CN105002210A

CN105002210A - 一种高效对结缕草进行转基因的方法

Info

Publication number: CN105002210A
Application number: CN201510543772.4A
Authority: CN
Inventors: 王迅; 汪志辉; 张新全; 夏惠; 赖云松; 梁东; 林立金; 唐懿; 张贤聪; 代琳
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明提供了一种高效对结缕草进行转基因的方法，该方法包括如下步骤：1）从结缕草成熟种子中切剥分离出胚，置于愈伤诱导培养基中培养短暂数日，至长出胚根、胚芽，或培养至在胚根胚芽基部出现愈伤组织；2）将步骤1）诱导所得物于渗透培养基中培养6-8小时，培养时，胚的切剥面贴附于培养基上；3）利用基因枪转化法，将外源基因转入步骤2）所得物。本发明转基因操作过程耗时短，省去胚性愈伤诱导过程，仅需不足10天；所得瞬时转化率最高可达62.95%；本发明无需复杂的操作，易于实施。

Description

一种高效对结缕草进行转基因的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高效对结缕草进行转基因的方法。

背景技术

结缕草为多年生草本植物，分布在朝鲜、日本以及中国的河北、安徽、江苏、浙江、福建、山东、东北、台湾等地，生长于海拔200米至500米的地区，多生在山坡、平原和海滨草地。

结缕草具有较强大的根茎、粗糙坚硬的叶子,所以耐践踏；又具有耐干旱、耐痔薄、耐低修剪的优点；同时适应的土壤范围广；被广泛用于运动场草坪、观赏草坪、高尔夫球场、庭院绿化、水土保持等诸多方面。然而，结缕草也有不少缺点，如在自然条件下发芽率很低,种子发芽慢；在高温潮湿的条件下容易染锈病、褐斑病和币斑病；在10-12.8℃之间就开始腿色等等。因此，对结缕草进行耐寒、耐温等方面的培育就显得至关重要，而基因改造是其中的主要手段之一。

不过，在结缕草的基因改造方面，一直存在低转化率和需进行长时体外培养的问题，这大大限制了结缕草优良品种选育工作的开展。

在现有研究中，基因枪转化法和农杆菌介导转化法是常用的转基因方法。在进行转基因操作时，匍匐茎节、原生质体、悬浮细胞、植物分生干细胞和胚性愈伤组织等均可作外植体，其中胚性愈伤组织较为常用。

然而，利用上述外植体时，转化率不仅较低，更重要是的体外培养时间较长，且操作复杂。具体而言，由于结缕草生长较为缓慢，胚性愈伤组织的形成时间大约为3个月，因此在转基因前至少需进行3个月的胚性愈伤组织的筛选工作，极大的阻碍了结缕草优良品种选育工作的开展。

另外，胚性愈伤组织的诱导率低，通常需要经验丰富操作人员来辨别挑选；而悬浮细胞和原生质体需要长时间的专业培养，这些操作的复杂度更进一步延缓了本领域工作的进程。

因此，亟需寻找一种操作简便、转化率高且耗时较短的结缕草的转基因方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效对结缕草进行转基因的方法，该方法不仅操作简便、转化率高，更重要的是所需时间非常短，该方法包括如下步骤：

1）从结缕草成熟种子中切剥分离出成熟胚，置于愈伤诱导培养基中培养；培养至长出胚根、胚芽，或培养至在胚根胚芽基部出现愈伤组织；

2）将步骤1）诱导所得物于渗透培养基中预培养6-8小时；

3）利用基因枪转化法，将外源基因转入步骤2）所得物。

本发明的发明人经过大量实验摸索发现，利用上述方法对结缕草进行转基因操作，因为省去了胚性愈伤组织诱导的过程，这一过程在结缕草上通常需要2-3个月，使原本需要约3个月的实验缩减为不到10天。并且获得了较高的瞬时转化率（转入基因材料与待转材料的比例），可达50%以上。

在植物的转基因工作中，由于物种特性的差异性较大，各物种最佳的转基因方法也不尽相同；同时，对于某种或某类植物而言，如何提高其基因转化率和操作所需时间，也尚未达成共识。如《植物转基因技术的进展存在问题及突破方向》（董福双，河北农业科学, 2011,15(3): 57-65）所记载，利用不同转化方法对不同作物进行转基因操作，转化率的差异十分巨大，转化率可低至小于0.5%，且可重复性差。

本发明的发明人创造性的以经过预培养的成熟胚作为外植体，并利用基因枪转化法进行转基因操作，令人惊喜的获得了高于50%的瞬时转化率，最高可达62.95%。本领域人员应当知晓，利用仅仅需要预培养几天的成熟胚作为外植体，并直接将其进行转基因操作，所需的时间是非常短的。因此，本领域人员应当理解，本发明的贡献在于在大幅缩短结缕草转基因过程所需的时间的前提下，获得了优异的结缕草转基因的转化率。

优选的，所述愈伤诱导培养基的组分包括包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L^-1蔗糖、4 mg L^-1 维生素B1、100 mg L^-1α-酮戊二酸、5 mg L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L^-16-苄氨基腺嘌呤；所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8，用2g L^-1植物凝胶固化。

所述步骤1）的培养时间为1-8天。优选的，所述培养时间为1-4天。更优选的，所述培养时间为1-2天，以胚根刚从胚中长出为准。最佳培养时间为3-4天，以胚根继续生长，胚芽开始出现，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织为准。

以胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织的预培养成熟胚作为外植体时，如本发明的实施例所示，所得的转化率最高。

优选的，所述渗透培养基的组分包括包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L^-1蔗糖、4 mg L^-1 维生素B1、100 mg L^-1α-酮戊二酸、5 mg L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L^-16-苄氨基腺嘌呤、0.3M 山梨糖醇、0.3M 甘露醇；所述渗透培养基的pH值为5.8，用2g L^-1植物凝胶固化。

优选的，所述方法还包括在步骤1）前对结缕草成熟种子进行预处理，和/或，在步骤3）之后将转化后的所得植物组织于渗透培养基中继续培养至少24小时后再转入愈伤组织继代培养基（与愈伤诱导培养基基本相同，除了2,4-D浓度改为2 mg L^-1）中培养；

所述预处理步骤包括：

A）将种子在水中浸泡2天；

B) 置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。

优选的，所述基因枪转化法包括步骤：

所述外源质粒为pUC19和pAcH1中的至少一种。

优选的，所述外源基因的质粒为pUC19-gfp和pAcH1-hpt两种质粒的混合质粒；所述pUC19-gfp含有绿色荧光蛋白报告基因gfp基因，所述pAcH1-hpt含有潮霉素抗性选择基因hpt基因。本领域人员应当理解，pUC19-gfp和pAcH1-hpt只是可以用于本发明转基因操作的质粒，并不是对本发明的适用范围的限定。

本发明的有益效果

1）本发明转基因操作过程耗时短，仅需不到10天；

2）本发明所得转化率最高可达62.95%。

3）本发明无需复杂的操作，易于实施。

附图说明

图1为对成熟胚培养不同时间后的形态图；

图2为本发明实施例的转化率结果图；

图3为本发明实施例1中第2组转化荧光效果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1）将结缕草种子在水中浸泡2天；置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗；

2）从成熟种子上切剥分离出胚，分为4组，并置于愈伤组织培养基中培养；其中第1组培养1-2天，至长出胚根；第2组培养3-4天，使得长出的胚根延长，胚芽出现，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织；第3组培养时间为5-6天，培养至胚根胚芽基部出现愈伤组织；第4组培养时间为7-8天，至愈伤组织稍微变大；

3）将步骤2）所得物置于渗透培养基中培养6-8小时。培养时，第1组和第2组将胚的切剥面贴附于培养基表面培养，第3组和第4组将愈伤组织部分贴附于培养基表面培养。将所述材料紧密排列，置于渗透培养基中央，形成直径约2-2.5cm的圆形。渗透培养基为愈伤组织培养基基础中添加0.3M山梨醇和0.3M甘露醇；

4）取等浓度转入质粒pUC19-gfp和pAcH1-hpt与金粒子混合。基因枪设备使用IDERA GIE-III (Science TANAKA, Ishikari, Hokkaido, Japan)。转入参数：轰击距离为5 cm，轰击气压为5 kg cm^-2，真空压为700 mm Hg。

5）将经基因枪转化后的所得植物组织置于渗透培养基继续培养24小时，再转移至愈伤组织继代培养基中培养；

6）转化后2天，对绿色蛋白荧光点进行计数。

转化率结果如附图2所示。

愈伤组织诱导培养基为：MS基础培养基添加30 g L^-1蔗糖，4 mg L^-1 Thiamine-HCl（维生素B1），100 mg L^-1 α-ketoglutaric acid（α-酮戊二酸），5 mg L^-1 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），0.2 mg L^-1 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），pH值调整为5.8，用2g L^-1植物凝胶固化。

渗透培养基为：愈伤诱导培养基中添加0.3M sorbitol（山梨糖醇）和0.3M mannitol（甘露醇）。

对比实施例1

除不进行第2）步骤和第3）步骤之外，其余与实施例1一致。

Claims

1.一种高效对结缕草进行转基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2）将步骤1）诱导所得物于渗透培养基中预培养6-8小时；

3）利用基因枪转化法，将外源基因转入步骤2）所得物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基的组分包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L^-1蔗糖、4 mg L^-1 维生素B1、100 mg L^-1α-酮戊二酸、5 mg L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L-¹6-苄氨基腺嘌呤；所述愈伤诱导培养基的pH值为5.8，用2g/L植物凝胶固化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）的培养时间为1-8天，优选为1-4天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为1-2天，以胚根刚从胚中长出为准。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为3-4天，以胚根继续生长，胚芽开始出现，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织为准。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述渗透培养基的组分包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L^-1蔗糖、4 mg L^-1 维生素B1、100 mg L^-1α-酮戊二酸、5 mg L^-1 2,4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L^-16-苄氨基腺嘌呤、0.3M 山梨糖醇、0.3M 甘露醇；所述渗透培养基的pH值为5.8，用2g L^-1植物凝胶固化。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤1）前对结缕草成熟种子进行预处理，和/或，在步骤3）之后将转化后的所得植物组织于渗透培养基中继续培养至少24小时后再转入愈伤组织继代培养基中培养；

所述预处理步骤包括：

A）将种子在水中浸泡2天；

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因枪转化法包括步骤：

1）将质粒与金粒子混合；

2）设置转入参数：轰击距离为5 cm，轰击气压为5 kg cm^-2，真空压为700 mm Hg。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因的质粒载体包括pUC19和pAcH1中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述外援基因的质粒载体为pUC19-gfp和pAcH1-hpt；所述pUC19-gfp含有绿色荧光蛋白报告基因gfp基因；所述pAcH1-hpt含有潮霉素抗性选择基因hpt基因。