CN107365714A - 系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及西瓜抗枯萎病的精准鉴定方法 - Google Patents

系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及西瓜抗枯萎病的精准鉴定方法 Download PDF

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CN107365714A CN201710687640.8A CN201710687640A CN107365714A CN 107365714 A CN107365714 A CN 107365714A CN 201710687640 A CN201710687640 A CN 201710687640A CN 107365714 A CN107365714 A CN 107365714A
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尚泓泉
徐小利
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常高正
李晓慧
程丹丹
高宁宁
康利允
王彬
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Abstract

本发明公开了一种系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株及西瓜抗枯萎病的精准鉴定方法。通过对西瓜枯萎病菌有4个生理小种建立枯萎病菌突变体库、获取枯萎病菌遗传转化突变体、鉴定菌株致病力强弱、筛选不同致病力的突变体菌株等技术手段，分别创制出不同致病力的菌株；抗枯萎病的精准鉴定方法是利用上述所得同一生理小种不同致病力的菌株进行同一材料或品种进行定性抗病测定，又可以对同一材料对某一种生理小种抗性强弱定量抗病测定。运用该本发明方法进行西瓜材料或品种抗枯萎病鉴定，步骤简单、结果直观、一致性和重复性强；本发明方法也可用于其它引起维管束病害的病原菌，加速不同枯萎病性寄主材料和品种抗性鉴定及抗病育种进程。

Description

系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及西瓜抗枯萎 病的精准鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及西瓜抗枯萎病的精准鉴定方法。
背景技术
西瓜是世界上十大水果之一，有“夏季水果之王”的美称，据FAO统计，2013年，全球西瓜收获面积约348万公顷，在水果中位于第七位，产量约10927万吨，居水果第一位。但由于西瓜尖孢镰刀菌引起的西瓜枯萎病害，造成西瓜大量减产，该病害已成为危害西瓜产业最严重病害之一。尤其近年来，西瓜不断种植向设施化、基地化、专业化方向发展，重茬、连作现象严重，为西瓜枯萎病的发生、发展和流行创造了极为有利的条件，西瓜枯萎病已成为制约西瓜高产、优质的主要因素。在我国每年枯萎病发生的面积约为25万公顷，重茬地一般发病率在30%以上，严重地块达80%，甚至造成绝收，给西瓜产业带来巨大经济损失。
西瓜枯萎病病原为尖孢镰刀菌西瓜专化型，当前该专化型有4个生理小种，分别为0、1、2和3（FON0/1/2/3），生理小种FON0对一些感病品种具有致病性；生理小种1的毒性比生理小种0强，它对抗生理小种0的一些西瓜品种具有致病性；生理小种2能够导致绝大多数的西瓜品种致病；生理小种3能够引起PI296431-FR枯萎，维管束褐变（徐伟慧. 中国蔬菜2013（8）：4-11）。在我国研究发现西瓜枯萎病菌优势菌是生理小种1。西瓜枯萎病菌致病性生理小种的差异，为西瓜抗病育种提供了方向，也为综合防治提供科学思路和依据。
西瓜枯萎病防治十分困难，人们采取种种措施开展西瓜枯萎病防治研究，例如：轮作套作、嫁接、化学防治和抗病育种等，但都存在着一定的局限性。由于病原菌能够在土壤中存活6年以上，使得轮作套作受到限制；嫁接育苗耗费更多人力物力和财力，育苗时间更长并且会影响西瓜品质，同时无法解决种子携带病原菌的问题，而且西瓜嫁接时根腐病和茎基腐病的发生几率会大幅增加；化学药品的使用，会造成农药残留、环境污染、对人及家畜都有毒害作用。
抗病育种是最有效的、最安全的枯萎病防治途径之一，但由于西瓜材料和病原遗传背景不清楚、不同生理小种和同一生理小种不同致病力菌株选择局限性、接种技术的成熟性及抗病鉴定重复性等问题，导致育种周期过长、品种抗病局限性、研发成本和价格也相对过高，从而限制其大面积推广和应用。因此，为了更好地防治西瓜枯萎病，筛选出广谱、高抗枯萎病西瓜材料、加速不同抗病材料抗病因子集中，开展病原菌的致病力分化和品种资源的抗性鉴定研究，建立准确西瓜抗病鉴定技术体系十分必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及其在西瓜精准抗枯萎病鉴定中的应用；运用该本发明方法进行西瓜材料或品种抗枯萎病鉴定，步骤简单、结果直观、一致性和重复性强；本发明方法也可用于其他引起维管束病害的病原菌，如香蕉枯、番茄、棉花和黄瓜枯萎病病原菌等，创制不同枯萎病菌致病力差异菌株，加速不同枯萎病性寄主材料和品种抗性鉴定及抗病育种进程。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
随着分子生物学及其转基因技术的成熟和推广，农杆菌介导的西瓜枯萎病遗传转化技术已成为研究西瓜枯萎病菌的重要手段，这为创制不同致病力菌株提供了捷径，为筛选弱致病性和致病性缺陷的西瓜枯萎病菌株提供丰富的筛选菌源，同时，在抗病育种中也克服了不同枯萎病菌菌株遗传背景的差异，抗病鉴定更加精准、简单、高效。
设计一种系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，包括如下步骤：
（1）建立西瓜枯萎病菌突变体库
以尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种FON1（FON2、FON3、或FON0）菌株为受体，通过农杆菌介导的西瓜尖孢镰刀菌遗传转化方法，建立西瓜尖孢镰刀菌突变体库；
（2）获取西瓜枯萎病菌遗传转化突变体
依据阳性转化子中含有潮霉素（HPH）标记基因，进行转化子分子鉴定，确证转化子为西瓜尖孢镰刀菌插入突变体；
（3）鉴定菌株致病力强弱
以西瓜幼苗为供试材料，开展突变体致病性分析，观察与调查幼苗发病情况，并计算病情指数，确定西瓜尖孢镰刀菌突变体致病力强弱；
（4）筛选出用于西瓜抗病品种或材料鉴定的、不同致病力西瓜枯萎病菌突变体菌株
在菌株病情指数测定结果的基础上，选取不同致病力菌株进行培养性状（菌落生长速度、菌落颜色、气生菌丝、产孢量）和形态学特征（菌丝及其分生孢子形态等）等生物学性状分析，选择与FON1（FON2、FON3或FON0）培养性状和形态特征差异较小，但致病力有差异的菌株作为候选菌株用于西瓜抗病鉴定的靶标菌株。
在上述步骤（1）中，建立突变体库的具体方法如下：
① 取接种７-15ｄ的西瓜尖孢镰刀菌FON1（FON2、FON3或FON0）进行PDA培养平板，加入15-30ml无菌水制备分生孢子悬浮液，经2-3层无菌擦镜纸过滤后，配制成浓度为1×106分生孢子/ml分生孢子悬浮液，用于镰刀菌遗传转化；
② 取含有pATMT1质粒的农杆菌AGL1接种于LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养，待菌液OD600达0.5-0.6时，吸取200μl菌液接种到5ml含有200μg/ml乙酰丁香酮的AIM液体培养基中，28℃下200rmp/min振荡培养６ｈ，待菌液OD600达0.15时，用于共培养转化；
③ 分别取镰刀菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各50-100μl，混合均匀后涂布放置于AIM固体培养基（含200μg/ml乙酰丁香酮）表面的硝酸纤维素膜上，22℃下黑暗培养48h；
④ 将硝酸纤维素膜剪成0.5-1cm宽的条状，转移至含有抗生素（100μg/ml潮霉素Ｂ、400μg/ml头孢霉素和60μl/ml硫酸链霉素）的PDA培养平板上，28℃培养3～5d直至转化子出现；
⑤ 挑取抗性平板上的转化子，转移到含有100μg/ml潮霉素Ｂ的PDA平板上，进行二次筛选，在抗潮霉素Ｂ培养平板上生长菌落即为转化子。
在上述步骤（2）中，转化子分子鉴定方法为：以转化子基因组DNA为模板，以下述HPH-F/HPH-R为引物，进行潮霉素B抗性片段的PCR检测，20μl PCR扩增反应体系：模板 1-100ng，HPHF(10uM) 1μl, HPH-R(10uM) 1μl，dNTP(10mM) 1μl，聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液(10*) 10倍稀释 水补足所需体积; PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。扩增出潮霉素B基因DNA片段的转化子，即为西瓜枯萎病菌突变体。潮霉素B扩增引物如下：
HPH-F：5’TTGACATTGGGGAGTTTAGCG3’
HPH-R：5’TGTTGGCGACCTCGTATTG3’；
在上述步骤（3）中，依据病情指数进行致病性分析的具体步骤如下：
① 取培养10d的西瓜枯萎病菌PDA平板，加入无菌水20ml，经无菌擦镜纸过滤后，收集枯萎病菌分生孢子，并配制成浓度为1×105分生孢子/ml孢子悬浮液，用于接种实验；
② 西瓜种子在2%的次氯酸钠溶液中浸泡5min，清水洗净，播于灭菌的基质内，在人工气候箱内25℃，12h，16℃，12h环境下生长，待长到两叶一心时接种；
③ 取两叶一心时西瓜幼苗，去除根系基质并冲洗干净后，剪除部分须根，在分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘，每个菌株接种30棵西瓜幼苗，22-28℃温度下，常规管理，并观察发病情况，待发病后记录发病情况，并计算病情指数；根据上致病性分析，创制出西瓜尖孢镰刀菌FON1（FON2、FON3或FON0）不同致病力菌株：强、较强、中、较弱、弱突变体菌株；
西瓜幼苗病情调查按照如下病株分级标准：
0级：植株健壮，真叶和子叶均为绿色；
1级：1片或两片子叶轻微变黄；
2级：1-2片子叶黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍微变黄、轻微萎焉；
3级：子叶枯死，真叶明显萎蔫，植株生长受阻，稍矮化；
4级：全株严重萎蔫，叶片枯黄；
5级：整株枯死，甚至倒伏；
病情指数计算公式：
病情指数=Σ（各病情等级数×该病情代表数）/(最高病情等级数×调查总株数)×100；
用于抗病育种的、不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的确定，包括如下步骤：
在菌株病情指数测定结果的基础上，选取不同致病力菌株进行培养性状（菌落生长速度、菌落颜色、气生菌丝、产孢量）和形态学特征（菌丝及其分生孢子形态等）等生物学性状分析，选择与野生型FON1菌株培养性状和形态特征差异较小，但致病力有差异的菌株FON1-1--FON1-5作为候选菌株用于西瓜抗病鉴定。
在西瓜抗枯萎病性鉴定中应用，包括如下步骤：
（1）西瓜材料或品种抗病鉴定
依据权利要求1所获得的不同致病力西瓜枯萎病菌菌株，分别选择致病力强、中、较弱、弱突变体菌株，接种于不同西瓜幼苗材料或品种上，进行致病性分析，计算病情指数，根据西瓜品种或抗病材料发病病情指数，确定材料抗病能力及其抗病特异性，其抗病分级标准为：
高抗：小于20%；
中抗：21%-50%；
轻抗：51%-80%；
感病：80%-100%，
（2）西瓜精准抗病鉴定
经西瓜尖孢镰刀菌FON1（FON2、FON3或FON0）突变体库致病力及其生物学特性分析筛选，分别筛选出西瓜尖孢镰刀菌不同生理小种突变体抗病性鉴定筛选菌株组合，进行不同西瓜品种的准确抗病性鉴定：同一材料对不同生理小种定性抗病测定；同一材料对某一种生理小种抗性强弱的定量抗病测定。
本发明积极有益的技术效果在于：
1. 以本发明方法可创制出同一生理小种致病力强弱差异的突变体，这些突变体是近等基因系，克服传统菌株遗传背景复杂的噪音干扰，不但可以准确鉴定该西瓜材料或品种在某一生理小种表现出抗病性，而且可以鉴定该西瓜材料或品种在不同生理小种抗病强弱差异，建立更加精准抗病鉴定，为不同材料间抗病杂交育种，集中抗病相关因子提供更加科学理论指导，从而加速抗病育种进程。
2. 尖孢镰刀菌能够引起不同寄主发生枯萎病害，这些菌株形成不同寄主专化型，利用该发明方法，可以建立不同寄主如香蕉、番茄、棉花等专化型镰刀菌突变体库，创制出相应生理小种致病力差异菌株，从而加速该种寄主抗枯萎病育种进程。
3. 经由本发明方法能建立强大突变体库，可以进行基因组功能解码，为从基因互作网络探明致病分子机理提供充足的极其有价值的研究材料，也为挖掘西瓜枯萎病菌药物靶点奠定坚实的理论基础和材料选择。
4. 经由本发明方法所获得的一些致病性丧失突变体可以作为生防菌株，增强西瓜免疫功能，提高西瓜枯萎病抗性。
附图说明
图1为西瓜尖孢镰刀菌生理小种FON1菌落和分生孢子的形态照片，图中：A野生型菌株FON1菌落，B野生型菌株FON1分生孢子；
图2为用于建立不同致病力突变体菌落的对比图，从FON1、FON1-1到FON1-4菌株（FON1为野生型菌株、FON1-1到FON1-5为不同致病力突变体菌株）生物学性状具有一定的类似性，即菌落形态、生长速度、菌落颜色、产孢量、气生菌丝等差异不显著；
图3是系统创制的不同致病力西瓜尖孢镰刀菌菌株对西瓜幼苗的致病性分析对比图；
图4是6株不同致病力的西瓜尖孢镰刀菌菌株在4个不同的西瓜抗病品种的致病性分析对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂及原料如无特别说明，均为市售常规工业原料；所涉及的试验方法或步骤，如无特别说明，均为常规方法或步骤。
实施例1：西瓜枯萎病菌转化子的获得
① 取接种７ｄ的西瓜尖孢镰刀菌FON1（河南省农业科学院园艺所西瓜甜瓜研究室保存，采集人：梁慎；采集时间：2015.5；采集地点：河南开封市）进行PDA培养平板，加入15mL无菌水制备分生孢子悬浮液，经2-3层无菌擦镜纸过滤后，配制成浓度为1×106分生孢子/ml分生孢子悬浮液，用于镰刀菌遗传转化；
② 取含有pATMT1质粒的农杆菌AGL1（购自上海唯地生物技术有限公司）接种于LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养，待菌液OD600达0.5-0.6时，吸取200μl菌液接种到5ml含有200μg/ml乙酰丁香酮的AIM液体培养基中，28℃下200rmp/min振荡培养６ｈ，待菌液OD600达0.15时，用于共培养转化；
③ 分别取镰刀菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各100μl，混合均匀后涂布放置于AIM固体培养基（含200μg/ml乙酰丁香酮）表面的硝酸纤维素膜上，22℃下黑暗培养48h；
④ 将硝酸纤维素膜剪成0.6cm宽的条状，转移至含有抗生素（100μg/ml潮霉素Ｂ、400μg/ml头孢霉素和60μl/ml硫酸链霉素）的PDA培养平板上，28℃培养3～5d直至转化子出现；
⑤ 挑取抗性平板上的转化子，转移到含有100μg/ml潮霉素Ｂ的PDA平板上，进行二次筛选，在抗潮霉素Ｂ培养平板上生长菌落即为转化子；
⑥ 以转化子基因组DNA为模板，以下述HPH-F/HPH-R（HPH-F：5’TTGACATTGGGGAGTTTAGCG3’；HPH-R：5’TGTTGGCGACCTCGTATTG3’；
）为引物，进行潮霉素B抗性片段的PCR检测，扩增出潮霉素B基因DNA片段的转化子，即为西瓜枯萎病菌突变体。20μl PCR扩增反应体系：模板 1-100ng, HPH-F(10uM) 1μl, HPH-R(10uM) 1μl，dNTP(10mM) 1μl, 聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液(10*) 10倍稀释 水补足所需体积; PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。
实施例2：不同致病力西瓜枯萎病菌参考标准菌株的建立
① 取培养10d的西瓜枯萎病菌PDA平板，加入无菌水20ml，经无菌擦镜纸过滤后，收集枯萎病菌分生孢子，并配制成浓度为1x105分生孢子/ml孢子悬浮液，用于接种实验；
② 西瓜种子在2%的次氯酸钠溶液中浸泡5min，清水洗净，播于灭菌的基质内，在人工气候箱内25℃，12h，16℃，12h环境下生长，待长到两叶一心时接种；
③ 取两叶一心时西瓜幼苗，去除根系基质并冲洗干净后，剪除部分须根，在分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘，每个菌株接种30棵西瓜幼苗，22-28℃温度下，常规管理，并观察发病情况，待发病后记录发病情况，并计算病情指数；
西瓜幼苗病情调查按照如下病株分级标准：
0级：植株健壮，真叶和子叶均为绿色；
1级：1片或两片子叶轻微变黄；
2级：1-2片子叶黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍微变黄、轻微萎焉；
3级：子叶枯死，真叶明显萎蔫，植株生长受阻，稍矮化；
4级：全株严重萎蔫，叶片枯黄；
5级：整株枯死，甚至倒伏；
病情指数计算公式：
病情指数=Σ（各病情等级数×该病情代表数）/(最高病情等级数×调查总株数)×100；
根据上述致病性分析，系统创制出不同致病力西瓜尖孢镰刀菌菌株。如图3所示：FON1-1菌株接种的西瓜幼苗15d全部发病死亡，其病情指数为100%；野生型FON-1，为阳性对照，接种西瓜幼苗同样全部发病，病情指数也为100%；水作为阴性对照，西瓜幼苗生长良好，不发病。FON1-2、FON1-3、FON1-4、FON1-5接种的西瓜幼苗病情指数分别为87.5%、75%、50%、20%；由此表明，FON1-1、FON1-2、FON1-3、FON1-4、FON1-5可能为系统创制出的不同致病力的西瓜枯萎病菌菌株；
④ 在菌株病情指数测定结果的基础上，选取FON1-1、FON1-2、FON1-3、FON1-4、FON1-5不同致病力菌株进行培养性状（菌落生长速度、菌落颜色、气生菌丝、产孢量）和形态学特征（菌丝及其分生孢子形态等）等生物学性状分析，这些菌株与野生型FON1菌株培养性状和形态特征差异较小，但致病力有差异，因此，菌株FON1-1--FON1-5作为候选菌株用于西瓜抗病鉴定。
实施例3：不同西瓜品种抗性鉴定
① 培养不同致病力西瓜枯萎病菌FON1、FON1-1、FON1-2、FON1-3、
FON1-4、FON1-5菌株接种于4个抗病品种（郑抗1号、郑抗2号、郑抗3号、郑抗6号）进行抗病性鉴定上，进行致病性分析，计算病情指数，根据西瓜品种发病病情指数和抗病分级标准，确定材料抗病能力及其抗病特异性。其抗病分级标准为：
高抗：小于20%；
中抗：21%-50%；
轻抗：51%-80%；
感病：80%-100%，
② 西瓜精准抗病鉴定 依据抗性分级标准得到如下结果，4个抗病品种（郑抗1号、郑抗2号、郑抗3号、郑抗6号）进行抗病性鉴定：郑抗3号的抗性最强，是高抗品种；郑抗2号抗性次之，是中抗品种；郑抗6号较弱，郑抗1号抗性最弱，基本属于对枯萎病感病的品种。
③ 经西瓜尖孢镰刀菌FON1（FON2、FON3或FON0）突变体库致病力及其生物学特性分析筛选，分别筛选出西瓜尖孢镰刀菌不同生理小种突变体抗病性鉴定筛选菌株组合，进行不同西瓜品种的准确抗病性鉴定可以实现：同一材料对不同生理小种定性抗病测定，同一材料对某一种生理小种抗性强弱的定量抗病测定，实现精准抗病鉴定。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院园艺研究所；中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法及西瓜抗枯萎病的精准鉴定方
法
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgacattgg ggagtttagc g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgttggcgac ctcgtattg 19

Claims (5)

1. 一种系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，包括如下步骤：
（1）建立西瓜枯萎病菌突变体库
以尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种FON1、FON2、FON3、或FON0菌株为受体，通过农杆菌介导的西瓜尖孢镰刀菌遗传转化方法，建立西瓜尖孢镰刀菌突变体库；
（2）获取西瓜枯萎病菌遗传转化突变体
依据阳性转化子中含有潮霉素标记基因，进行转化子分子鉴定，确证转化子为西瓜尖孢镰刀菌插入突变体；
（3）鉴定菌株致病力强弱
以西瓜幼苗为供试材料，开展突变体致病性分析，观察与调查幼苗发病情况，并计算病情指数，确定西瓜尖孢镰刀菌突变体致病力强弱；
（4）筛选用于西瓜抗病鉴定的、不同致病力的突变体菌株
在菌株病情指数测定结果的基础上，选取不同致病力菌株进行培养性状和形态学特征分析，选择与FON1、FON2、FON3或FON0培养性状和形态特征差异较小，但致病力有差异的菌株作为候选菌株用于西瓜抗病鉴定的靶标菌株。
2.根据权利要求1所述的系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，建立突变体库的具体方法如下：
① 取接种７-15ｄ的西瓜尖孢镰刀菌FON1、FON2、FON3或FON0进行PDA培养平板，加入15mL-30ml无菌水制备分生孢子悬浮液，经2-3层无菌擦镜纸过滤后，配制成浓度为1×106分生孢子/ml分生孢子悬浮液，用于镰刀菌遗传转化；
② 取含有pATMT1质粒的农杆菌AGL1接种于LB液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养，待菌液OD600达0.5-0.6时，吸取200μl菌液接种到5ml含有200μg/ml乙酰丁香酮的AIM液体培养基中，28℃下200rmp/min振荡培养６ｈ，待菌液OD600达0.15时，用于共培养转化；
③ 分别取镰刀菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各50-100μl，混合均匀后涂布放置于AIM固体培养基表面的硝酸纤维素膜上，22℃下黑暗培养48h；
④ 将硝酸纤维素膜剪成0.5-1cm宽的条状，转移至含有抗生素的PDA培养平板上，28℃培养3～5d直至转化子出现；
⑤ 挑取抗性平板上的转化子，转移到含有100μg/ml潮霉素Ｂ的PDA平板上，进行二次筛选，在抗潮霉素Ｂ培养平板上生长菌落即为转化子。
3. 根据权利要求1所述的系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，转化子分子鉴定方法为：以转化子基因组DNA为模板，以下述HPH-F/HPH-R为引物，进行潮霉素B抗性片段的PCR检测，扩增出潮霉素B基因DNA片段的转化子，即为西瓜枯萎病菌突变体；潮霉素B扩增引物如下：
HPH-F：5’TTGACATTGGGGAGTTTAGCG3’
HPH-R：5’TGTTGGCGACCTCGTATTG3’；
根据权利要求3所述的系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，潮霉素B抗性片段的PCR检测特征在于，20μl PCR扩增反应体系：模板 1-100ng, 10uM的 HPH-F1μl，10uM的 HPH-R 1μl， 10mM的 dNTP 1μl，聚合酶 5-10U， 聚10×buffer 2μl，水补足至20μl； PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。
4.根据权利要求1所述的系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，依据病情指数确定其致病力强弱，致病性分析的具体步骤如下：
① 取培养10d的西瓜枯萎病菌PDA平板，加入无菌水20ml，经无菌擦镜纸过滤后，收集枯萎病菌分生孢子，并配制成浓度为1x105分生孢子/ml孢子悬浮液，用于接种实验；
② 西瓜种子在2%的次氯酸钠溶液中浸泡5min，清水洗净，播于灭菌的基质内，在人工气候箱内25℃，12h，16℃，12h环境下生长，待长到两叶一心时接种；
③取两叶一心时西瓜幼苗，去除根系基质并冲洗干净后，剪除部分须根，在分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘，每个菌株接种30棵西瓜幼苗，22-28℃温度下，常规管理，并观察发病情况，待发病后记录发病情况，并计算病情指数；根据上致病性分析，创制出西瓜尖孢镰刀菌FON1、FON2、FON3或FON0不同致病力菌株：强、较强、中、较弱、弱突变体菌株；
西瓜幼苗病情调查按照如下病株分级标准：
0级：植株健壮，真叶和子叶均为绿色；
1级：1片或两片子叶轻微变黄；
2级：1-2片子叶黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍微变黄、轻微萎焉；
3级：子叶枯死，真叶明显萎蔫，植株生长受阻，稍矮化；
4级：全株严重萎蔫，叶片枯黄；
5级：整株枯死，甚至倒伏；
病情指数计算公式：
病情指数=Σ（各病情等级数×该病情代表数）/(最高病情等级数×调查总株数)×100；
根据权利要求1所述的系统创制不同致病力西瓜枯萎病菌菌株的方法，其特征在于，在所述步骤（4）中，筛选西瓜抗病鉴定的、不同致病力的突变体菌株具体步骤如下：
选取不同致病力菌株进行培养性状和形态学特征分析，选择与FON1、FON2、FON3或FON0培养性状和形态特征差异较小，但致病力有差异的菌株作为候选菌株：强、较强、中、较弱、弱突变体菌株。
5. 一种西瓜抗枯萎病的精准鉴定方法，包括如下步骤：
（1）西瓜材料或品种抗病鉴定
利用权利要求1所获得的不同致病力西瓜枯萎病菌菌株，分别选择致病力强、较强、中、较弱、弱突变体菌株，接种于不同西瓜幼苗材料或品种上，进行致病性分析，计算病情指数，根据西瓜品种或材料发病病情指数和抗病分级标准，确定材料抗病能力，其抗病分级标准为：
高抗：小于20%；
中抗：21%-50%；
轻抗：51%-80%；
感病：80%-100%，
（2）西瓜精准抗病鉴定
经西瓜尖孢镰刀菌FON1、FON2、FON3或FON0突变体库致病力及其生物学特性分析筛选，筛选出西瓜尖孢镰刀菌不同生理小种、不同致病力突变体、用于西瓜抗枯萎病鉴定的菌株组合；进行不同西瓜品种和材料准确抗病性鉴定包括：
①同一材料对不同生理小种定性抗病测定；
②同一材料对某一种生理小种抗性强弱定量抗病测定。
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