WO2014029044A1

WO2014029044A1 - 充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

Info

Publication number: WO2014029044A1
Application number: PCT/CN2012/001265
Authority: WO
Inventors: 王海波; 董福双; 吕孟雨; 张艳敏; 任志恒; 杨帆; 梁新潮; 左文博; 石学萍; 张欢欢; 高义平; 赵和; 徐显; 孙果忠; 柴建芳; 刘永伟; 朱金永; 韩秋芬; 张强; 马辉杰
Original assignee: 河北省农林科学院遗传生理研究所
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2014-02-27
Also published as: CN102876712B; CN102876712A; US20150344897A1

Abstract

本发明提供了一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，包括：将种子萌发至芽0.2~2cm时，去除胚芽鞘暴露生长点，用刷毛单根直径4~20μm、露出长度0.5~3mm、根数100-5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对生长点刺刷，T₁代进行鉴定。本发明适用于所有结种子的单子叶植物，在小麦、水稻、玉米的遗传转化上，分别获得了转化率为49%、66.3%、100%的转化效果。

Description

充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法

技术领域

本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，适用于所有结种子的单子叶植物。

背景技术

在诸多植物转基因方法中，农杆菌介导法最被普遍认可。它具有获得的转基因植株育性较高、外源基因多以单拷贝或低拷贝在受体中整合、可转移大片段

DNA等优点。但是，目前所有以农杆菌介导为基础的转基因技术，大都离不开组织培养，故存在着受基因型限制、操作复杂、需借助抗性标记筛选、周期长、转化效率低、转化结果不稳定等突出问题。尤其以小麦、水稻、玉米等为代表的单子叶植物的转基因，受基因型限制问题十分突出，严重影响了技术的发展与应用。

植物种子芽生长点是形成生殖器官和地上大部分营养体的原始细胞群。萌发后的单子叶植物种子芽生长点，具有很强的再生能力和发育补偿能力，去掉芽鞘和已分化的微型幼叶后，乃至受到较强的创伤后，仍能发育成正常植株，是实施转基因的理想受体。

有报道和专利虽也注意到了用种子芽生长点做受体的优势，但对生长点的特点研究不够，未形成稳定、简易、高效的技术方案和技术体系，存在较多问题，如：实施转化处理的时间较晚，导致对生长点的转化覆盖度低；对生长点不做任何创伤处理，或创伤方法不佳，造成的生物伤害过重，而转化所需要的创伤却不够，导致转化效果较差；抗性筛选策略使用不当，容易淘汰"被有效转化"了的嵌合体；当代鉴定不合理，假阳性率高，等等。

中国专利《一种改良的农杆菌介导小麦苗端转化方法》（专利号： 200410075773. 2), 所述主要步骤包括： 1 ) 种子萌发后再 4'C春化 20- 30 2 ) 含有目的基因农杆菌的活化与重悬； 3)对适宜大小的幼苗进行切割，暴露或损伤生长点部位； 4)将含有目的基因的农杆菌菌液滴至幼苗切口处； 5)幼苗恢复生长以及移至土中培养和抗生素筛选获得转基因植株及子代； 6) 转基因植株及子代的鉴定。所述适宜大小的幼苗是指 2- 4cm长的幼苗。上述专利的主要问题如下：

( 1 )春化后进行转化，转化时机过晚，减少了转化的有效覆盖度，在创伤方面为农杆菌介导转化提供的条件不充分，且生物伤害重。

(2)操作难度大、分寸不易把握、工作效率不高。

有些报道，用各种针刺伤转化对象生长点，但所用针的直径普遍较粗 [African Journal for Biotechnology, 2011, 10 (5) : 740-750】，有的甚至达 710 μ m [Journal of bioscience and bioengineering, 2005, 100 (4) : 391-397； 2006， 102 (3) : 162-170], 对生长点造成的生物伤害重，而对转化所需的创伤则造成得不够。有些报道，则是用手术刀片划几下，造成的转化所需的创伤不充分，转化效果不佳；还有不少报道不做任何创伤处理，就用农杆菌进行转化，转化效果难以保障。

总之，很多以生长点为转化对象的专利或报道，仍然未离开"离体培养"环节，而且使用的抗性筛选的策略不够科学。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种不依赖组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、转化效率高、转化效果稳定、操作简易方便、实用性强、易于规模化、耗费成本低的充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。

本发明采用如下技术方案：

一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于- ( 1 )受体及侵染液的准备

挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗， 25Ό下浸泡 7〜10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含 2层滤纸、直径为 90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜， 28°C暗培养发芽 l〜2d; 所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；

划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含 50mg/L卡那霉素、 40mg/L 利福平的 LB液体培养基， 28°C、 220 rpm暗培养至菌液》。=0. 5〜0. 6， 4000rpm 5min离心收集菌体，弃上清液加入 1/5〜1/2所述 LB液体培养基的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含 lOO ii mol/L AS、 100mg/L F68, 400mg/L MES、 1/10 MS的盐、 lOg/L葡萄糖、 40g/L麦芽糖， pH 5. 6；

(2) 芽生长点暴露与微创转化

①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到 0. 2〜2cm时，对于籽粒较大的植物芽伸长到 0. 3〜1CIB时，实施转化处理；

所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉米；

②暴露生长点的方法

对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；

③用微创转基因刷转化

用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷 2〜3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有 2层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置 10〜40粒种子；

(3)共培养

往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为 0. 5〜3ml，盖上皿盖，置于 25'C暗培养 3d;

(4) 苗培养

将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器， 25°C、光照 12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养 7d就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，罩上塑料薄膜， 7〜10d后揭膜；

对于需春化处理的冬小麦，则先 25Γ、光照 12 h/d培养 7 然后转到 8°C的春化箱内春化处理 20〜30d，具体天数因品种而定；

( 5)幼苗移栽

苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田； (6)苗及植株管理

采取水肥措施促进苗健壮发育，促迸多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；

( 7 )分子检测与鉴定

在 T。代不进行检测，以免结果不真实；将 T。代植株所结的种子，按单株收获; 将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在 T\代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行 PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行 PCR检测；对经 PCR鉴定为阳性的材料，进行 Southern blot检测予以确证。

所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4 2(^ 111，每刷的刷毛根数为 100 5000根，刷毛露出长度为 0. 5 3nun

所述微创转基因刷的刷毛单根直径为 8 18 μ ιη，每刷的刷毛根数为大于 100 根、小于等于 2000根，刷毛露出长度为 1 2

所述 "刺刷"为即刺又刷；所述 "刺"为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述 "刷" 为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。

所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和高粱。

本发明的技术原理如下：

申请人研究发现：（1 )萌发后的小麦、玉米、水稻种子去掉芽鞘后即可实施遗传转化处理，对于谷子、黍子、高粱等也如此。据此申请人确定了转化种子芽生长点的最早适宜时期。（2)水稻种子芽生长点细胞的直径约 25 μ ιικ 小麦种子芽生长点细胞的直径约 60 μ πι、玉米种子芽生长点细胞的直径约 50 μ ιη。要获得好的转化效果，必须对生长点进行充分的微创伤。为此，申请人发明了由若干根 ( 100 5000根）微米级刚性纤维（即不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维，单根直径 4〜20 m)组成的可对生长点细胞实施较充分微创伤的转基因工具——微创转基因刷，简称 "微创刷"或 "转基因刷"。用这种微创刷蘸农杆菌介导转化液对生长点细胞实施较充分的微创转化，可获得很好的转化效果。（3)适当控制转化处理后种子芽生长点的水势，可保护受微创的细胞不胀破、促进农杆菌与受创细胞的结合，进而提升转基因的效果。（4)微创转化处理后的种子芽生长点，可以基本不受影响地发育成正常植株并开花结实，比一般的转化技术耗时少。（5) 将转化处理后长成的植株（T。）所结的种子分株收获，再将种子萌发成苗（7\ ) 进行鉴定，不必抗性筛选，结果具体而准确。

在此基础上，申请人还建立了评价这种转基因技术的专门指标：

损伤率与成苗率：用"微创刷 "刺刷生长点时，有些种子的芽生长点难免会因受伤过重而不能成苗。这类种子所占的百分率，即为 "损伤率"：与之对应的便是 "成苗率"。

损伤率 = 麵子数-成雌数 _{χ ιοο%}

处理种子数成苗株数

成苗率 = Χ 100%

处理种子数转化率：转化处理后，所有长成植株中"有转化种子的植株"所占的百分率。有转化种子的株数

转化率 = Χ 100%

结实的总株数转化度：单株种子总粒数中， "转化种子"所占的百分率。此指标反映的是生长点被转化的程度。单株被转化种

子数本发明的有益效果是使农杆菌介导的单子叶植物转基因方法具备了不再依赖组织培养、不再受基因型限制、不再必须抗性筛选，具有操作简易方便、转化效率高、转化效果稳定、实用性强、易于规模化、耗费成本低等诸多优点，适用于所有结种子的单子叶植物。

附图说明

图 1为微创刷的结构示意图。图中， A:刷毛材质为不锈钢纤维的微创刷， B: 刷毛材质为玻璃纤维的微创刷， C: 刷毛材质为碳硅纤维的微创刷， a: 刷毛单根直径为 8 μ πι、刷毛根数为 4000根（不锈钢纤维）的微创刷， b: 刷毛单根直径为 4 μ π 刷毛根数为 200根（不锈钢纤维）的微创刷， c: 刷毛单根直径为 16 μ πκ 刷毛根数为 200根（不锈钢纤维）的微创刷。

图 2为重要禾本科植物芽生长点纵切显微观察图片。图中， Α为小麦芽生长点纵切显微观察图片， B为水稻芽生长点纵切显微观察图片， C为玉米芽生长点纵切显微观察图片。

图 3为典型单子叶植物一小麦生长点微创转化关键图片集锦。图中， a为掰芽暴露生长点图片， b为生长点放大观察图（圆圈所框部分即生长点的位置）， c 为微创转基因刷（局部）， d为用微创刷转化生长点的实况图， e为转化后的种子， f为转化后的芽发育情况， g为 TO代苗， h为 TO代植株， i为 TO代植株结的种子（T1的始点）， j为 T1代幼苗的抗性鉴定（白化的为非抗性株，未白化的为抗性株，抗性株叶子被剪用于分子鉴定）， k为 PCR检测结果图。

图 4为所有参试单子叶植物生长点微创转化当代及后代植株图片集锦。图中， a为转基因防护温室， b为转基因小麦 1\代幼苗， c为转基因水稻 T₂代植株 (结实）， d为转基因玉米 Τ₂代植株， e为转基因谷子 Τ。代植株， f为转基因高粱 T。代植株。

图 5为小麦植株的 GUS基因 PCR检测。图中， 1〜21为被检测样品， 22 为空白对照， 23为阴性对照， 24为阳性对照， 25为 DL2000 marker ₀

图 6为小麦 GUS基因 PCR - Southern检测。图中， CK为阳性对照， 1为空白对照， 2为阴性对照， 3〜11为检测样品。图 7为小麦基因组 Southern blot结果。图中， 1〜6为检测样品， 7为空白对照， 8为阳性对照， M为 markers

图 8为水稻植株的 BAR基因 PCR检测结果。图中， 1为 DL2000 mark, 2 为阳性对照， 3为空白对照， 4为阴性对照， 5〜25为被测样品。

图 9为玉米 T\植株 BAR基因 PCR检测结果。图中， M为 DL2000 mark, CK+ 为阳性对照， CK—为阴性对照， 1〜16为被测样品。

图 10为玉米 1\植株基因组 Southern检测结果。图中， M为 mark, 1〜6为被测样品， 7为空白对照， 8为阴性对照， 9为质粒， 10为 PCR产物。

图 11为玉米第 26批转化实验 T₂植株基因组的 Southern blot分析结果。图中， BADH基因表现了双拷贝遗传。

具体实施方式

实施例 1 : 利用微创刷转化冬小麦种子芽生长点的实验

( 1 )材料与方法

小麦品种: "石 4185"。

农杆菌株： EHA105。

外源基因： gus + npt - II，构建于 pCAMBIA2201质粒中。

挑取单菌落，接到 50ml含 50ing/L卡那霉素、 40mg/L利福平的 LB液体培养基中，于 28°C、 220rpm条件下培养至菌液 0D₆。。=0. 6， 4000rpm、 5min离心收集菌体，弃上清液加入 1/2所述 LB液体培养基体积的侵染基液 (含 100 y ni_Ol/L AS、 100mg/L F68> 400/L MES, 1/10 MS盐， lOg/L葡萄糖， 40g/L麦芽糖， pH 5. 6) 摇匀制备成农杆菌介导转化液。

选取饱满整齐的种子 90粒， 25Ό浸泡 7h后，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含 2层滤纸、直径为 90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜 28 暗培养 Id; 86粒正常萌芽，胚芽鞘长度达到 0. 2〜0. 5cm，用摄子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为 12 μ πι、每刷刷毛根数为 5000根、刷毛露出长度为 3mm)蘸取农杆菌介导转化液对准芽生长点刺刷 2〜3次，然后按芽生长点向上的方向摆放于灭过菌的加有 2 层滤纸、 0. 5ml无菌水的直径 90瞧的玻璃皿中，每皿中放置 40粒种子，盖上皿盖，置于 25°C暗培养 3d。完成共培养后，将被转化的种子转入装有疲石的培养钵内，浇水浸润蛭石，于 25°C、光照 12h/d培养恢复生长 7d，转入 8°C的春化箱内春化 20d。完成春化后移栽于按转基因要求进行防控的温室，成熟后分株收获。

将单株收获的种子，按 T。株号分组浸泡于 75mg/L的卡那霉素水溶液里（按平均每粒种子 lmL加液），浸种至露白（25'C、 Id),然后播种于装有蛭石的营养钵，将蛭石用水浸润，于 25°C、光照 12h/d培养 7d，统计绿苗率和出现绿苗的 T。代株数。将绿苗逐株剪取部分叶片后，置于 8°C、光照 12h/d条件下春化 25d。

将剪取的叶片分别提取 DNA, 用 GUS基因的引物（上游： 5 ' - C CGA ACT GAA CTG GCA G -3 ' ；下游： 5' - CAT CAC CAC GCT TGG GTG -3' ) 进行 PCR 检测。根据单株籽粒苗（Τ,) 出现 PCR阳性结果的情况测算转化度；根据 T。代株是否出现 PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。随机选取 PCR阳性株重新提取基因组 DNA，进行 PCR_Southern bloto 根据 PCR-Southern blot结果再进行总基因组 Southern blot检测确证（委托美博莱公司完成）。

(2)实验结果

90粒种子中 86粒正常萌芽，对所有正常萌芽的种子进行转化， 62株成苗并移栽成活，损伤率 28%。其中， 53株正常结实， 9株因管理不善种子干瘪。分别收取 53个 T。株上的种子进行卡那霉素抗性鉴定， 43个株系出现抗性绿苗， T。抗性率达 81, 1% (43+53 X 100%)。对来自 43个 T。株系的 373株绿苗进行 PCR检测 (图 5)，有 111株为 PCR阳性，来自于 26个 T。株系。以 53个 T。株为基数进行推算，转化率达 49% (26+53 X 100%)。 26个结阳性后代的 T。株中，转化度最高的为 37. 1% (23 + 62 X 100%，即单株结实为 62粒，萌苗后经 PCR检测 23株为阳性）；转化度最低的为 2. 6% ( 1 ÷39X 100%, 单株结实 39粒，萌苗后 1株 PCR 阳性）。随机选取 9个 PCR阳性株进行 PCR-southern blot检测，全部杂交出与阳性质粒相同的条带（图 6)，进行 Southern blot鉴定，也获得了阳性结果（图 7) ，证明外源基因整合到了小麦基因组中。实施例 2: 利用微创刷转化不同基因型小麦种子芽生长点的实验 ( 1 )材料与方法

小麦品种： "金禾 9123"、 "中国春"、 "Bobwhite"。

农杆菌株： C58C1

外源基因： gus + npt-II, 构建于 pCAMBIA2201质粒中。

挑取单菌落，接到 50ml含 50mg/l卡那霉素 +40mg/l利福平的 LB液体培养基中，于 28t：、 220 rpm条件下培养至菌液 OD6o。=0. 5， 4000rpm、 5min离心收集菌体，弃上清液加入 1/5所述 LB液体培养基体积的侵染基液 (含 100 ii _mol/L AS、 100rag/L F68、 400/L ES, 1/lOMS盐， lOg/L葡萄糖， 40g/L麦芽糖， pH 5. 6) 摇匀制备成农杆菌介导转化液。

分别选取 3个小麦基因型的合格种子， 25Ό下浸泡 10h后，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含 2层滤纸、直径为 90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜， 28°C暗培养 Id;芽伸长到 0. 2〜0. 4cm, 用镊子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为 18 μ πκ 刷毛根数为 100根、刷毛露出长度为 3麵)蘸取农杆菌介导转化液对准生长点刺刷 2〜 3次，然后按芽生长点向上的方向摆放于灭过菌的加有 2层滤纸、 0. 5ral无菌水的直径 90 画的玻璃皿中，盖上皿盖，置于 25Ό暗培养 3d。完成共培养后，将被转化的种子转至装有蛭石的钵器，浇水浸润蛭石，于 25°C、光照 12h/d培养恢复生长 7d。此后，对于春性品种直接移栽于按转基因要求进行防控的温室；对于冬性品种转入 8Ό的春化箱内春化 30d, 然后再移栽于温室。成熟后分株收获种子。

将单株收获的种子，按 T。代株号分组浸泡于 75mg/L的卡那霉素水溶液里（按平均每粒种子 lmL加液），浸种至露白（25°C、 1. 5d)，然后播种于装有蛭石的营养钵，将蛭石浇水浸润，于 25Ϊ；、光照 12h/d培养 7d, 统计绿苗率和出现绿苗的 T。代株数。将绿苗逐株剪取部分叶片后，冬性品种置于 8°C、 12h/d光照条件下春化 30d; 春性品种直接移栽于温室。

将剪取的叶片分别提取 DNA，用 GUS基因引物（上游： 5' - CAA CGA ACT GAA CTG GCA G -3' ；下游： 5' - CAT CAC CAC GCT TGG GTG -3' )进行 PCR。根据单株籽粒苗（TJ中出现 PCR阳性的结果情况测算转化度；根据 T。代植株是否出现 PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。

(2) 实验结果

用微创刷转化 "金禾 9123"、 "中国春"、 "Bobwhit" 3个基因型的种子芽生长点均获成功，表明利用微创转基因刷转化小麦芽生长点可适应于多个基因型。

① "金禾 9123": 对 60粒正常萌芽种子的生长点实施转化，有 50粒发育成株并正常结实。其中，有 29个株系出现抗性绿苗，绿苗总数达 181株。对所有的绿苗（Τ,)进行 PCR检测，有 77株为 PCR阳性，分别来自于 17个 T。株，转化率为 34.0% (17÷50X100%) 。

② "中国春"：对 30粒正常萌芽的种子实施转化，有 15株正常结实。其中，有 7个株系出现了抗性绿苗，共 59株。对所有绿苗进行 PCR检测，有 29株为 PCR阳性，分别来自于 5个 T。株，转化率为 33.3% (5+15X100%) 。

③ " Bobwhit":对 30粒正常萌芽的种子实施转化，有 21株发育至正常结实。其中，有 8个株系出现了抗性绿苗，共 47株。对所有绿苗进行 PCR检测，有 23 株为 PCR阳性，分别来自于 6个 T。株，转化率为 28.6% (6+21X100%) 。

实施例 3: 利用微创刷转化水稻种子芽生长点的实验

(1)材料与方法

水稻品种： "龙稻 10"。

农杆菌株： EHA105。

外源基因： gus bar, 构建于 pCAMBIA3301质粒中。

挑取单菌落，接到 50ml含 50mg/l卡那霉素、 40mg/l利福平的 LB液体培养基中，于 28°C、 220 rpm条件下培养至菌液 0D₆。。=0.6， 4000rpm 5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于 1/2 所述 LB液体培养基体积的侵染基液（含 lOO mol/L AS, 100mg/L F68, 400rag/LMES, 1/10 MS盐， lOg/L葡萄糖， 40g/L 麦芽糖， pH 5.6) 摇匀制备成转化液。

选取饱满整齐的种子 120粒，去除种壳，消毒后摆放在经过高温灭菌带有 2 层滤纸并加有 8ml无菌水的直径 90隱培养皿中， 28°C萌发 1. 5d， 117粒正常萌芽，芽长度达到 0. 2cra左右。用镊子掰芽暴露生长点，用微创转基因刷（规格：刷毛单根直径为 S ji ffl,刷毛根数为 200根，刷毛露出长度为 0. 5MB)蘸取转化液对准生长点刺刷 2〜3次，摆放于滴加 lmL无菌水、灭过菌的含 2层滤纸、直径 90 馳的无菌培养皿中，置于 25°C暗培养 3d。共培养结束后，移播于按要求防护的温室，上面铺盖草苫，每天喷水 2次，温度控制在 25°C， 7d后揭去草苫，正常管理至成熟。成熟后单株收获，并将每株的主穗与分孽穗分开保存。

将单株收获的种子，按 T。代植株分组从每个主穗上均匀选取 10粒种子，进行萌发后播种于温室中（若选取的 10粒种子经检测均为阴性，则把该 T。代株主穗其余的种子全部萌发后播种成苗检测），当其长至 1叶 1心时，剪取的部分叶片分别提取讓, 用 BAR基因引物 (上游: 5 ' - TCA AAT CTC GGT GAC GGG CA - 3 ' ；下游： 5 ' - GGT CTG CAC CAT CGT CAA CC -3 ' )进行 PCR。根据单株籽粒苗（L )出现 PCR阳性的结果情况测算转化度；根据 T。株是否出现 PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。

( 2 ) 实验结果

120粒种子中，有 117粒正常萌发。对正常萌芽种子实施转化后， 77株成苗并移栽成活，损伤率 34. 2%，其中 71株结实、 6株因管理不善未能结实。分别收取 71个 T。株上的种子，按 T。株分组从每个主穗上均匀选取 10粒种子进行萌发后播种。长至 1叶 1心时，提取基因组 DNA进行 PCR检测（图 8)，结果表明：被检测的 786株中，有 153株为 PCR阳性，来自于 47个 T。代株系。由此推算，转化率达 66. 3% (47 + 71 X 100%)。 47个阳性 T。代株的 "参考转化度" （因未全部对所结种子进行检测而这样表述）最高的为： 100%，即检测 10株， 10株全部为阳性；最低转化度为 4. 8%，检测 21株， 1株为阳性。

实施例 4: 利用微创刷转化水稻种子芽生长点导入 BADH基因的实验

( 1 )材料与方法

水稻品种： "中花 11 "。

农杆菌株： EHA105。外源基因： badh + npt-II, 构建于 pBIN438质粒中。

挑取单菌落，接到 50ml含 50mg/l卡那霉素、 40 /1利福平的 LB液体培养基中，于 28。C、 220 rp/n条件下培养至菌液 0 _∞=0.5, 4000rpm、 5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于 1/4 所述 LB 液体培养基体积的侵染基液（含 100ymol/L AS. 100mg/LF68、 400mg/L ES, 1/10 MS盐， lOg/L葡萄糖， 40g/L 麦芽糖， _PH 5.6) 摇匀制备成转化液。

选取饱满整齐的种子 10粒，去除种壳，消毒后摆放在经过高压灭菌带有 2 层滤纸并加有 8ml无菌水的直径 90瞧培养皿中， 28°C条件下萌发 1.5d， 26粒正常萌芽，芽长度达到 0.2cm左右，用镊子掰芽，用微创转基因刷（规格：单根直径为 8ϋ ra、每刷根数为 300根，刷毛露出长度为 lfflin)蘸取转化液对准生长点部位刺刷 2〜3次，摆放于滴加 lmL无菌水、灭过菌的含 2层滤纸、直径 90 瞧的无菌培养皿中，置于 25Ό暗培养 3d。共培养结束后，移播于温室，上面罩盖塑料薄膜。 10d后揭去薄膜，正常管理至成熟。成熟后按单株收获，并分别保存。将收获的种子，按 T。株分组分别萌发后播种于温室，当长至 1叶 1心时，分别剪取部分叶片提取 DNA, 用 BADH基因的引物（上游： 5' - ATT GGC ATC TGT GAC TT - 3' ；下游： 5' -CAC TCG CTT GAC TCC TTC -3' ) 进行 PCR。根据每个 T。单株籽粒苗（1\)出现 PCR阳性的情况测算转化度；根据 Τ。株是否出现 PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。

(2) 实验结果

所选 10粒种子均正常萌芽，对其实施转化后， 7株成苗并移栽成活，有 4 株结实。分别收取 4个 Τ。株系上的种子，按 Τ。株分组萌发播种所有的种子，得 91株苗。长至 1叶 1心时，提取基因组 DNA进行 PCR检测，有 9株为 PCR阳性，来自于 2个 Τ。株系。由此推算，转化率达 50% (2+4X100%)。其中：株系 3， PCR检测 12株，有 6株为阳性，转化度为 50% (6+12X100%); 株系 4， PCR检测也是 12株，有 3株为阳性，转化度为 25% (3+12X100%)。

实施例 5: 利用微创刷转化玉米种子芽生长点的实验

(1) 材料与方法转化对像：玉米自交系 HY489。

农杆菌株： EHA105o

外源基因： ba bt +pta, 构建于 pCAMBIA3300。

挑取单菌落，接种到 50ml含有 50mg/L卡那霉素 +40mg/L利福平的 LB液体培养基中，于 28。C、 220 rpm培养至菌液 0D₆。。=0. 6, 4000rpm、 5min离心收集菌体，弃上清液重新悬浮于 1/2所述 LB液体培养基体积的侵染基液（lOO n mol/L AS、 100mg/L F68、 400 mg/L MES, 1/10MS盐， lOg/L葡萄糖， 40g/L麦芽糖， pH 5. 6) 摇匀制备成农杆菌介导转化液。

选取饱满整齐无霉变的种子 20 粒，于 2%的次氯酸钠溶液（20ml ) 中消毒 20min, 无菌水洗 5遍，放入灭过菌、加有 2层滤纸的直径 90細玻璃培养皿中，加 13ml无菌水，盖上皿盖， 28Ό暗培养 2d，胚芽鞘长度达 0. 3〜0. 6cm。

将萌发的种子去除胚芽鞘，暴露出茎生长点，用刷毛单根直径为 20微米、刷毛根数为 2000根、刷毛露出长度为 3mm的微创转基因刷，蘸取转化液对准茎生长点刺刷 2〜3次，摆放于灭过菌的、含 2层滤纸的直径 90mm的玻璃培养皿中，加 3ml无菌水，盖上皿盖， 25°C暗培养 3d。完成共培养后，将被转化的种子转入装有蛭石的培养钵，用水湿润蛭石，于 25°C、自然光照下培养恢复生长 7d, 移栽到按标准防护的温室，待植株长至抽雄抽丝期，适时套袋防护，并自交。

按 T。代株分组将收获的种子萌发，在1代提取叶片 DNA进行 PCR检测，根据检测结果计算转化率和转化度。对 PCR检测阳性的部分植株送交北京美莱博医学科技有限公司进行 Southern blot检测鉴定。

( 2 ) 实验结果

所选的 20粒玉米种子中， 15粒发芽良好，对其种子芽生长点实施转化处理后，有 9个发育成株，其中 3株因管理不善夭亡、 6株结实。取这 6个植株所结的部分种子 (每株 20粒）萌苗（Τ, ) 提取舰进行 PCR鉴定（图 9)，测得 39 株为阳性，来自于 5个 Τ。株。其中，第 3号株一开始没检测到阳性，后又从 3 号株所结种子中取 36粒再次萌苗检测，有 7株为阳性。由此测得， 6个 Τ。株均有阳性后代产生，转化率达了 100%，参考转化度为 5%〜70% (见汇总表）。 Southern blot结果显示，外源基因以单拷贝的形式整合到了玉米基因组（图 10)。

玉米生长点为创转化的参考转化度汇总表 τ。株号 1 2 3 4 5 6 检测株数 20 20 20+36 20 20 20

)

阳性株数 14 1 7 5 10 9

)

参考转化度 70 5 12. 5 25 50 45

(%)

另外，在对第 26批玉米转化实验后代（Τ₂) 的基因组 Southern blot测验中，获得了目标基因双拷贝遗传的结果（图 11)。

实施例 6: 利用微创刷转化谷子、黍子、高粱芽生长点的实验

( 1 )材料与方法

转化对象：黄谷、红谷；红黍、白黍；高粱。

农杆菌株： ΕΗΑί05。

外源基因- gvs + npt~II, 构建于 pCAMBIA2201质粒中。

挑取单菌落，接到 50ml含 50mg八卡那霉素、 40tng/l利福平的 LB液体培养基中，于 28°C、 220 rpm条件下培养至菌液 OD₆。。=0. 6， 4000rpm、 5min离心收集菌体，重新悬浮于 1/3所述 LB液体培养基体积的侵染基液（含 100 _{y rao}l/L AS、 100mg/L F68, 1/丽 S盐, 400mg/L MES, 10g/L葡萄糖， 40g/L麦芽糖， pH 5. 6) 摇匀制备成农杆菌介导转化液。

选取黄谷、红谷、红黍、白黍、高粱饱满整齐的种子，分别去除种壳、消毒后摆放在经过高压灭菌带有 2层滤纸并加有 8ml无菌水的直径 90瞧培养皿中， 28°C条件下萌发 1. 5d，此时芽伸长至 0. l〜2cm (此时三类作物的地中茎长度均已伸长，谷子 >黍子 >高粱），在紧靠地中茎和生长点结合部形成的折光带的上方切去叶鞘及伸长的小叶片暴露生长点，用微创转基因刷（黄谷、红谷所用微创转基因刷规格：刷毛单根直径为 4 μ πι，每刷根数为 90根，刷毛露出长度为 0. 5mm; 红黍、白黍所用微创转基因刷规格：刷毛单根直径为 8 m，每刷根数为 Ϊ00根，刷毛露出长度为 1. 0m; 高粱所用微创转基因刷规格. · 刷毛单根直径为 10 ϋ ΐη, 每刷根数为 300根，刷毛露出长度为 1.5mm)蘸取转化液对准生长点刺刷 2〜3 次，摆放于滴加 lmL无菌水、灭过菌的含 2层滤纸、直径 90 mm的无菌培养皿中，置于 25C暗培养 3d。共培养结束后，移播于温室，上面罩盖塑料薄膜。 10d后揭膜，正常管理至成熟。

单株收获每个结实株的种子，并将穗子顶部 1/10的籽粒做进一步分收，分别从顶部籽粒中选取 10种子，按 T。代株号分组萌发播种于温室，待长至 2叶 1 心时，剪取部分叶片分别提取 DNA，用^^的引物（下游： 5' - CAA CGA ACT GAA CTG GCA G -3' ；下游： 5' - CAT CAC CAC GCT TGG GTG _3' )进行 PCR。根据 T。单株是否出现 PCR阳性后代判断是否被有效转化，并测算转化率。

(2) 实验结果

三种作物 5个品种经对种子芽生长点微创转化后，均获得转基因株，证明了利用微创刷进行转化的广泛适应性。详细情况如下：

①黄谷：对 17粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有 13粒发育成株并正常结实，对各 T。株系的 1幼苗进行 PCR检测，有 5个株系出现 PCR阳性苗，转化率达 38.5% ( 19+40X100%) 。

②红谷：对 31粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有 29粒发育成株并正常结实，对各 T。株系的 1幼苗进行 PCR检测，有 15个株系出现 PCR阳性苗，转化率达 51.7% (15+29X100%) 。

③红黍：对 22粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有 20粒发育成株并正常结实，对各 T。株系的 1幼苗进行 PCR检测，有 13个株系出现 PCR阳性苗，转化率达 65.0% (13 + 20X100%) 。

④白黍：对 42粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有 40粒发育成株并正常结实，对各 T。株系的 1\幼苗进行 PCR检测，有 19个株系出现 PCR阳性苗，转化率达 47.5% (19 + 40X100%) 。

⑤高粱：对 17粒正常萌芽种子的生长点实施转化后，有 15粒发育成株并正常结实，对各 T。株系的 1^幼苗进行 PCR检测，有 11个株系出现 PCR阳性苗，转化率达 73.3% (11 + 15X100%) 。

Claims

权利要求书

1、一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：

( 1 ) 受体及侵染液的准备

挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗， 25'C下浸泡 7〜10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含 2层滤纸、直径为 90mm的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜， 28Ό暗培养发芽 l〜2d; 所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；

划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含 50mg/L卡那霉素、 4(kg/L 利福平的 LB液体培养基， 28Ό、 220 rpm暗培养至菌液 OD₆。。=0. 5〜0. 6， 4000rpm、 5min离心收集菌体，弃上清液加入 1/5〜1/2所述 LB液体培养基体积的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含 100 m_Ol/L AS、 100mg/L F68、 400mg/L MES、 1/10 MS的盐、 lOg/L葡萄糖、 40g/L麦芽糖， pH 5. 6；

(2 )芽生长点暴露与微创转化

①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到 0. 2〜2ctn时，对于籽粒较大的植物芽伸长到 0. 3〜lcm时，实施转化处理；

②暴露生长点的方法

③用微创转基因刷转化

( 3)共培养往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为 0. 5〜3ml，盖上皿盖，置于 25°C暗培养 3d;

(4) 苗培养

将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器， 25°C、光照 12h/d培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养 7d就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，覆罩上塑料薄膜， 7〜10d后揭膜；

对于需春花处理的冬小麦，则先 25°C、光照 12 h/d培养 7d, 然后转到 8°C的春化箱内春化处理 20〜30d，具体天数因品种而定；

(5)幼苗移栽

苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；

(6)苗及植株管理

采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；

(7)分子检测与鉴定

在 T。代不进行检测，以免结果不真实；将 T。植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在 L代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行 PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行 PCR检测；对经 PCR鉴定为阳性的材料，进行 Southern blot检测予以确证。

2、根据权利要求 1所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为 4〜20 μ ιη，每刷的刷毛根数为 100〜 5000根，刷毛露出长度为 0. 5〜3麵。

3、根据权利要求 2所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述微创转基因刷的刷毛单根直径为 8〜18 n ιη，每刷的刷毛根数为大于 100根、小于等于 2000根，刷毛露出长度为 1〜2議。

4、根据权利要求 1或 2或 3所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述"剌刷"为即刺又刷；所述"刺"为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，瞄准芽生长点顶部直刺，送入带有外源目的基因的农杆菌；所述"刷"为用蘸过农杆菌介导转化液的微创转基因刷，对整个芽生长点像梳头一样刷划，送入带有外源目的基因的农杆菌。

5、根据权利要求 4所述的一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于所述地中茎不伸长的植物包括小麦和水稻；所述地中茎伸长的植物包括玉米、谷子、黍子和高粱。