CN113061639A - 一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其步骤包括：(一)无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测：(1)接种用菌株的培养。(2)马铃薯的种植。(3)接菌。(4)病原菌的分离及鉴定。(二)10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定：(1)选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的测定并比较致病性强弱。(2)致病性调查。(3)致病性评价。该方法可大大缩短马铃薯的种植周期；该方法是利用无土栽培的方式进行试验，试验条件可控，稳定性高，重复性好，缩短了致病性测定的的时间；该方法可利用无毒马铃薯组培苗；该方法用的栽培介质陶粒在清洗、灭菌后可重复利用。

Description

一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法
技术领域
本发明涉及一种植物病原菌致病性测定方法，尤其涉及一种利用无毒的马铃薯组培苗与无土栽培方式相结合的马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)属于茄科茄属双子叶植物，起源于南美洲的秘鲁和玻利维亚的安第斯山脉，是重要的粮食、饲料、蔬菜兼用作物，更是公认继玉米、小麦、水稻之后的“世界四大粮食作物”(Hadi M R&Balali,2010)。马铃薯不仅营养价值高，适应性广泛，抗旱能力强、增产增收潜力大，而且从种植到收获加工的产业链条长，涉及领域十分广泛。因此，马铃薯产业是优质、高效、创汇型生态农业的重要组成部分。近年来，马铃薯产业得到了世界上越来越多国家，尤其是发展中国家的重视。它在保障国家粮食安全和促进农村经济发展、农民持续增收等方面起到了非常重要的作用，已经成为我国西部地区脱贫致富的支柱产业(陈伊里，屈冬玉，2013)
马铃薯黄萎病(Verticillium wilt of potato)又称早死病或早熟病，是马铃薯主要病害之一，在全世界温带地区广泛分布，是典型的土传兼种传维管束病害。其病菌可在土壤中长时间存在，又可随种子调运而远距离传播，引起系统性侵染，使马铃薯整株带病，最终影响马铃薯的产量及品质，造成严重经济损失。该病菌寄主范围较广，除了对马铃薯有较强致病力外，还可侵染大豆、棉花、苜蓿、番茄和三叶草等多种植物，引发黄萎病，对农业生产具有较大危险(李济宸，1992；Davis&Huisman，2001)。
已有研究表明导致马铃薯黄萎病的病原菌包括大丽轮枝菌(V.dahliae Kleb.)、黑白轮枝菌(V.albo-atrum Reinke&Berthier)、变黑轮枝菌(V.nigrescens Pethybr.)、云状轮枝孢(V.nubilum Pethybr.)和三体轮枝菌(V.tricorpus Isaac)(Johnson D A&DungJ K S,2010；Mckeen C D&Thorpe H J；Gre M E，et al.,2015)。
无土栽培是指不用天然土壤,而用营养液或固体基质加营养液栽培作物的方法(郭世荣，2003)。无土栽培是以人工创造的作物根系环境取代土壤环境,除了满足作物对矿物质营养、水分和空气的需要外,还可以人工对这些环境加以控制和调整,从而使其生产的产品无论从数量上还是从品质上都优于土壤栽培。无土栽培摆脱了土壤栽培中繁重的翻土、整畦、除草等劳动过程,而且在整个无土栽培生产中逐步实现了机械化或自动化操作,大大降低了劳动强度,节省了劳动力,提高了劳动效率(刘士哲，2002)。无土栽培从早期的实验研究到现在生产上大规模应用，已有100多年的历史。对于无土栽培方式的分类，现在大多数人从植物根系生长环境是否有固体介质的存在分为无固体基质栽培和有固体基质栽培两大类型。无固体基质栽培类型主要指的是水培方式，有固体基质栽培类型主要有沙、岩棉、石砾等为介质的栽培。我国无土栽培从70年代中期开始引进、研究和消化吸收,到目前进入初级实用化阶段,已经过了近30年的时间。但是，到目前为止无土栽培技术主要用于生产、展示，与实验室相结合的进行室内病原菌致病性的鉴定未见报道。
不同病原菌对同一种作物的危害能力不同，在作物的抗病性鉴定、抗病育种及病害防治过程中，准确测定病原菌的致病性对马铃薯黄萎病的防治或抗黄萎病育种工作有着非常重要的意义。
目前，关于测定马铃薯黄萎病病原菌致病性的方法并不统一，以盆栽或田间的活体植株为接种对象的方法居多。如这些方法主要以马铃薯叶片萎蔫程度及数量来评价病原菌的致病性。但植株培养涉及到田间及温室管理，周期较长且易受环境条件影响。还有一些方法以萌发种子为接种对象，用种子被浸染的严重程度来评价病原菌的致病性，这种方法较为简便，目前主要运用的物种有向日葵(Manici et al.,1995)、菜用豆(Reyes-Francoet al.,2006)等。而马铃薯的种植主要以块茎为主且是一种维管束病害只有在植株阶段才可观察到发病症状。目前，马铃薯黄萎病病原菌的致病性的测定主要通过田间或盆栽进行人工接种(土壤中倒入孢子悬浮液或在土壤中放入菌饼)之后调查病情指数。但是这种测定方法由于田间面积大接种较困难，环境条件受外界影响较大，盆栽的方法虽然在接种上较大田容易，但土壤中除了要测定的病原菌还有其他的生物的存在也会对致病性产生一定的影响。由于马铃薯在种植过程中需要较大的花盆种植，需要较大的种植场所。因此，摸索一套简易、可控、有效的测定马铃薯黄萎病病原菌致病性的方法对于马铃薯黄萎病化学药剂和生防菌剂的筛选、评价马铃薯的抗病性、培育抗病品种、进行合理的品种布局具有着重要的意义。
专利CN201010565405.1.公开了一种鉴定芝麻茎点枯病和枯萎病病原菌致病性的方法，该专利主要利用在培养瓶中加入灭菌培养基，铺放无菌滤纸并赶出气泡，然后沿滤纸边缘摆放灭菌处理过的芝麻种子，再在滤纸中央接种致病菌菌饼，密闭黑暗培养之后调查各发芽种子的发病情况，并根据发病程度将发病情况划分不同的发病等级该发病等级数值越大，发病程度越严重。由于马铃薯黄萎病是一种土传兼维管束病害一般在成株植物上体现，同时马铃薯的种植主要以块茎为主即使是近些年应用的种薯考虑其体积大小也不可能数量过多的放在平时用的培养瓶中。因此，该方法并不适用于马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定。
专利CN202011185477.3公开了一种杂草稻病原菌致病性测定方法及鉴定装置。该专利中主要利用离体培养法将孢子悬浮液滴到3-5叶杂草稻离体新叶上进行接种，放入26℃的恒温培养箱中进行保湿无菌培养10d，10d后测量病斑面积，根据病斑面积大小确定接种菌株对杂草稻的致病性。但马铃薯黄萎病为土传兼维管束病害，病菌来源于土壤，从根部伤口入侵直到维管束，最终导致叶片萎蔫。对于马铃薯黄萎病病原菌的致病性鉴定目前并未见到利用该专利的方法进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定，是否可以进行该专利中的方法进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定目前尚不清楚。
专利CN201611093986.7公开了一种棉花黄萎病菌致病力测定及评价方法。该专利中主要以待测的棉花黄萎病菌和对照株分别接种鉴别寄主，进行病情调查，以对照菌种矫正鉴别寄主上的病情指数范围达到一定程度时的调查。但是该方法中棉花种植时采用的是河沙和蛭石，颗粒较小，且在清洗时容易随水流冲走，重复利用较差，且该方法并不适用于马铃薯组培苗的生长，马铃薯组培苗成活率较低，因此如用该方法进行马铃薯黄萎病病原菌的致病性鉴定尚存在一些问题。
河北省农林科学院植物保护研究所李社增等在植物病理学报发表文章《中国七省(自治区)马铃薯黄萎病及优势病原菌致病力分析》，在该文章中，对于马铃薯黄萎病病原菌的致病性主要通过盆栽马铃薯后接菌再进行病情指数的调查，从而鉴定不同马铃薯黄萎病病原菌的致病性。该方法与本发明中的一种利用无土栽培方式进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定方法相比，耗时、实验周期长、劳动量大、受土壤微环境等影响较大，同时该文章中所用的植物材料并不是无毒的马铃薯组培苗，是否在种植块茎中潜藏马铃薯黄萎病病原菌也未可知。
目前，利用无土栽培的方式进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定尚未见报道。通过上述分析，利用无土栽培方式进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定可大大缩短马铃薯的种植周期，从而缩短马铃薯黄萎病病原菌致病性测定的试验周期，以提高效率；该方法是利用无土栽培的方式进行试验，突破了传统的利用田间或盆栽的试验方法，避免了外界气候环境及土壤条件对试验结果造成的影响，可控性、稳定性高、重复性好，大大缩短了黄萎病致病性测定的时间，具有一定的创新性；该方法可利用无毒马铃薯组培苗；该方法用的栽培介质陶粒在清洗、灭菌后可重复利用。总之，该方法简单易行、操作简单、节省劳力、结果可靠，能较准确反映马铃薯黄萎病病原菌的致病性。
发明内容
本发明目的之一，根据上述现有技术的不足，提出一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
所述一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，包括以下步骤：
(一)无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测：
所述无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测，包括以下步骤：
(1)马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养：
所述马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养，包括：
PDA培养基经高压灭菌后倒入培养皿，待冷却后在培养皿上接种大丽轮枝菌菌丝，25℃条件下黑暗培养10d形成菌落备用。
(2)马铃薯的种植：
所述马铃薯的种植，包括：
选用生长大小一致的马铃薯组培苗种植在事先准备好并盛有可供马铃薯生长的无土栽培营养液的管道式水培种种植系统内，生长7d后备用。
将直径大小为0.4-1cm的陶粒121℃高压灭菌后装在小花盆内。
将在水培种植系统内生长7d的组培马铃薯苗移栽至小花盆内。
(3)接菌：
所述接菌，包括：
用蓝枪头在生长10d的菌落边缘打菌饼并放到PDB中摇培7d，用血球计数板测定孢子浓度并调整为1x107个孢子/mL的孢子悬浮液，倒入小花盆内，每盆接菌30mL。
(4)病原菌的分离及鉴定：
所述病原菌的分离及鉴定，包括：
选取马铃薯生病组织经75％酒精浸泡20s、5％的次氯酸钠溶液消毒3min，无菌水冲洗3次后进行病原菌的分离，分离得到的病原菌通过电子显微镜观察病原菌菌丝、分生孢子等形态进行形态学鉴定，同时通过提取病原菌DNA、利用特异性引物扩增目的片段、1％琼脂糖凝胶电泳、基因序列的测定、比对等手段进行分子鉴定。
(二)10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定
所述10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定，包括以下步骤：
(1)选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的测定：
所述选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的测定，包括：
马铃薯黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，不同的大丽轮枝菌致病性不同，将10个病原菌菌株接种于马铃薯植株，每个菌株接种15株马铃薯，且重复3次，共接种45株马铃薯。所述选取的10个大丽轮枝菌菌株均来源于内蒙古农业大学菌种保藏库。
(2)致病性调查：
所述致病性调查，包括：
调查各植株发病程度，并根据不同发病情况划分发病等级，其中，根据如下分级标准将发病等级划分为5级。
Figure BDA0002986618690000051
(3)致病性评价：
所述致病性评价，包括：
计算每个菌株的病情指数，病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(发病等级x各级病株数)/调查总数x100。
按上述方案，所述步骤(一)中的步骤(1)的具体步骤为：PDA培养基经高压121℃灭菌后倒入培养皿，待冷却后在培养皿上用接种针接种大丽轮枝菌菌丝，用Parafilm膜封口，之后在恒温箱中25℃条件下黑暗培养10d。所述PDA培养基的组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g。
按上述方案，所述步骤(一)中的步骤(2)的具体步骤为：
A马铃薯组培苗的选择
选用生长大小一致的马铃薯组培苗，所述马铃薯组培苗来源于内蒙古农业大学马铃薯组培实验室。
B无土栽培种植系统的准备
准备一套管道式水培种植系统，所述种植系统配有无土栽培营养液槽及循环系统，在使用前用75％的酒精将水培管道表面擦拭2-3次，在营养液槽内配制奥克泰士消毒液(稀释12倍后使用，厂家为德国BUDICH国际有限公司)冲洗2-3次，后倒掉消毒液配制可供马铃薯生长的营养液，所述营养液为改良的日本园试配方(堀，1966)，，其组成为：
A液：
硝酸钙：1360mg/L；
B液：
硝酸钾：1100mg/L，
硫酸镁：500mg/L，
磷酸二氢铵：270mg/L；
C液：微量元素液
硼酸：3.0mg/L，
硫酸锰：1.6mg/L，
硫酸锌：0.28mg/L，
硫酸铜：0.12mg/L，
钼酸钠或钼酸铵：0.10mg/L，
EDTA铁钠盐：20mg/L；
所述营养液的配制方法为A液、B液需配制浓缩250倍的浓缩液，C液需配制浓缩1000倍的浓缩液，分别盛放在有色的容器中贮藏，使用时，A液和B液稀释250倍；C液稀释1000倍使用，根据水培营养液桶的体积计算出所需A、B、C液的量，量取后倒入桶中混合后使用，同时测定溶液的EC值与PH值，将EC值调整为2.2-2.4，PH用柠檬酸调整为6.5-7.0之间。
C马铃薯的种植
将步骤A选择的马铃薯组培苗种植在步骤B准备的无土栽培种植系统内，生长7d后备用。
D移栽设备的准备
购买直径大小为0.4-1cm的陶粒121℃高压灭菌后装在直径为10cm的方形小花盆内。
E移栽
将步骤C中的马铃薯组培苗移栽至步骤D中准备的种植设备内。
按上述方案，所述步骤(一)中的步骤(3)的具体步骤为：配制1x107个孢子/mL的孢子悬浮液倒入小花盆内，每盆接菌30mL。用蓝枪头在生长10d的菌落边缘打菌饼并放到PDB中，后在摇床上25℃、180rpm的条件下摇培7d，用血球计数板在电子显微镜下测定孢子浓度，之后将菌液的孢子浓度调整为1x107个孢子/mL，倒入小花盆内，每盆接菌30mL。所述PDB组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g。
按上述方案，所述步骤(一)中的步骤(4)的具体步骤为：选取马铃薯生病组织经75％酒精消毒20s、5％的次氯酸钠溶液消毒3min，无菌水冲洗3次后，用灭菌剪刀剪成约0.3-0.5cm小块。将小块病组织放入PDA培养基中，置于25℃培养箱中培养，长出菌丝后进行单孢分离再培养，后通过电子显微镜观察病原菌菌丝、分生孢子等形态进行形态学鉴定，同时通过提取病原菌DNA、利用特异性引物扩增目的片段、1％琼脂糖凝胶电泳、基因序列的测定、比对等手段进行分子鉴定。
按上述方案，所述步骤(二)中的具体步骤为：马铃薯黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，不同的大丽轮枝菌致病性不同，将不同致病性的病原菌接种马铃薯，每个病原菌接种15株马铃薯，且重复3次，共接种45株马铃薯，后进行致病性调查及致病性评价，所述10个大丽轮枝菌均来源于内蒙古农业大学菌种保存库，其种类为：Vd50、Vd22、Vd8、Vd3、Vd19、Vd38、Vd2、Vd41、Vd33、Vd18。
按上述方案，所述步骤(一)设置重复3次，且需要设置对照组，所述对照组为不接任何病原菌。
按上述方案，所述步骤(二)设置重复3次，且需要设置对照组，所述对照组不接任何病原菌。
按上述方案，所述步骤(二)中的步骤(3)中的病情指数为每次试验的病指数的平均而得。
附图说明
图1无土栽培条件下马铃薯接菌后植株生长情况图(CK为以无菌水为对照，处理为接菌Vd50)
图2无土栽培条件下马铃薯接菌后根系生长情况图(CK为以无菌水为对照，处理为接菌Vd50)
图3为接入菌Vd50菌落图
图4为接入菌Vd50分生孢子梗图
图5为接入菌Vd50分生孢子图
图6为分离菌菌落图
图7为分离菌分生孢子梗图
图8为分离菌分生孢子图
图9为大丽轮枝菌特异性引物对所分离大丽轮枝菌PCR扩增结果(M：DL2000 DNAMarker CK:模板以dd水为对照1：分离菌株)
具体实施方式
本发明结合以下实施例，以更好的理解本发明内容。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法。
(一)无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测：
所述无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测，包括以下步骤：
S101,马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养：
所述马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养，包括：
PDA培养基经高压灭菌后倒入培养皿，待冷却后在培养皿上接种大丽轮枝菌菌丝，25℃条件下黑暗培养10d形成菌落备用。
S102,马铃薯的种植：
所述马铃薯的种植，包括：
选用生长大小一致的马铃薯组培苗种植在事先准备好并盛有可供马铃薯生长的无土栽培营养液的管道式水培种种植系统内，生长7d后备用。
将直径大小为0.4-1cm的陶粒121℃高压灭菌后装在小花盆内。
将在水培种植系统内生长7d的组培马铃薯苗移栽至小花盆内。
S103,接菌：
所述接菌，包括：
用蓝枪头在生长10d的菌落边缘打菌饼并放到PDB中摇培7d，用血球计数板测定孢子浓度并调整为1x107个孢子/mL的孢子悬浮液，倒入小花盆内，每盆接菌30mL。
S104,病原菌的分离及鉴定：
所述病原菌的分离及鉴定，包括：
选取马铃薯生病组织经75％酒精浸泡20s、5％的次氯酸钠溶液消毒3min，无菌水冲洗3次后进行病原菌的分离，分离得到的病原菌通过电子显微镜观察病原菌菌丝、分生孢子等形态进行形态学鉴定，同时通过提取病原菌DNA、利用特异性引物扩增目的片段、1％琼脂糖凝胶电泳、基因序列的测定、比对等手段进行分子鉴定。
(二)10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定
所述10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定，包括以下步骤：
S201,选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的鉴定：
所述选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的鉴定，包括：
马铃薯黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，不同的大丽轮枝菌致病性不同，将10个病原菌接种于马铃薯植株，每个病原菌接种15株马铃薯，且重复3次，共接种45株马铃薯。所述选取的10个大丽轮枝菌均来源于内蒙古农业大学菌种保存库。
S202,致病性调查：
所述致病性调查，包括：
调查各植株发病程度，并根据不同发病情况划分发病等级，其中，根据如下分级标准将发病等级划分为5级。
Figure BDA0002986618690000091
S203,致病性评价：
所述致病性评价，包括：
计算每个菌株的病情指数，病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(发病等级x各级病株数)/调查总数x100。
本发明与现有技术相比，具有如下优势：
利用无土栽培方式进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定可大大缩短马铃薯的种植周期，从而缩短马铃薯黄萎病病原菌致病性测定的试验周期，以提高效率；该方法是利用无土栽培的方式进行试验，突破了传统的利用田间或盆栽的试验方法，避免了外界气候环境及土壤条件对试验结果造成的影响，可控性、稳定性高、重复性好，大大缩短了黄萎病致病性测定的时间，具有一定的创新性；该方法可利用无毒马铃薯组培苗；该方法用的栽培介质陶粒在清洗、灭菌后可重复利用。该方法简单易行、操作简单、节省劳力、结果可靠，能较准确反映马铃薯黄萎病病原菌的致病性。
下面用具体试验及附图对本发明作进一步描述。
1.无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性检测
1.1试验材料
1.1.1供试菌株的来源
大丽轮枝菌：来源于内蒙古农业大学植物病理研究室菌种保藏库。
1.1.2供试试剂及材料
硝酸钾、硝酸钙、硫酸镁、EDTA铁等植物生长必需营养元素；75％酒精、0.2％次氯酸钠、Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生物工程上海有限公司)无水乙醇、异丙醇、陶粒(直径1-2cm)、种植土、小花盆、大花盆等。
1.1.3马铃薯来源及品种
马铃薯组培苗：来源于内蒙古农业大学组培室。
品种：费乌瑞它
1.1.4供试培养基及营养液
PDA培养基：马铃薯200g，琼脂18g，葡萄糖20g，水1000mL。
PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。
改良日本园试配方(堀，1966)：A液：硝酸钙：1360mg/L；B液：硝酸钾：1100mg/L，硫酸镁：500mg/L，磷酸二氢铵：270mg/L；C液：硼酸：3.0mg/L，硫酸锰：1.6mg/L，硫酸锌：0.28mg/L，硫酸铜：0.12mg/L，钼酸钠或钼酸铵：0.10mg/L，EDTA铁钠盐：20mg/L；
1.1.5主要仪器设备
EC值、pH值测试仪，灭菌器、高压蒸汽灭菌锅、双人单面(垂直)循环净化工作台、普通光学显微镜、高速离心机、PCR仪等。
1.2试验方法
1.2.1病原菌的培养
将低温保存的黄萎病菌菌株Vd50转移到PDA培养基上，放入温度为25℃的培养箱中活化10-15d，备用。
1.2.2孢子悬浮液的制备及营养液的配制
将已经活化的菌株用蓝枪头在边缘取菌饼分别移入经灭菌的PDB培养基上，在摇床上摇培7d得到孢子悬浮液。在显微镜下用血球计数板统计并调整至浓度为1x107个孢子/mL。
A液、B液需配制浓缩250倍的浓缩液，C液需配制浓缩1000倍的浓缩液(配方为1.1.4中改良日本园试配方)，分别盛放在有色的容器中贮藏，使用时，A液和B液稀释250倍；C液稀释1000倍使用，根据水培营养液桶的体积计算出所需A、B、C液的量，量取后倒入桶中混合后使用，同时测定溶液的EC值与PH值，将EC值调整为2.2-2.4，PH用柠檬酸调整为6.5-7.0之间。
1.2.3马铃薯的种植
准备好一套水培管道种植系统，管道用75％的酒精擦洗干净。在营养液池中加入清水后加入奥克泰氏(稀释12倍后使用，厂家为德国BUDICH国际有限公司)，将管道冲洗3-5次，之后将水倒掉后重新在营养液池中加满清水，按照将上述1.1.4配制无土栽培营养液以供马铃薯生长所需。
从组培室中选取生长高度一致的马铃薯苗移栽在事先准备好的水培管道系统中，生长7d后，待小苗叶片生长至10片叶子以上移栽在盛有陶粒的小花盆中(直径10cm)，其中陶粒在121℃的高压灭菌锅中灭菌30min，小花盆用1％的高锰酸钾浸泡10min。种植过程在无菌的环境下进行。
试验设置两组，一组为以无菌水为对照，不接任何菌，一组为处理组接菌Vd50。每组设置3次重复，每次重复为15株马铃薯苗。
1.2.4接种方法
待小花盆中的马铃薯缓苗7d后，将制备好的孢子悬浮液倒入小花盆中，每盆接种30mL，养护过程为1次营养液2次水间隔浇，15d后观察发病情况并计算病情指数。
1.2.5病原菌的分离、纯化
取发病植株的茎部，用自来水冲洗干净，削去表面和髓部，表面灭菌。灭菌过程：75％酒精中灭菌20s，5％NaClO消毒3min，用无菌水清洗3次，用灭菌剪刀剪成约0.3-0.5cm的小块。将小块病组织接入PDA培养基中，置于25℃培养箱中培养，长出菌落后，在菌落边缘挑取菌丝进行纯化，纯化后的菌落再进行单孢分离并培养。
1.2.6病原菌形态学鉴定
将病原菌接种于PDA培养基培养，每天观察病原菌在PDA培养基中的菌落形态特征并利用十字交叉法测量菌落的大小并计算其生长速度。利用显微镜对分生孢子梗和分生孢子进行观察并测量孢子大小，共测量50个孢子。
1.2.7病原菌分子鉴定
刮取在PDA培养基培养的纯化菌株菌丝体，用生工生物工程(上海)有限公司生产的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行病原菌基因组DNA的提取。用大丽轮枝菌特异性引物DB19(5,-CGGTGACATAATACTGAGAG-3,)和DB22(5,-GACGATGCGGATTGAACGAA-3,)对供试病原菌株进行检测。PCR反应体系为25μL，10x buffer 2.5μL；dNTP(2.5mmol/L)2μL；DNATaq聚合酶(5U/μL)0.25μL；引物DB19(10μmol/L)1μL；引物DB22(10μmol/L)1μL；模板DNA 1μL；dd水定容至25μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，共设34个循环，72℃延伸10min；12℃保存。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果用紫外凝胶成像系统成像。Marker为DL2K DNA Marker。最后将扩增产物送至华大基因测序，测序结果在GeneBank上进行序列比对并分析。
1.3实验结果
1.3.1致病性测定结果
接入黄萎病菌Vd50 15d后马铃薯发病，表现为叶子发黄、从叶尖和叶缘开始向叶脉、叶柄发展，萎蔫叶片从下部开始向上部蔓延，维管束呈黄色或褐色，与自然发病植株症状相同，而对照组植株表现正常(附图1)。同时，接种Vd50的马铃薯苗根系生长较弱、不发达、稀疏，而不接菌的对照组马铃薯苗根系生长正常(附图2)。
1.3.2形态学鉴定结果
对接菌的发病马铃薯植株进行病原菌的再分离，分离出的病原菌纯化获得纯培养株其在培养后期菌落上产生小黑点(微菌核)，显微镜下菌核呈圆形或不规则多边形。孢子形态椭圆形或短杆状，孢子大小为2.27-5.84μm x1.37-2.25μm，平均为4.28x 1.81μm。分生孢子梗呈轮状分枝，轮状分支个数为3-5个。菌落圆形，边缘光滑。初生菌丝较稀疏，随着培养时间的延长菌落中央由于微菌核的积累变成黑色，菌落生长速度为0.37cm/d。根据形态学特征判定分离出病原菌与最初接种的菌株具有相同的菌落形态(附图3、图4、图5、图6、图7、图8)。
1.3.3分子鉴定结果
将分离纯化得到的病原菌进行了特异性片段扩增，得到了500bp左右大小的序列(附图9)，通过在Genbank数据库对比，该菌株序列与Verticillium dahliae(VDG1)相似度为100％。进而鉴定该分离菌为大丽轮枝菌。
2.10个马铃薯黄萎病病原菌的致病性测定
2.1试验材料
2.1.1供试菌株的来源
同上述1.1.1
2.1.2供试试剂及材料
同上述1.1.2
2.1.3马铃薯来源及品种
同上述1.1.3
2.1.4供试培养基及营养液
同上述1.1.4
1.1.5主要仪器设备
EC值、pH值测试仪，灭菌器、高压蒸汽灭菌锅、小花盆、尺子等。
2.2试验方法
2.2.1病原菌的培养
同上述1.2.1
2.2.2孢子悬浮液的制备
同上述1.2.2
2.2.3马铃薯的种植
准备好一套水培管道种植系统，管道用75％的酒精擦洗干净。在营养液池中加入清水后加入奥克泰氏(稀释12倍后使用，厂家为德国BUDICH国际有限公司)，将管道冲洗3-5次，之后将水倒掉后重新在营养液池中加满清水，按照将上述1.1.4配制无土栽培营养液以供马铃薯生长所需。
从组培室中选取生长高度一致的马铃薯苗在无菌环境下打开瓶盖3d，之后移栽在事先准备好的水培管道系统中，生长7d后，待小苗叶片生长至10片叶子以上移栽在盛有陶粒的小花盆中(直径10cm)，其中陶粒在121℃的高压灭菌锅中灭菌30min，小花盆用1％的高锰酸钾浸泡10min。种植过程在无菌的环境下进行。
将种植土装在直径为30cm的花盆内，种植马铃薯块茎。
试验共设置3组，第一组为对照组，以无菌水为对照；第二组为利用盆栽的试验方法接种10个病原菌，每个病原菌接种15株植物；第三组为利用无土栽培的试验方法接种10个病原菌，每个病原菌接种15株植物。每组设置3次重复。
2.2.4接种方法
同上述1.2.4
2.2.5致病性调查
调查各植株发病程度，并根据不同发病情况划分发病等级，其中，根据如下分级标准将发病等级划分为5级。
Figure BDA0002986618690000141
2.2.6致病性评价
计算每个菌株的病情指数，病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(发病等级x各级病株数)/调查总数x100。
2.3实验结果
2.3.1致病性测定结果
由表1可知，10个大丽轮枝菌在两种不同的试验方法下对马铃薯的致病力不同，其中Vd50的致病力最强，无土栽培试验方法的病情指数为62.92，盆栽试验方法的病情指数为57.34；Vd38的致病力最弱，无土栽培方法的病情指数为28.14，盆栽试验的病情指数为23.09。由此，无论是无土栽培试验方法还是盆栽试验方法，Vd50的致病性均最强，Vd38的致病性均最弱，但是，无土栽培试验方法的试验周期明显低于盆栽试验方法的试验周期。因此，利用无土栽培试验方法进行马铃薯黄萎病病原菌致病性的测定简单易行、操作简单、节省劳力、结果可靠，试验周期短，能较准确反应不同马铃薯黄萎病病原菌的致病性。
表1. 10个大丽轮枝菌两种不同试验方法下病情指数及试验周期情况表
Figure BDA0002986618690000151
注：表中的病情指数为每组试验病情指数的平均而得，试验周期为每组试验周期
的平均而得
以上所述仅为本发明的一种实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法包括以下步骤：
(一)无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性测定：
所述无土栽培条件下马铃薯黄萎病病原菌对马铃薯植株的致病性测定，包括以下步骤：
(1)马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养：
所述马铃薯黄萎病病原菌菌株的培养，包括：
PDA培养基经高压灭菌后倒入培养皿，待冷却后在培养皿上接种大丽轮枝菌菌丝，25℃条件下黑暗培养10d形成菌落备用。
(2)马铃薯的种植：
所述马铃薯的种植，包括：
选用生长大小一致的马铃薯组培苗种植在事先准备好并盛有可供马铃薯生长的无土栽培营养液的水培种植系统内，生长7d后备用。
将直径大小为0.4-1cm的陶粒121℃高压灭菌后装在小花盆内。
将在水培种植系统内生长7d的组培马铃薯苗移栽至小花盆内。
(3)接菌：
所述接菌，包括：
用蓝枪头将生长10d的菌落边缘打菌饼在PDB中摇培7d，用血球计数板测定孢子浓度并调整为1x107个孢子/mL的孢子悬浮液，倒入小花盆内，每盆接菌30mL。
(4)病原菌的分离及鉴定：
所述病原菌的分离及鉴定，包括：
选取马铃薯生病组织经75％酒精浸泡20s、5％的次氯酸钠溶液消毒3min，无菌水冲洗3次后进行病原菌的分离，分离得到的病原菌通过电子显微镜观察病原菌菌丝、分生孢子等形态进行形态学鉴定，同时通过提取病原菌DNA、利用特异性引物扩增目的片段、1％琼脂糖凝胶电泳、基因序列的测定、比对等手段进行分子鉴定。
(二)10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定
所述10个马铃薯黄萎病病原菌致病性的鉴定，包括以下步骤：
(1)选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的鉴定：
所述选取10个马铃薯黄萎病病原菌进行致病性的鉴定，包括：
马铃薯黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，不同的大丽轮枝菌致病性不同，将10个病原菌接种于马铃薯植株，每种病原菌接种15株马铃薯，且重复3次，共接种45株马铃薯。所述选取的10个大丽轮枝菌均来源于内蒙古农业大学菌种保存库。
(2)致病性调查：
所述致病性调查，包括：
调查各植株发病程度，并根据不同发病情况划分为不同的发病等级，其中，使用10个大丽轮枝菌接种时，根据如下分级标准将发病等级划分为5种。
Figure FDA0002986618680000021
(3)致病性评价：
所述致病性评价，包括：
计算每个菌株的病情指数，病情指数的计算公式如下：
病情指数＝∑(发病等级x各级病株数)/调查总数x100。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(一)中的步骤(1)的具体步骤为：PDA培养基经高压121℃灭菌后倒入培养皿，待冷却后在培养皿上用接种针接种大丽轮枝菌菌丝，用Parafilm膜封口，之后在恒温箱中25℃条件下黑暗培养10d。所述PDA培养基的组成为：土豆：200g、葡萄糖20g、琼脂18g。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(一)中的步骤(2)的具体步骤为：
A马铃薯组培苗的选择
选用生长大小一致的马铃薯组培苗，所述马铃薯组培苗来源于内蒙古农业大学马铃薯组培实验室。
B无土栽培种植系统的准备
准备一套管道式水培种植系统，所述种植系统配有无土栽培营养液槽及循环系统，在使用前用75％的酒精将水培管道表面擦拭2-3次，在营养液槽内配制奥克泰士消毒液(稀释12倍后使用，厂家为德国BUDICH国际有限公司)冲洗2-3次，后倒掉消毒液配制可供马铃薯生长的营养液，所述营养液为改良的日本园试配方(堀，1966)，其组成为：
A液：
硝酸钙：1360mg/L；
B液：
硝酸钾：1100mg/L，
硫酸镁：500mg/L，
磷酸二氢铵：270mg/L；
C液：微量元素液
硼酸：3.0mg/L，
硫酸锰：1.6mg/L，
硫酸锌：0.28mg/L，
硫酸铜：0.12mg/L，
钼酸钠或钼酸铵：0.10mg/L，
EDTA铁钠盐：20mg/L；
所述营养液的配制方法为A液、B液需配制浓缩250倍的浓缩液，C液需配制浓缩1000倍的浓缩液，分别盛放在有色的容器中贮藏，使用时，A液和B液稀释250倍；C液稀释1000倍使用，根据水培营养液桶的体积计算出所需A、B、C、D、E液的量，量取后倒入桶中混合后使用，同时测定溶液的EC值与PH值，将EC值调整为2.2-2.4，PH用柠檬酸调整为6.5-7.0之间。
C马铃薯的种植
将步骤A选择的马铃薯组培苗种植在步骤B准备的无土栽培种植系统内，生长7d后备用。
D移栽设备的准备
购买直径大小为0.4-1cm的陶粒121℃高压灭菌后装在直径为10cm的方形小花盆内。
E移栽
将步骤C中的马铃薯组培苗移栽至步骤D中准备的种植设备内。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(一)中的步骤(3)的具体步骤为：配制1x107个孢子/mL的孢子悬浮液倒入小花盆内，每盆接菌30mL。用蓝枪头将生长10d的菌落打菌饼在PDB中，后在摇床上25℃、180rpm的条件下摇培7d，用血球计数板在电子显微镜下测定孢子悬浮液的浓度，之后将菌液的孢子浓度调整为1x107个孢子/mL，倒入小花盆内，每盆接菌30mL。所述PDB组成为：马铃薯：200g、葡萄糖20g。
5.根据权利要求1所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤步骤(一)中的步骤(4)的具体步骤为：选取马铃薯发病组织经75％酒精消毒20s、5％的次氯酸钠溶液消毒3min，无菌水冲洗3次后，用灭菌剪刀剪成约0.3-0.5cm小块。将小块病组织放入PDA培养基中，置于25℃培养箱中培养，长出菌丝后进行单孢分离再培养，后通过显微镜观察病原菌菌丝、分生孢子等形态进行形态学鉴定，同时通过提取病原菌DNA、利用特异性引物扩增目的片段、1％琼脂糖凝胶电泳、基因序列的测定、比对等手段进行分子鉴定。
6.根据权利要求1所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(二)中的具体步骤为：马铃薯黄萎病的致病菌为大丽轮枝菌，不同的大丽轮枝菌致病性不同，将不同致病性的病原菌接种马铃薯，每个病原菌接种15株马铃薯，且重复3次，共接种45株马铃薯，后进行致病性调查及致病性评价，所述10个大丽轮枝菌均来源于内蒙古农业大学菌种保存库，其种类为：Vd50、Vd22、Vd8、Vd3、Vd19、Vd38、Vd2、Vd41、Vd33、Vd18。
7.根据权利要求1-5所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，步骤(一)设置重复3次，且需要设置对照组，所述对照组为不接任何病原菌。
8.根据权利6要求所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(二)设置重复3次，且需要设置对照组，所述对照组不接任何病原菌。
9.根据权利6要求所述的一种马铃薯黄萎病病原菌致病性测定方法，其特征在于，所述步骤(二)中的步骤(3)中的病情指数为每次试验的病情指数的平均而得。
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