the level of transcription and results in meiotically heritable alterations in methylation and gene activity.Plant J 9：183-194.

Russell DA and Fromm ME(1997)Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice.Transgenic Res 6：157-168.

Seffens WS，Almoguera C，Wilde HD，Haar RAV and Thomas TL(1990)Molecular analysis of a phylogenetically conserved carrot gene：developmental and environmental regulation.Dev Genet 11：65-76.

Shintani D and DellaPenna D(1998)Elevating the vitamin E content of plants through metabolic engineering.Science 282：2098-2100.

Siddiqui NU，Chung H-J，Thomas TL and Drew MC(1998)Abscisic acid-dependent and-independent expression of the carrot late-embryogenesis-abundant-class gene Dc3 in transgenic tobacco seedlings.Plant Physiol 118：1181-1190.

Siebert PD，Chenchik A，Kellogg DE，Lukyanov KA and Lukyanov SA(1995)An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA.Nucleic Acids Res 23：1087-1088.

Soltis PS，Soltis DE and Chase MW(1999)Angiosperm phylogeny inferred from multiple genes as a tool for comaparative biology.Nature 402：402-404.

Sun SSM and Larkins BA(1993)Transgenic plants for improving seed storage proteins.In：Kung S-d and Wu R(eds.)Transgenic plants：engineering and utilization Vol.1(pp.339-372)Academic Press，California.

Sunilkumar G.，J.P.Connell and A.S.Reddy，C.W.Smith，and K.S.Rathore.(2002)Cotton α-globulin promoter：Isolation and functional characterization in cotton，Arabidopsis and tobacco.Transgenic Research 11：347-359.

Sunilkumar G and Rathore KS(2001)Transgenic cotton：factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration.Mol Breeding 8：37-52.

Van der Krol(1990)Inhibition of flower pigmentation by antisense CHS genes：promoter and minimal sequence requirements for the antisense effect.Plant Mol.Biol，14：457-466.

Vaucheret H(1993)Identification of a general silencer for 19S and 35S promoters in a transgenic tobacco plant：90bp of homology in the promoter sequence are sufficient for trans-inactivation.C R Acad Sci.Paris 316：1471-1483.

Vivekananda J，Drew MC and Thomas TL(1992)Hormonal and environmental regulation of the carrot lea-class gene Dc3.Plant physiol 100：576-581.

Wang M-B.and Waterhouse P.M.(2000)High-efficiency silencing of a β-glucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation.Plant Mol.Biol.43：67-82.

Waterhouse P.M.，Graham M.W.and Wang M-B.(1998)Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964.

White P.G.2000.Fatty acids in oilseeds(vegetable oils).Fatty acids in foods and their health implications.C.K.Chow(ed.)Marcel Dekker，Inc.Pp.209-238.

Ye X，Al-Babili S，Kloti A，Zhang J，Lucca P，Beyer P and Potrykus I(2000)Engineering the provitamin A(β-carotene)biosynthetic pathway into(carotinoid-free)rice endosperm.Science 287：303-305.

Claims

1.启动子序列的用途，用于甚至在水胁迫条件下，以种子特异性的方式改变转基因植物中蛋白质的水平，但是不改变该蛋白质在转基因植物的营养组织中的含量，其中所述转基因植物包含与所述启动子序列可操作地连接的、功能性地整合的DNA序列，所述DNA序列编码形成发夹结构的RNA转录本，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中天然基因的转录后基因沉默，所述启动子序列：

(a)为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)包含SEQ ID NO：1的一部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件。

2.植物转化载体的用途，用于转化植物细胞从而获得用于再生转基因植物的转化的细胞，所述转基因植物具有与相同物种的天然植物的种子和营养组织相比，甚至在水胁迫条件下改变的蛋白质水平的种子和未改变的蛋白质水平的营养组织，其中所述植物转化载体包含与所述启动子序列可操作地连接的DNA序列，所述DNA序列编码形成发夹结构的RNA转录本，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述转基因植物中天然基因的转录后基因沉默，所述启动子序列：

(a)为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

3.转化的植物细胞的用途，用于再生转基因植物，所述转基因植物与天然植物的种子和营养组织相比，具有甚至在水胁迫条件下改变的蛋白质水平的种子和未改变的蛋白质水平的营养组织，其中所述转化的植物细胞包含与所述启动子序列可操作地连接的DNA序列，所述DNA序列编码形成发夹结构的RNA转录本，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中天然基因的转录后基因沉默，所述启动子序列为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的缺失片段，其包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件。

4.表达盒的用途，用于当所述盒功能性地整合入转基因植物的基因组中时，甚至在水胁迫条件下，专一地在转基因植物的种子中表达DNA序列，而不在转基因植物的营养组织中表达该DNA序列，其中所述盒包含：

启动子和DNA序列，所述启动子为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的一部分，该部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件，

所述DNA序列与所述启动子序列可操作地连接，所述DNA序列编码形成发夹结构的RNA转录本，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中天然基因的转录后基因沉默。

5.转基因植物或其子代的用途，用于甚至在水胁迫条件下，专一地在种子中改变蛋白质的含量，而不在营养组织中改变该蛋白质的含量，其中所述转基因植物含有功能性表达盒，所述表达盒包含启动子和核酸，所述启动子为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的一部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件，

所述核酸编码形成发夹结构的RNA转录本，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中天然基因的转录后基因沉默。

6.获得生产种子的转基因植物的方法，所述种子具有不同于来自相同物种但未用此方法获得的植物的种子的蛋白质含量，所述方法包括：

a)用表达盒转化宿主植物细胞，所述表达盒包含作为可操作连接组分的下列部分：

(i)启动子，所述启动子为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或含有SEQ ID NO：1的一部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件；和

(ii)编码形成发夹结构的RNA转录本的DNA序列，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中天然基因的转录后基因沉默，

其中所述组分在植物细胞中起作用，藉此所述DNA构建体整合到所述植物细胞的基因组中；

b)从所述转化的植物细胞再生植物；

c)甚至在水胁迫条件下，专一地在种子中表达所述DNA序列，而不在植物的营养组织中表达所述DNA序列；和

d)使所述植物产生具有所述不同蛋白质含量的种子。

7.权利要求6的方法，其中所述AG 5’调控区包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

8.权利要求1至7中任一项的用途，其中所述植物是向日葵、大豆、玉米、棉花、烟草、花生、油料油菜或拟南芥属植物。

9.权利要求1，2，4或5任一项的用途，其中所述部分包含对应于指导种子特异性表达的棉花AG 5’调节区的分离的核酸，所述AG 5’调节区包含启动子，所述启动子为SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

10.权利要求3的用途，其中所述缺失片段包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

11.改变转基因植物的含油种子中脂肪酸水平的方法，包括：

a)提供含有功能性DNA构建体的转基因植物，所述构建体包含作为可操作连接组分的下列部分：

(i)棉花AG基因5′调控区，其为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1的缺失片段，所述缺失片段包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件并促进种子特异性表达；和

(ii)编码形成发夹结构的RNA转录本的至少一种DNA序列，所述发夹结构通过RNA干扰介导所述植物中所述脂肪酸合成基因或脂类代谢基因的转录后基因沉默；

b)在允许种子形成的条件下生长所述植物；和

c)甚至当所述植物受到水胁迫时，在种子中表达所述至少一种DNA序列，而不在植物的营养组织中表达所述DNA序列，

由此获得具有不同于不包含所述功能性DNA构建体的相同物种植物的脂肪酸水平的种子。

12.权利要求11的方法，其中脂肪酸合成基因或脂类代谢基因为δ6-去饱和酶基因、δ12-去饱和酶基因或δ15-去饱和酶基因。

13.启动子序列的用途，用于甚至在水胁迫条件下，以种子特异性的方式改变转基因植物中蛋白质的水平，但是不改变该蛋白质在转基因植物的营养组织中的含量，其中所述转基因植物包含功能性地整合的DNA序列，所述功能性地整合的DNA序列编码与所述启动子序列可操作地连接的反义RNA，所述启动子序列：

(a)为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)包含SEQ ID NO：1的一部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件，以及

所述反义RNA与所述植物中的内源RNA互补。

14.植物转化载体的用途，用于转化植物细胞从而获得用于再生转基因植物的转化的细胞，所述转基因植物具有与天然植物的种子和营养组织相比，甚至在水胁迫条件下改变的蛋白质水平的种子和未改变的蛋白质水平的营养组织，其中所述植物转化载体包含DNA序列，所述DNA序列编码与所述启动子序列可操作地连接的反义RNA，所述启动子序列为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的一部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件。

15.转化的植物细胞的用途，用于再生转基因植物，所述转基因植物具有与天然植物的种子和营养组织相比，甚至在水胁迫条件下改变的蛋白质水平的种子和未改变的蛋白质水平的营养组织，其中所述转化的植物细胞包含DNA序列，所述DNA序列编码与所述启动子序列可操作地连接的反义RNA，所述启动子序列为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的缺失片段，其包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件，所述反义RNA与天然植物基因互补。

16.表达盒的用途，用于当所述盒功能性地整合入转基因植物的基因组中时，甚至在水胁迫条件下，专一地在转基因植物的种子中表达DNA序列，而不在转基因植物的营养组织中表达该DNA序列，其中所述盒包含启动子，所述启动子为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO：1的部分，该部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件，其中所述盒还包含与所述启动子序列可操作地连接的DNA序列，所述DNA序列编码与天然植物基因反义的RNA转录本。

17.转基因植物或其子代的用途，用于甚至在水胁迫条件下，专一地在种子中表达蛋白质，而不在营养组织中表达该蛋白质，其中所述转基因植物含有功能性表达盒，所述表达盒包含启动子和核酸，所述启动子为：

(a)SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或

所述核酸编码与转基因植物相同物种的天然植物基因反义的RNA转录本。

18.权利要求13至17中任一项的用途，其中所述植物是向日葵、大豆、玉米、棉花、烟草、花生、油料油菜或拟南芥属植物。

19.权利要求13，14，16或17任一项的用途，其中所述部分包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

20.权利要求15的用途，其中所述缺失片段包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

21.获得生产种子的转基因植物的方法，所述种子具有不同于来自相同物种但未用此方法获得的植物的种子的蛋白质含量，所述方法包括：

(i)启动子，所述启动子为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或含有SEQ ID NO：1的部分，其中所述部分包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件；和

(ii)DNA序列，所述DNA序列编码与转基因植物相同物种的天然植物基因反义的RNA转录本，

b)从所述转化的植物细胞再生植物；

d)使所述植物产生具有所述不同蛋白质含量的种子。

22.权利要求21的方法，其中所述AG 5’调控区包含SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列。

23.改变转基因植物的含油种子中脂肪酸水平的方法，包括：

(i)棉花AG 5′调控区，其为SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO：1的缺失片段，所述缺失片段包含SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列以及由SEQ ID NO：1的核苷酸655-662、667-672、675-680、774-779、791-796、796-801和906-911组成的顺式元件并促进种子特异性表达；和

(ii)编码RNA转录本的至少一种DNA序列，所述RNA转录本与转基因植物相同物种的天然脂肪酸合成基因或脂类代谢基因反义；

b)在允许种子形成的条件下生长所述植物；和

24.权利要求23的方法，其中脂肪酸合成基因或脂类代谢基因为δ6-去饱和酶基因、δ12-去饱和酶基因或δ15-去饱和酶基因。