CN111316918A - 一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，属于植物组培领域。本发明在组培苗生长20‑30天后，将其移入水培箱水培2周，然后将分株较多的马铃薯组培苗剪成数株，将单株或分株较少的马铃薯组培苗剪去顶芽，再进行水培。本发明方法可加快马铃薯组培苗的培养速度，而且能充分利用温室空间，特别适用于有限的温室空间和较大群体的致病疫霉生理小种的检测。
Description
技术领域
本发明属于植物组培领域，具体涉及一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法。
背景技术
马铃薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的对马铃薯具有毁灭性的病害，严重威胁着马铃薯的生产。因此，为了更加有效的预防和控制马铃薯晚疫病，需要对致病疫霉生理小种进行研究。而在生理小种的检测过程中，需要对马铃薯抗性组培苗进行种植。常规马铃薯抗性组培苗的种植方法是直接将生长约一个月左右的马铃薯抗性组培苗放入土培或水培中进行培养，但培养1-2个月后，马铃薯抗性组培苗因叶片太老而需要重新土培或水培，而再次水培需要很长的时间。同时，致病疫霉生理小种的马铃薯抗性组培苗的品种较多（11个抗性品种R1-R11和一个感病品种r，还有其他抗性品种如R3a，R3b等等），若要确保马铃薯疫霉生理小种的检测叶片在每个时间段都有叶片供生理小种检测使用，则每个马铃薯品种每两周就需要水培一批，因此在检测过程中需要花费大量的时间种植马铃薯抗性组培苗，这对于有限的温室空间和较大群体的致病疫霉生理小种的检测并不适用。而且，由于致病疫霉生理小种的检测需要先制作孢子悬浮液，而制作孢子悬浮液步骤较为繁琐，需要大量的时间，所以一天无法完成大量的致病疫霉菌株孢子悬浮液的制作；同时，致病疫霉生理小种的检测需要光照培养箱进行培养，由于光照培养箱空间有限，一次性无法放置太多用于致病疫霉生理小种的检测的培养皿。因此，需要分批检测，需要确保每个时间段都有叶片供生理小种检测使用。为此，急需一种培育马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的新方法，以实现马铃薯抗性组培苗的大量、及时供应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其可加快马铃薯组培苗的培养速度，而且能充分利用温室空间，特别适用于有限的温室空间和较大群体的致病疫霉生理小种的检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其包括以下步骤：
1）组培培养基的配制：称取6g琼脂、30g蔗糖，加入到4.74g MS培育基中，加水定容至1L，然后加热溶解并煮沸，使用烧杯将其分装至150mL的三角瓶内，每个三角瓶装入约50-60ml组培培养基，然后用透气膜封口，放入灭菌锅灭菌，再摆放在超净工作台内进行冷却；
2）接种：在超净工作台内将生长一个月左右的马铃薯组培苗剪成若干分枝，使每一分枝至少有2-3片叶，然后用镊子将剪后的分枝接入装有组培培养基的三角瓶中（若温室空间充足，则一个三角瓶内可以只接一个组培苗，如果需要接较多品种的马铃薯组培苗、且温室空间有限时，则一个三角瓶内可以插入三个组培苗，以充分利用有限的温室空间），然后将三角瓶用透气膜封口，于22℃温室内进行培养；
3）水培：接种后培养20-30天（不同马铃薯抗性品种生长速度有差异，故R2、R4、R6、R10培养约20天，R1、R3、R5、R8培养约25天，而r、R7、R9、R11、R3a和R3b培养约30天），然后用玻璃棒将组培培养基搅碎，将所得组培苗倒入装有水的脸盆中，以减少根系和茎杆的损伤，再将根系上的培养基用自来水冲洗干燥，并用定植篮和定植海棉将组培苗定植在装有水培营养液的水培箱内培养2周（若组培苗太高容易倒，可以使用长竹签固定组培苗）；
4）分类管理：
a. 2周后，对于r、R1、R2、R7、R3a和R3b等分株较多的马铃薯品种，将其一半组培苗的分株剪成数株，移植到装有水培营养液的三角瓶中促进其生根（当温室空间有限时，可以2-3株种植在一个三角瓶内），继续水培1周后，再移入装有水培营养液的水培箱内，培养2周左右便可以使用叶片检测致病疫霉的生理小种；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天即作为叶片检测致病疫霉的生理小种；
b. 2周后，对于R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10和R11等单株或分株较少的马铃薯品种，将其组培苗剪去顶芽，达到去顶端优势、促进侧芽生长的效果；待侧芽生长2周后，剪取一半侧芽，插入装有水培营养液的三角瓶中（当温室空间有限时，可以2-3株种植在一个三角瓶内），继续水培1周促进其生根后，再移入装有水培营养液的水培箱内培养2周左右，即可使用其叶片检测致病疫霉的生理小种；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天即作为叶片检测致病疫霉的生理小种。
所述水培营养液中各营养成分及其含量为KNO3 1000μmol/L、MgSO3 300μmol/L、Ca(NO3)2·3H2O 1000μmol/L、(NH3)H2PO3 200μmol/L、Fe-Na-EDTA 20μmol/L、H3BO3 3μmol/L、MnCl2·5H2O 0.5μmol/L、CuSO4.·5H2O 0.2μmol/L、ZnSO4·7H2O 0.3μmol/L、(NH3)6MO7O23·3H2O 1μmol/L。
本发明的创新意义：本发明方法主要利用组培和水培相结合的方法，根据不同马铃薯抗性品种的生长特点进行培养，不仅可加快马铃薯组培苗的培养速度，而且能充分利用温室空间，特别适用于有限的温室空间和较大群体的致病疫霉生理小种的检测，是病原群体生理小种研究试验中快速培养马铃薯抗性组培苗的一种行之有效的方法。
附图说明
图1为不同抗性品种马铃薯组培苗的生长情况图，其中A为生长20天的R2抗性马铃薯组培苗；B为生长25天的R1抗性马铃薯组培苗；C为生长30天的R11抗性马铃薯组培苗。
图2为定植在水培箱中、生长一个月左右的马铃薯组培苗的生长情况图。
图3为水培2周后的R3a抗性马铃薯组培苗的生长情况图。
图4为移植到三角瓶中水培1周的R3a抗性马铃薯组培苗分株的生长情况图。
图5为获得的可以用于检测致病疫霉的生理小种的R2马铃薯水培苗。
图6为水培2周后去顶芽培养3天的R8抗性马铃薯组培苗的生长情况图（A）及去除的顶芽（B）。
图7为水培2周后去顶芽培养1周的R10抗性马铃薯组培苗的生长情况图。
图8为移植到三角瓶中水培1周的R8抗性马铃薯组培苗侧芽的生长情况图。
图9为获得的可以用于检测致病疫霉的生理小种的R4马铃薯水培苗。
图10为温室组培架上三角瓶和水培箱的合理利用情况图。
图11为温室内合理利用三角瓶和水培箱种植马铃薯组培苗的情况图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其包括以下步骤：
1）组培培养基的配制：称取6g琼脂、30g蔗糖，加入到4.74g MS培育基中，加水定容至1L，然后加热溶解并煮沸，使用烧杯将其分装至150mL的三角瓶内，每个三角瓶装入约50-60ml组培培养基，然后用透气膜封口，放入灭菌锅灭菌，再摆放在超净工作台内进行冷却；
2）接种：将剪刀和镊子用报纸包好放入高压锅灭菌，灭菌后放入烘箱烘干；在超净工作台内使用剪刀将生长一个月左右的马铃薯组培苗剪成若干分枝，使每一分枝至少有2-3片叶，然后用镊子将剪后的分枝接入装有组培培养基的三角瓶中（若温室空间充足，则一个三角瓶内可以只接一个组培苗，如果需要接较多品种的马铃薯组培苗、且温室空间有限时，则一个三角瓶内可以插入三个组培苗，以充分利用有限的温室空间；接不同品种的组培苗时，剪刀和镊子需要用酒精灯消毒灭菌），然后将三角瓶用透气膜封口，于22℃温室内进行培养；
3）水培：接种后培养20-30天（不同马铃薯抗性品种生长速度有差异，故R2、R4、R6、R10培养约20天，R1、R3、R5、R8培养约25天，而r、R7、R9、R11、R3a和R3b培养约30天，如图1、2），然后用玻璃棒将组培培养基搅碎，将所得组培苗倒入装有水的脸盆中，以减少根系和茎杆的损伤，再将根系上的培养基用自来水冲洗干燥，并用定植篮和定植海棉将组培苗定植在装有水培营养液的水培箱内培养2周（若组培苗太高容易倒，可以使用长竹签固定组培苗）；
4）分类管理：
a. 2周后，对于r、R1、R2、R7、R3a和R3b等分株较多的马铃薯品种（如图3），将一般的组培苗剪成数株，移植到装有水培营养液的三角瓶中促进其生根（当温室空间有限时，可以2-3株种植在一个三角瓶内），继续水培1周后（如图4），再移入装有水培营养液的水培箱内，培养2周左右便可以使用叶片检测致病疫霉的生理小种（如图5）；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天左右即作为叶片检测致病疫霉的生理小种；
b. 2周后，对于R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10和R11等单株或分株较少的马铃薯品种（如图6、7），将其组培苗剪去顶芽，达到去顶端优势、促进侧芽生长的效果；待侧芽生长2周后，剪取一半侧芽，插入装有水培营养液的三角瓶中（当温室空间有限时，可以2-3株种植在一个三角瓶内），继续水培1周促进其生根后（如图8），再移入装有水培营养液的水培箱内培养2周左右，即可使用其叶片检测致病疫霉的生理小种（如图9）；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天左右即作为叶片检测致病疫霉的生理小种。
所述水培营养液中各营养成分及其含量为KNO3 1000μmol/L、MgSO3 300μmol/L、Ca(NO3)2·3H2O 1000μmol/L、(NH3)H2PO3 200μmol/L、Fe-Na-EDTA 20μmol/L、H3BO3 3μmol/L、MnCl2·5H2O 0.5μmol/L、CuSO4.·5H2O 0.2μmol/L、ZnSO4·7H2O 0.3μmol/L、(NH3)6MO7O23·3H2O 1μmol/L。
表1 单株或分株较少的马铃薯品种的普通水培时间和新方法水培时间
马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗有R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R3a和R3b等13种品种，还有感病品种r做对照实验，所以一共有14种马铃薯品种。不同品种需要组培和水培的时间略有不同，如表1可知，单株或分株较少的马铃薯品种在三角瓶内组培时间不同，R4、R6、R10三个品种在三角瓶内组培的时间为20天，R3、R4、R8三个品种在三角瓶内组培的时间为25天，R9、R11两个品种在三角瓶内组培的时间则需要30天；而这些单株或分株较少的马铃薯品种按现有技术进行普通水培的时间为30天。
同时，在群体量较大的致病疫霉群体的生理小种的检测过程中，往往需要先种植大量的各种马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗和培养致病疫霉菌株，而各种马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的生长速度和分株情况不一样，如果按普通方法水培，即全部马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗同时水培，可以供致病疫霉群体的生理小种的检测的最佳检测时间段较短；但在致病疫霉群体的生理小种的检测过程中需要制作致病疫霉孢子悬浮液，需要较长的时间，而采集叶片和保湿处理也需要大量时间，且同一批致病疫霉群体的生理小种的检测需要同一天完成，需要大量的光照培养箱（提供光照和湿度）。因此，使用普通方法水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗，供群体量较大的致病疫霉群体的生理小种的检测时，需要较大的温室空间和较多的光照培养箱的空间，或不断进行水培，以生长足够的叶片供致病疫霉生理小种检测使用。
本发明操作中由于除了将一半侧芽剪去移入三角瓶水培外，还有一半侧芽留在原植株中继续用水培箱水培，其中去顶芽以下的叶片水培30天后可以使用，而剩余的侧芽叶片水培37天后可以使用，而剪去移入三角瓶水培后继续移入水培箱水培的一半侧芽的叶片水培42天后可以使用（从三角瓶内组培苗移入水培箱水培算起），且在温室空间、水培箱数量有限时，可以直接使用三角瓶水培至使用时间。经计算，一般温室内的温室架长为126cm、宽为57cm，一般水培马铃薯组培苗的水培箱的长41cm、宽27.5cm，而150ml的三角瓶瓶底直径为7.5cm，因此，一个温室架上可以放置4个水培箱和32个三角瓶，而一个水培箱内有11个水培槽，且水培箱前可以放置8个三角瓶（如图10）。因此，若每个水培槽和每个三角瓶内均水培1株水培苗，则一个温室架上可比普通水培方法多水培32株水培苗，若每个水培槽和每个三角瓶内均水培3株水培苗，则一个温室架上可比普通水培方法多水培96株水培苗。故可在检测过程中持续供应足够的叶片供致病疫霉生理小种检测使用。
因此，使用本发明快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法水培单株或分株较少的马铃薯品种的组培苗，可极大的增加了水培苗的产量，实现叶片的短间隔供应，避免现有普通方法需重新水培的繁琐，极大的确保每个时间段都有足够叶片供致病疫霉生理小种检测使用，特别是群体量较大的致病疫霉群体的生理小种的检测。
表2 分株较多的马铃薯品种的普通水培时间和新方法水培时间
如表2可知，分株较多的马铃薯品种在三角瓶内组培时间也不同，R2品种在三角瓶内组培的时间为20天，R1品种在三角瓶内组培的时间为25天，r、R7、R3a、R3b四个品种在三角瓶内组培的时间则需要30天；而这些分株较多的马铃薯品种按现有技术进行的普通水培时间为30天。
同时，本发明操作中由于除了将一半分株剪去移入三角瓶水培外，还有一半分株留在水培箱内继续水培，这一半分株的水培苗叶片水培30天后可以使用，而一半分株剪去移入三角瓶水培后继续移入水培箱水培的叶片水培35天后可以使用（从三角瓶内组培苗移入水培箱水培算起），且在温室空间、水培箱数量有限时，可以直接使用三角瓶水培至使用时间。经计算，一般温室内的温室架长为126cm、宽为57cm，一般水培马铃薯组培苗的水培箱的长41cm、宽27.5cm，而150ml的三角瓶瓶底直径为7.5cm，因此，一个温室架上可以放置4个水培箱和32个三角瓶，而一个水培箱内有11个水培槽，且水培箱前可以放置8个三角瓶。因此，若每个水培槽和每个三角瓶内均水培1株水培苗，则在一个温室架上可比普通水培方法多水培32株水培苗，若每个水培槽和每个三角瓶内均水培3株水培苗，则在一个温室架上可比普通水培方法多水培96株水培苗。因此，使用该快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法水培分株较多的马铃薯品种的组培苗，可极大的增加了水培苗的产量，实现叶片的短间隔供应，避免现有普通方法需重新水培的繁琐，而且如果不剪掉部分分株会导致水培叶片太小而影响致病疫霉生理小种检测，因此，按本发明方法操作可进一步确保每个时间段都有叶片供致病疫霉生理小种检测使用，且确保叶片不会因为太小而而影响致病疫霉生理小种检测，特别是群体量较大的致病疫霉群体的生理小种的检测。
表3 不同马铃薯品种的普通方法的总时间和新方法的总时间
由于致病疫霉生理小种的检测需要一周时间，所以在光照培养箱空间有限的情况下，一周进行一次致病疫霉生理小种的检测的实验。但是常规在温室的空间有限的情况下无法满足14个马铃薯品种用普通方法水培确保每个时间段都有叶片供生理小种检测使用的情况。而本发明快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，可以根据不同马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的生长情况进行水培，其可加快马铃薯组培苗的培养速度（长期水培速度，即分批水培速度），而且能充分利用温室空间，特别适用于有限的温室空间和较大群体的致病疫霉生理小种的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）组培培养基的配制：称取6g琼脂、30g蔗糖，加入到4.74g MS培育基中，加水定容至1L，然后加热溶解并煮沸，倒入三角瓶进行分装后，用透气膜封口，放入灭菌锅灭菌，再进行冷却；
2）接种：在超净工作台内将生长一个月的马铃薯组培苗剪成若干分枝，使每一分枝至少有2-3片叶，然后用镊子将剪后的分枝接入装有组培培养基的三角瓶中，然后用透气膜封口，于22℃温室内进行培养；
3）水培：接种后培养20-30天，然后将所得组培苗倒入水中，将根系上的培养基用自来水冲洗干燥，定植在装有水培营养液的水培箱内，培养2周；
4）分类管理：
a. 对于分株较多的马铃薯品种，将一半组培苗的分株剪成数株，移植到装有水培营养液的三角瓶中继续水培1周后，再移入装有水培营养液的水培箱内培养2周；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天；
b. 对于单株或分株较少的马铃薯品种，将其组培苗剪去顶芽，待侧芽生长2周后，剪取一半侧芽，插入装有水培营养液的三角瓶中继续水培1周后，再移入装有水培营养液的水培箱内培养2周；剪取后剩余的组培苗直接在装有水培营养液的水培箱内培养30天。
2.根据权利要求1所述的快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其特征在于：步骤2）中每个150mL的三角瓶中装有50-60ml组培培养基，接入1-3个分枝。
3. 根据权利要求1所述的快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其特征在于：所述水培营养液中各营养成分及其含量为KNO3 1000μmol/L、MgSO3 300μmol/L、Ca(NO3)2·3H2O 1000μmol/L、(NH3)H2PO3 200μmol/L、Fe-Na-EDTA 20μmol/L、H3BO3 3μmol/L、MnCl2·5H2O 0.5μmol/L、CuSO4.·5H2O 0.2μmol/L、ZnSO4·7H2O 0.3μmol/L、(NH3)6MO7O23·3H2O 1μmol/L。
4.根据权利要求1所述的快速水培马铃薯疫霉生理小种抗性组培苗的方法，其特征在于：步骤4）中每个三角瓶中移植入2-3株剪取下的组培苗。
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