CN104818222A - 烟草赤星病的人工接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟草赤星病菌的人工接种方法。本发明所提供的烟草赤星病菌的人工接种方法，利用赤星病菌孢子悬浮液经离体叶片伤口注射对成熟叶片进行接种，病菌的分生孢子可以直接进入叶片内，借助水分及寄主叶肉组织营养萌发、扩繁，向细胞间扩展，局部组织死亡形成的病斑会得到大面积扩大。可达到接种率高，发病程度适中的效果，这为鉴定我国烟草主产区不同赤星病菌致病性及小种差异及烟草赤星病抗性品种的筛选提供了一种简易、方便、快速、准确的人工接种方法，具有较好的应用价值。

Description

烟草赤星病的人工接种方法

技术领域

本发明涉及植物保护领域的病菌接种方法，特别涉及烟草赤星病的人工接种方法。

背景技术

烟草赤星病是由链格孢菌(Alternaria alternata Fries Keissler)引起的一种叶部真菌病害，发生于烟草生长中后期，是烟草生产上威胁较大的病害之一。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，在适宜的环境条件下，短时间内即可造成大流行，给烟叶生产带来巨大损失。自20世纪90年代以后，我国烟草赤星病的发生逐年上升，且愈趋严重，成为主要的侵染性病害之一。因此，科学的控制赤星病是生产上亟待解决的问题。利用抗病品种是防治烟草赤星病最为有效的措施，这就有必要确定赤星病病菌的致病性强弱及优势菌群，并进行烟草种质资源与品种抗病性鉴定与筛选工作。这其中就牵涉到快速、简便、有效的人工接种方法，

因为依靠田间自然发病鉴定，调查困难，费时费力，周期长，而温室接种试验场地较为费工，人工接种法可节省菌液、劳力、试材和设备，且环境条件可控、稳定，不受干扰，接种简单、发病快速、结果更为准确可靠，因此探索出室内人工接种赤星病菌的适宜方法，是对快捷有效的测定病原菌的致病力及筛选赤星病抗病品种，具有很好的应用价值。

接种是证病过程的重要环节，是研究赤星病病原致病性、发病规律、侵染途径、品种(材料)的抗性鉴定及控制病害等方面的有效保障，特别是在品种对烟草赤星病的抗性研究中，对所鉴定品种进行人工接菌诱发病害发生是品种抗性筛选研究不可缺少的手段和方法。目前，已报道的赤星病菌人工接种方法主要有菌丝块接种法(董汉松，曲建军，吕士恩等.烟草赤星病菌孢子萌发和侵染条件的研究山东科学1993(2)：30-35)、菌丝悬滴接种法(沈奕，高智谋，杜雷等.烟草赤星病菌苗期人工接种方法的研究安徽农业大学学报2009,36(3)：356-359)、孢子悬滴法(张世才.重庆烟草赤星病菌的致病力分化及遗传差异性研究.2009,西南大学硕士学位论文)、孢子液棉球法(成巨龙，孙渭.烟草不同发育阶段对赤星病的抗性表现与综合防治技术.植物保护学报2001,28(1):44-48)及喷雾法(焦天雷.烟草(Nicotianatabacum L.)赤星病抗性QTL的定位分析.2011,浙江大学硕士学位论文)；但在试验中发现，利用上述几种不同方法进行赤星病病菌接种时，对赤星病的发病程度影响差异很大，且出现了接菌不发病或发病不理想的问题，接种方法的不成熟会限制了病原菌与寄主互作研究工作的开展。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了烟草赤星病菌的人工接种方法。

本发明所提供的烟草赤星病菌的人工接种方法，包括如下步骤：

(1)取烟草叶片，表面经流水冲洗洁净后，取接种点，用针头刺破接种点部位的叶片，制造伤口准备接种；

(2)用注射器吸取烟草赤星病菌的分生孢子液，从所述烟草叶片正面的接种点处注入叶肉组织内，得到接种后的烟草叶片；所述分生孢子液的浓度为1×10⁵孢子/mL～1×10⁷孢子/mL；所述烟草赤星病菌的菌龄为5天～15天；

(3)将所述接种后的烟草叶片的叶基处保湿，并置于28～30℃的条件下黑暗培养8小时后，再进行12小时光照黑暗交替培养；培养7～15天。

所述步骤(1)中所述烟草叶片为烟草植株下部的成熟叶片。

所述烟草植株下部的成熟叶片为烟株下部倒数第3片叶。

所述步骤(2)中所述分生孢子液的浓度为1×10⁶孢子/mL。

所述步骤(2)中所述烟草赤星病菌的菌龄为10天或15天。

所述步骤(2)中所述接种的量为10μL。

所述步骤(3)中所述烟草叶片的叶基处保湿为用浸泡无菌水的脱脂棉球保湿，并用保鲜膜覆盖保湿。

本发明所提供的烟草赤星病菌(链格孢菌)致病性测定的室内人工接种方法，结果表明，利用赤星病菌孢子悬浮液经离体叶片伤口注射对成熟叶片进行接种，病菌的分生孢子可以直接进入叶片内，借助水分及寄主叶肉组织营养萌发、扩繁，向细胞间扩展，局部组织死亡形成的病斑会得到大面积扩大。可达到接种率高，发病程度适中的效果，这为鉴定我国烟草主产区不同赤星病菌致病性及小种差异及烟草赤星病抗性品种的筛选提供了一种简易、方便、快速、准确的人工接种方法，具有较好的应用价值。

附图说明

图1为离体叶片伤口注射法接种后10d寄主发病情况；CK：无菌水对照；A，B：供试赤星病菌孢子悬浮液接种。

图2为15d时接种叶片发病典型症状。

图3为不同接种浓度下的发病情况比较(接种后第8d)。

图4为不同叶龄的接种效果比较。

图5为不同接种方法发病情况比较；ck；a:伤口注射法；b:菌丝块法；c:孢子液悬滴法；d:孢子液棉球法；e:菌丝悬滴法。

具体实施方式

实施例1、烟草赤星病的人工接种方法

1.试验材料

1.1接种赤星病分离物及来源

供试赤星病分离物，采用文献(孙丽萍.烟草突变体抗赤星病快速高通量筛选鉴定方法研究.2013,中国农业科学院硕士学位论文.)中的赤星病分离物作为本实验的供试菌株，由本实验室保存；保存与活化菌株的培养基为马铃薯葡萄糖培养基(PDA)(方中达.植病研究法(第三版)，2007.)。

1.2供试品种

烤烟品种K326(记载过该烤烟品种K326的非专利文献是：“王树会，等.K326和云烟85不同部位烟叶挥发性成分分析，烟草科技，2005,4：35-37”)，由中国烟草总公司青州烟草研究所中国烟草核心种质库提供。

1.3接种工具及测定仪器

接种注射器为1mL医用注射器，血球计数仪测定分生孢子悬浮液浓度。

2.试验方法及结果

2.1赤星病菌培养

将低温保存的供试赤星病菌株活化后打取菌饼(d＝0.5cm)转接到PDA平板上，28℃恒温培养中培养10d，备用。

2.2接种体的制备

无菌水分别洗下培养基表面的菌体，经4层纱布过滤除去菌丝，制成分生孢子悬浮液，依据血球计数法调整其浓度为1×10⁶个/mL。

2.3烟草种植

将烤烟品种K326按照常规播种、假植并移栽至装有无菌土的花盆(Φ20cm)中，在22-28℃温室中培养，常规温室管理，待烟株生长至打顶成熟期，用于接种试验。

2.4人工接种新方法-离体叶片伤口注射法

选取烟株下部成熟叶片，即倒数第3片叶，经流水冲洗干净后，置于干净的育苗托盘中表面晾干，每个叶片取6-8个接种点(依据叶片大小)，针头刺破接种点部位叶片，即制造伤口准备接种。用注射器(去掉针头)吸取供试菌株的分生孢子液，手指抵住带有伤口的接种点叶片背面，同时从叶片正面的接种点处缓慢注入叶片叶肉组织内，接种量为10μL，对照叶片接种点注射等量无菌水。每处理2个叶片，3次重复，处理好的叶片叶基处用浸泡无菌水的脱脂棉球保湿，托盘覆盖保鲜膜保湿并置于28-30℃的人工气候室中，黑暗培养8h后，以日光灯照明，日照时数为每日12h，每日观察并及时记录发病情况。采用DPS软件进行数据分析。

2.5烟草赤星病病情指数(DSI)和病斑大小的调查

接菌后跟踪调查发病情况，人工接种后10d，跟踪记录各处理的发病率，调查病情指数和病斑大小。每个处理调查全部叶片接种点病斑，用游标卡尺直接测量病斑直径，每个接种点用十字交叉法垂直测量直径各一次，取平均值。按照调查的分级数计算病情指数。根据离体叶片人工接种的特点，根据病斑直径(D)将赤星病分级如下：0级，无病症；1级<0.2cm；0.2cm≤3级<0.5cm；0.5cm≤5级<1.0cm；1.0cm≤7级<2.0cm；9级≥2.0cm以上。

DSI＝[∑(各级病斑数×该病级数)/(最高级数×调查总病斑数)]×100

结果：

离体叶片伤口注射接种赤星病菌引发寄主发病情况：本发明探索了烟草赤星病菌致病性测定的室内人工接种新方法-离体叶片伤口注射接种法，该接种方法导致供试菌株引发寄主发病，人工接种叶片的感染症状与大田中的自然发病的相同，且在接种叶片的再分离中获得的病原菌与原接种病菌相同。6d左右开始出现坏死症状，10d时典型症状明显(图1)，有与病原菌侵染引起的叶片组织坏死，病斑周围褪绿，接种点病斑平均直径为1.24cm，发病率为100％，发病级别为5-7级，而无菌水对照未见发病，为0级；待15d时，坏死斑扩大，轮纹晕圈清晰(图2)。

2.6不同接种浓度对赤星病发病的影响

参考前人试验中采取的接种浓度，根据离体叶片鉴定的特点，试验设置3个浓度处理，分别为1×10⁵，1×10⁶,1×10⁷孢子/mL，接种方法同1.2.4，每个处理接种2个叶片，每个叶片接种点为6-8个(依据叶片大小)，3次重复；接种后第8d调查赤星病发病情况。

结果：

不同接种浓度对接种效果的影响：本试验设置的3个接种浓度，即10⁵，10⁶，10⁷孢子/mL，接种叶片后表现出不同的发病程度(图3)，3个浓度接种的接种率分别为49.60％、100％和100％，DSI分别为6.13、33.42和49.74(表1)，即浓度为10⁵孢子/mL的发病率比较低，而其它两种浓度发病率高，且发病较迅速，充分显示了病原的致病性，可以满足接种试验需要；相比之下，10⁶孢子/mL浓度接种比浓度为10⁵孢子/mL发病率高，且更易侵染寄主叶片，病情指数较高，为最佳接种浓度。

表1 不同接种浓度下的发病情况比较

      

2.7不同菌龄的病原菌接种对赤星病发病的影响

赤星病菌培养同1.2.1，分别选取培养时间为5d，10d和15d的病菌进行离体叶片伤口注射法接种。接种体制备同1.2.2，浓度均调整为1×10⁶孢子/mL，接种方法同1.2.4，每个处理接种2个叶片，每个叶片接种点为6个，接种后第10d调查赤星病发病情况。

结果：

不同培养时间对接种效果的影响：选取菌龄为5d、10d和15d的供试菌株分别配成浓度为1×10⁶孢子/mL进行离体叶片伤口注射接种，第10d观察接种效果，结果显示培养5d菌龄的接种物未能引发寄主叶片发病，而10d和15d的接种物均能成功致病，引发寄主发病，初步推断在试验浓度范围内，培养5d的菌株致病力较差，随着培养菌株菌龄增加，致病性随之增强。

2.8离体叶片伤口注射接种对不同叶龄叶片发病的影响

分别选取烟株下部叶片、中部叶片与上部叶片作为接种叶片，孢子悬浮液浓度为1×10⁶孢子/mL，接种方法同1.2.4，每处理接种2个叶片，每个叶片6-8个接种点(依据叶片大小)，接种后跟踪发病情况，并于第8d调查记录接种效果。

结果：

不同叶龄对接种效果的影响：接种后第8d调查发病情况(图4)，试验结果表明，随着叶龄的增加，发病时间缩短，下部叶片接种后5d左右开始发病，随接种时间增加至第8d，病斑扩大且周围的褪绿晕圈明显；中部叶片接种后第7d，接种点周围出现明显坏死斑，但病斑扩展缓慢，有褪绿晕圈，而上部叶片的接种点部位无坏死斑出现，个别接种点周围有褪绿的晕圈，发病不明显。

2.9离体叶片伤口注射法与其它接种方法的比较

参照文献(沈奕，高智谋，杜雷等.烟草赤星病菌苗期人工接种方法的研究安徽农业大学学报2009,36(3)：356-359)报道的菌丝块接种、孢子喷雾接种、孢子液棉球接种、孢子液悬滴接种及菌丝悬滴接种5种方法对烟草离体叶片进行接种，接种浓度为1×10⁶个/mL，供试叶片为烟株下部倒数第3-5片叶，每个处理接种3个叶片，每片叶6-8个接种点(依据叶片大小)，3次重复，同时进行离体叶片伤口注射接种；接种后第8d观察不同接种方法的接种效果及发病情况。

结果：

不同人工接种方法对寄主发病的影响：试验采用6种方法对供试病原菌进行人工接种，接种的发病情况表明，除了喷雾法未没发病外，其它5种接种方法都可导致接种体致病，但发病严重度有所别，其中伤口注射法可操作性强，利于保湿，接种后第8d调查结果显示，该接种方法可使寄主叶片产生典型的赤星病症状，发病程度可达病级5-7级(图5)，诱导发病适中，发病率为100％，病情指数为41.66％，而其它5种接种方法的发病率较低，且寄主发病程度较轻或未发病，与其它4种方法比较，差异达到显著水平(表2)。本发明所提供的“离体叶片伤口注射法”具有简单、快速接种，操作简单的特点，是很有用的接种简易方法，为进行病原致病性研究、品种抗性鉴定提供了一种良好的技术方法。

表2 不同接种方法发病情况比较

      

Claims (7)

1.烟草赤星病菌的人工接种方法，包括如下步骤：

(1)取烟草叶片，表面经流水冲洗洁净后，取接种点，用针头刺破接种点部位的叶片，制造伤口准备接种；

(2)用注射器吸取烟草赤星病菌的分生孢子液，从所述烟草叶片正面的接种点处注入叶肉组织内，得到接种后的烟草叶片；所述分生孢子液的浓度为1×10⁵孢子/mL～1×10⁷孢子/mL；所述烟草赤星病菌的菌龄为5天～15天；

(3)将所述接种后的烟草叶片的叶基处保湿，并置于28～30℃的条件下黑暗培养8小时后，再进行12小时光照黑暗交替培养；培养7～15天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述烟草叶片为烟草植株下部的成熟叶片。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述烟草植株下部的成熟叶片为烟株下部倒数第3片叶。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述分生孢子液的浓度为1×10⁶孢子/mL。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述烟草赤星病菌的菌龄为10天或15天。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述接种的量为10μL。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述烟草叶片的叶基处保湿为用浸泡无菌水的脱脂棉球保湿，并用保鲜膜覆盖保湿。