CN103074367A - 一种苏丹草胚接种转基因技术 - Google Patents

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李杰勤
王丽华
詹秋文
赵庭
周青
万海波
王茂辉
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Abstract

一种苏丹草胚接种转基因技术，属于生物技术领域。将苏丹草种子消毒后充分吸水，用钢针扎刺种胚接种携带双元载体的农杆菌，后将种子放在接种液中抽真空浸泡并2次，充分侵染，再对种子进行暗箱培养，促进农杆菌侵染并在体内大量增殖扩散，再在适宜的条件下育苗，3叶期后进行转基因鉴定。本方法简便，操作容易，费用低廉。

Description

一种苏丹草胚接种转基因技术
技术领域
一种苏丹草胚接种转基因技术涉及生物技术领域中的植物转基因技术。
背景技术
苏丹草转基因技术是采用生物技术方法改造苏丹草品种，培育具有高产、优质、抗虫、抗病等优良特性新品种的最为有效的技术手段。目前苏丹草的转基因一般都采用农杆菌侵染愈伤的方法，该方法先要进行愈伤诱导，然后农杆菌侵染，再用组织培养的方法获得转基因苗。由于苏丹草组织培养难度较大，因此该方法的效率较低，应用困难。
发明内容
本发明的目的是采用一种新的技术路线进行苏丹草转基因的接种处理，以期达到方法易行，操作简单，费用低廉，效果良好的技术效果。
本发明是这样实现的：
1. 一种苏丹草胚接种转基因技术包括接种液接种和暗箱培养，其特征在于，以苏丹草种子为载体，进行刺胚接种加接种液反复真空浸泡、充分接种。它包括①制备双元载体接种液、②苏丹草种子消毒、③无菌水浸种、④刺胚接种、⑤接种液抽真空浸种、⑥暗箱培养、⑦育苗栽培7个步骤。
2.上述7个步骤的具体实施过程如下：
①制备双元载体接种液：将已经转入双元载体的农杆菌接种到100mL的YEP液体培养基中培养2天（培养基中加入100μL的潮霉素和利福平），培养温度为28℃。
②苏丹草种子消毒：选取饱满的苏丹草种子先后用乙醇和84消毒液消毒，消毒结束后用灭菌水洗净种子。
③无菌水浸种：将种子转入灭菌水中28℃浸泡2-24小时，使种子充分吸胀。
④刺胚接种：将吸胀的种子取出置于已灭菌的培养皿中，用已消毒的钢针蘸取OD600为0.6的农杆菌接种液扎刺胚芽，深度大约为1mm。
⑤接种液抽真空浸种：将刺完的种子放在含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中抽真空（-0.1MPa）浸种30min，恢复常压后再抽真空（-0.1MPa）浸种5min。
⑥暗箱培养：将种子置于发芽盒中，22℃恒温培养箱暗湿润培养4天。
⑦育苗和鉴定：将培养后的种子单粒播到营养钵中，置于合适的温度生长，3叶期即可进行转基因植株的鉴定。
本发明的有益效果：一种苏丹草胚接种转基因技术避开了传统的农杆菌侵染愈伤后再组织培养的技术路线，与现有方法相比有以下几个优点：第一，所需时间减少2个月左右，农杆菌浸染法从愈伤诱导到获得转基因植株一般需要3-4个月，本方法从接种开始到鉴定完成仅需1个月；第二，本方法对技术要求不高，而苏丹草组织培养难度大，愈伤易褐化，因此对实验者的技术和实验的条件要求高，而本方法不涉及组织培养过程，因此大大降低了技术难度和实验条件；第三，本方法所需费用较少，现有的转基因技术需要借助植物组织培养技术，而组织培养的各种试剂较贵，而且需要建立组培室并配备大量的仪器设备才能开展工作，而本发明免除了这部分的花费，节约了大量资金。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明进行进一步的描述。
实施例1：将S1305GFP载体转入到苏丹草Sa植株中
①制备双元载体接种液：将已经转入S1305GFP基因的双元载体的农杆菌接种到100mL的YEP液体培养基中培养2天（培养基中加入100μL的潮霉素和利福平），培养温度为28℃。
②苏丹草种子消毒：选取400粒饱满的苏丹草Sa首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒结束后用灭菌水漂洗4次，洗净种子。
③无菌水浸种：将种子转入灭菌水中30℃浸泡24小时，使种子充分吸胀。
④刺胚接种：将吸胀的种子取出置于已灭菌的培养皿中，用已消毒的钢针蘸取OD600为0.6的农杆菌接种液扎刺胚芽，深度大约1mm。
⑤接种液抽真空浸种：将刺完的种子放在含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中抽真空（-0.1MPa）浸种30min，恢复常压后再抽真空（-0.1MPa）浸种5min。
⑥暗箱培养：将处理好的N108种子置于发芽盒中，22℃恒温培养箱暗湿润培养4天。
⑦育苗和鉴定：将培养后的种子单粒播到营养钵中，置于22℃下生长，3叶期进行转基因植株的鉴定。
经鉴定，通过以上步骤在23株Sa幼苗中获取了2株转基因植株。历时8天，比现有的转基因技术减少80天左右。

Claims (9)

1.一种苏丹草胚接种转基因技术包括接种液接种和暗箱培养，其特征在于，以苏丹草种子为载体，进行刺胚接种加接种液反复真空浸泡、充分接种。
2.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于它包括①制备双元载体接种液、②苏丹草种子消毒、③无菌水浸种、④刺胚接种、⑤接种液抽真空浸种、⑥暗箱培养、⑦育苗栽培7个步骤。
3.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的制备双元载体接种液的做法是：将已经转入双元载体的农杆菌接种到100mL的YEP液体培养基中培养2天，培养温度为28℃。
4.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的苏丹草种子消毒的做法是：选取饱满的苏丹草种子先后用乙醇和84消毒液消毒，消毒结束后用灭菌水洗净种子。
5.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的无菌水浸种的做法是：将种子转入灭菌水中28℃浸泡2-24小时，使种子充分吸胀。
6.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的刺胚接种的做法是：将吸胀的种子取出置于已灭菌的培养皿中，用已消毒的钢针蘸取OD600为0.6的农杆菌接种液扎刺胚芽，深度大约为1mm。
7.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的接种液抽真空浸种的做法是：将刺完的种子放在含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中抽真空到-0.1MPa浸种30min，恢复常压后再抽真空到-0.1MPa浸种5min。
8.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的暗箱培养的做法是：将种子置于发芽盒中，22℃恒温培养箱暗湿润培养4天。
9.根据权利要求2所述的转基因技术，其特征在于所述的育苗和鉴定的做法是：将培养后的种子单粒播到营养钵中，置于合适的温度生长，在出现3片叶时即可进行转基因植株的鉴定。
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