CN101849469A - 一种西瓜苗期疫病抗性的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种西瓜苗期疫病抗性的鉴定方法，该方法是在二叶期距无菌苗根部约1～2cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，于25～28℃，相对湿度95～100％的黑暗条件下保湿24h，以后给予12h/d光照，记录接种后第12～15d内的发病率和病情指数；根据记录数据将西瓜幼苗对疫病的抗性分为0、1、2、3、4、5共六级。该鉴定方法为西瓜抗病育种工作提供技术依据。

Description

一种西瓜苗期疫病抗性的鉴定方法

技术领域

本发明属于西瓜育种技术领域，具体涉及种一种西瓜疫病苗期抗性的鉴定方法。

技术背景

西瓜疫病也叫疫霉病，俗称瓜瘟，是西瓜上发生的一种毁灭性病害。疫病发病周期短，流行速度快，一旦染病，很难治愈，给西瓜生产造成很大的经济损失。目前在生产上主要依靠化学药剂进行防治，但由于化学药剂的防治受多种环境因素的影响，防治受到限制，防效不显著，同时会造成生态环境的污染。目前对西瓜疫病的抗性筛选未形成一套具体的研究方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种西瓜苗期疫病抗性的鉴定方法，该方法本发明的目的在于提供一套准确实用的西瓜疫病苗期人工接种抗性鉴定方法。

实现上述发明的技术解决方案是，一种西瓜疫病苗期灌根接种抗性鉴定方法，具体包括下列步骤：

1.一种西瓜疫病苗期抗性的鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)在二叶期距无菌苗根部约1～2cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，于25～28℃，相对湿度95～100％的黑暗条件下保湿24h，以后给予12h/d光照，记录接种后第12～15d内的发病率和病情指数；

2)根据记录数据将西瓜幼苗对疫病的抗性分为0、1、2、3、4、5共六级；0级：无任何症状；1级：幼苗茎基部出现缢缩，植株倒伏，但不萎蔫；2级：幼苗茎基部出现缢缩，但缢缩面不超过株高的1/3，茎部褐色水渍状病斑，子叶萎蔫，植株倒伏；3级：幼苗茎部缢缩面超过整株的1/3，但不超过株高的2/3，缢缩部褐色，子叶干枯；4级：幼苗茎部缢缩面超过株高的2/3或蔓延至全茎，缢缩部黑褐色，子叶干枯，真叶萎蔫；5级：植株枯死；

所述有病情指数的(DI)计算公式如下：

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)

抗性分级标准：免疫(I)：病情指数为0；

高抗(HR)：病情指数为0＜DI≤10；

抗病(R)：病情指数10＜DI≤30；

中抗(MR)：病情指数30＜DI≤50；

感病(S)：病情指数50＜DI≤70；

高感(HS)：病情指数70＜DI≤100。

本发明人采用游动孢子液灌根接种法从接种浓度、接种时期、接种后最佳病情调查时期等方面进行研究，提出一套准确而实用的西瓜苗期疫病人工接种抗性鉴定、筛选的方法和程序，为开展西瓜抗病育种工作提供技术依据。

与现有技术相比较，本发明的方法具有以下优点：

1.与其它接种方法(喷雾法、针刺法、浸根法)相比，更接近大田环境，对品种的抗性鉴定更准确。

2.与其它接种浓度、接种苗龄、接种后病情调查期相比，在两片真叶期接种1×10⁶个孢子/ml浓度的孢子悬浮液，抗病品种、感病品种的病情指数差异明显，容易区分抗感品种；接种后在12～15d范围内，病情指数比较稳定，适合病害程度调查。

3.病情分级完全体现了西瓜幼苗疫病发病的全过程，各等级病害特征明显。

附图说明

图1为本发明方法中病情等级从左至右依次为0、1、2、3、4、5级的幼苗现状图。

图2为本发明方法中不同抗性品种接种后病情发展趋势图。

具体实施方式

以下通过发明人给出的具体实施例和试验例来进一步说明本发明的方法的有益效果。

实施例1

1.一个西瓜品种京父-3苗期抗性的鉴定方法，包括下列步骤：

1)当京父-3长至两片真叶时，在距其根部约1cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，接种15株，3次重复，然后在昼温30℃，夜温24℃，相对湿度95％的黑暗条件下保湿24h，之后给予12h/d光照，记录接种后第13d的发病率和病情指数。

2)京父-3总接种株数45株，发病株数12株，发病率为26.7％。

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)＝[(0×33+1×0+2×0+3×3+4×6+5×3)×100]/(5×45)＝21.3

根据抗性分级标准得出：京父-3属于抗病品种。

实施例2

1.一个西瓜品种GS-37苗期抗性的鉴定方法，包括下列步骤：

1)当GS-37长至两片真叶时，在距其根部约1cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，接种15株，3次重复，然后在昼温30℃，夜温24℃，相对湿度95％的黑暗条件下保湿24h，之后给予12h/d光照，记录接种后第13d的发病率和病情指数。

2)GS-37总接种株数45株，发病株数34株，发病率为75.6％。

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)＝[(0×11+1×4+2×7+3×6+4×5+5×12)×100]/(5×45)＝51.6

根据抗性分级标准得出：GS-37属于感病品种。

实施例3

1.一个西瓜品种G-S-12苗期抗性的鉴定方法，包括下列步骤：

1)当G-S-12长至两片真叶时，在距其根部约1cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，接种15株，3次重复，然后在昼温30℃，夜温24℃，相对湿度95％的黑暗条件下保湿24h，之后给予12h/d光照，记录接种后第13d的发病率和病情指数。

2)G-S-12总接种株数45株，发病株数45株，发病率为100％。

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)＝[(2×10+3×5+4×12+5×18)×100]/(5×45)＝76.8

根据抗性分级标准得出：G-S-12属于高感品种。

试验例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1西瓜品种：

京父-3(抗病品种)、GS-37(感病品种)、G-S-12(高感品种)，由西北农林科技大学园艺学院西瓜课题组提供。

1.1.2

西瓜疫霉菌由西北农林科技大学园艺学院西瓜课题组提供，该菌种分离自陕西杨凌新天地农业示范园种植的西瓜品种上。

1.2方法

1.2.1病原菌的提取

将被感染的西瓜植株取下，用灭菌手术刀在病健交界处切取小段，用75％的酒精浸泡2～3s，无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞浸泡2～3min然后用无菌水冲洗3遍，并用无菌吸水纸吸干表面的水分，在无菌操作下，用刀片、剪刀等器具，削去蔓的皮，然后取中间维管束组织，用剪刀剪成数枚小块，分散移植到PDA培养基上，在28℃按培养3～4天后进一步纯化、扩繁。纯化后的菌株保存在PDA斜面上，置4℃冰箱中贮存备用。对分离保存的菌株，用柯赫氏法则进行回接，观察症状表现与原发病株症状相同，进行再分离，在显微镜下观察分离菌体与原接种菌株相同。

1.2.2菌种的培养和菌液的制备

将供试菌种转移到盛有PAD培养基的培养皿上，置于28℃恒温培养箱内暗培养，待菌落长满培养皿时，放到40W日光灯下照射7d，诱导孢子囊的产生，备用。

向诱好孢子囊的培养皿中加入10ml无菌水，于4℃放置30min诱导游动孢子释放，随后室温光照2h后用消毒毛笔刷洗培养基表面，双层纱布过滤，收集游动孢子悬浮液，用血球计数板镜检游动孢子，并调整悬浮液中游动孢子数量到所需浓度时立即使用。

1.2.3西瓜苗的培养

西瓜育苗选用中型塑料育苗钵；育苗基质用草炭、珍珠岩按3∶1的比例配制；基质的消毒：每立方米基质加100g多菌灵。用55℃温水浸泡种子，用水量为种子量的3倍左右，并不断搅拌，待水温降低至30℃时取出种子，再用2％的漂白粉消毒10min(分)，用清水冲洗干净，在室温下浸种，6-8h，然后用清水冲洗2-3遍，搓洗掉种子上的粘液。将种子装入小烧杯中，用湿布盖好，置于30℃下催芽，待种子露白时直接播于育苗钵中，深度1cm左右。播种后室内正常水肥管理。

1.2.4不同接种浓度试验

将游动孢子悬浮液设为1×10⁷个/ml、1×10⁶个/ml、1×10⁵个/ml的3个悬浮液，以蒸馏水为对照，采用灌根法接种于二叶期的无菌苗上，在距幼苗根部约1～2cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为10⁷～10⁵个/ml的饱子悬浮液注入孔内。于25～28℃，相对湿度95～100％的黑暗条件下保湿24h，以后给予正常的光周期，观察发病情况。

1.2.5不同幼苗形态接种试验

接种苗龄分3个时期：子叶期、二叶期、四叶期，孢子悬浮液浓度采用1×10⁶个/ml，采用灌根法，其他同“1.2.3”。

1.2.6接种后不同时期调查病情试验

于二叶期用灌根法接种，浓度为1×10⁶个/ml。从接种后的第6d开始，每天调查发病率和病情指数，观察病情发展情况，以确定一个最适调查时期。

1.2.7病情分级

参考辣椒疫病的分级标准将西瓜幼苗对疫病的抗性分为0、1、2、3、4、5共六级。0级：无任何症状；1级：幼苗茎基部出现缢缩，植株倒伏，但不萎蔫；2级：幼苗茎基部出现缢缩，但缢缩面不超过株高的1/3，茎部褐色水渍状病斑，子叶萎蔫，植株倒伏；3级：幼苗茎部缢缩面超过整株的1/3，但不超过株高的2/3，缢缩部褐色，子叶干枯；4级：幼苗茎部缢缩面超过株高的2/3或蔓延至全茎，缢缩部黑褐色，子叶干枯，真叶萎蔫；5级：植株枯死。病情指数(DI)计算公式如下：

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)

抗性分级标准：免疫(I)：病情指数为0；高抗(HR)：病情指数为0＜DI≤10；抗病(R)：病情指数10＜DI≤30；中抗(MR)：病情指数30＜DI≤50；感病(S)：病情指数50＜DI≤70；高感(HS)：病情指数70＜DI≤100。

2结果与分析

2.1不同接种浓度对发病的影响

由表1可知，在1×10⁵个/ml孢子浓度下，高感品种“G-S-12”表现感病；感病品种“GS-37”表现中抗；发病率降低，而且发病时间较长，不利于病情调查；抗病品种“京父-3”表现高抗，均不能真实反映三个品种的抗性水平。在1×10⁷个/ml孢子浓度下，由于浓度过高，高感品种“G-S-12”的病情指数接近了100，发病过重；感病品种“GS-37”表现高感；抗病品种“京父-3”表现感病，也不能真实的反映三个品种的抗性水平。在1×10⁶个/ml孢子浓度下，抗病品种、感病品种与高感品种的病情指数差异明显，容易区分抗感品种。因此在苗期人工接种鉴定中，适宜的接种孢子液浓度确定为1×10⁶个/ml。

表1接种浓度对发病的影响

2.2不同苗龄接种对发病影响

表2不同苗龄对接种效果的影响

由表2可知，随着苗龄的增长，植株的抗病性增强，发病率降低。子叶期与二片真叶期和四片真叶期的病情指数差异显著；子叶期的感病品种“GS-37”与高感品种“G-S-12”的发病率和病情指数都很高；二片真叶期的抗病品种“京父-3”、感病品种“GS-37”与高感品种“G-S-12”的病情指数差异也达到显著水平，发病率和病情指数大小适中，适合进行抗病性鉴定。

2.3接种后不同调查时期病情发展情况调查结果

图2为不同抗性品种接种后病情发展趋势图，感病品种“GS-37”与高感品种“G-S-12”在接种后第6d开始出现病株，抗病品种“京父-3”在第7d有少数病株出现。在接种后的8～11d里，各品种的发病指数均有不同程度上升，说明在这段时间里病情发展较快。第11d后，各品种的病情指数的发展趋于平缓。接种15d后，高感品种“G-S-12”的病情发展得过于严重，而且感病品种“GS-37”的病情指数也上升较高。由此认为，在接种后第12d，这三个不同抗性的品种都表现出其客观的抗病性，在第12～15d这个时期内，病情指数比较稳定，进行病害程度调查是适宜的。

Claims (1)

1.一种西瓜苗期疫病抗性的鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)在二叶期距无菌苗根部约1～2cm处，扎一3cm深的孔，将3ml浓度为1×10⁶个孢子/ml游动孢子悬浮液注入孔内，于25～28℃，相对湿度95～100％的黑暗条件下保湿24h，以后给予12h/d光照，记录接种后第12～15d内的发病率和病情指数；

2)根据记录数据将西瓜幼苗对疫病的抗性分为0、1、2、3、4、5共六级；0级：无任何症状；1级：幼苗茎基部出现缢缩，植株倒伏，但不萎蔫；2级：幼苗茎基部出现缢缩，但缢缩面不超过株高的1/3，茎部褐色水渍状病斑，子叶萎蔫，植株倒伏；3级：幼苗茎部缢缩面超过整株的1/3，但不超过株高的2/3，缢缩部褐色，子叶干枯；4级：幼苗茎部缢缩面超过株高的2/3或蔓延至全茎，缢缩部黑褐色，子叶干枯，真叶萎蔫；5级：植株枯死；

所述有病情指数的(DI)计算公式如下：

病情指数(DI)＝[∑(病级数值×该病级病株数)×100]/(病级最高值×调查株数)

抗性分级标准：免疫(I)：病情指数为0；

高抗(HR)：病情指数为0＜DI≤10；

抗病(R)：病情指数10＜DI≤30；

中抗(MR)：病情指数30＜DI≤50；

感病(S)：病情指数50＜DI≤70；

高感(HS)：病情指数70＜DI≤100。

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