CN108359708A - 一种通过接种离体叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物抗病性鉴定和资源筛选领域，涉及一种植物根茎部病害的抗性鉴定方法，具体涉及一种利用诱导离体叶片致病方法快速鉴定植物根部病害抗性的方法，即将根茎部病害病原体接种到离体叶片或叶片切块上，诱导叶片组织感病，产生症状，通过观察不同品种的叶片在接种病原体后不同程度的发病表现，来鉴定出不同品种对此病害的抗性。与现有鉴定技术相比，本发明有益效果在于：本发明所提供的一种通过接种于离体叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法，克服了传统根茎部病害抗性鉴定的不足，鉴定周期只需8‑10天即可完成；在控制条件的环境中进行，减少环境条件所导致的差异，准确性提高；可节省大量人力物力，实现高通量、快速鉴定的目的。

Description

一种通过接种离体叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法
技术领域
本发明属于植物抗病性鉴定和资源筛选领域，涉及一种植物根茎部病害抗性鉴定方法，具体涉及一种通过接种叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法。
背景技术
植物根部病害包括植株茎基部、根部发生的病害，如根颈腐病等。这类根部病害发生后，通常通过土壤、雨水或灌溉水传播。病害一旦发生，很容易相互传染，出现大面积发病，导致重大损失，是生产中危害严重的病害。由于这些病害发生在地下部，病害发生的过程和表现症状都不容易观察，鉴定和防治都比较困难，发掘抗病基因资源，培育抗性品种是最有效的解决方法。建立精确、重复性好、快速的根部病抗性鉴定方法是筛选抗性资源的重要基础。
现有技术公开的植物根部病害抗性鉴定方法一般是采用接种鉴定法或病圃抗性鉴定。病圃抗性鉴定方法是将不同品种的植物种植于发病严重的带病菌苗圃中，观察不同品种的发病率、病情指数和对生长、品质等影响，比较不同品种对病害的敏感性和抗病性。接种鉴定法主要通过分离出的病原，通过菌丝或孢子，接种于健康苗、或成年植株上，在相同的条件下进行栽培，依据根茎部的发病率和发病程度，来鉴定植株的抗病性。鉴定的指标包括根部或根茎部发病时间、根茎部发病部位的严重程度以及植株其它症状的变化等。病圃抗性鉴定结果容易受地块菌落密度的均匀性、立地环境因素、区域等影响，不同鉴定时间的鉴定结果会出现较大的差异，这种方法还受种植面积、立地条件等的影响；同时，对大批量的材料进行抗性鉴定时也较为困难。
接种鉴定在一定程度上解决了病圃鉴定的局限性，但同属大田鉴定方法，受接种苗龄、培养环境、基质、培养条件的不同影响，误差较大,而且不容易观察植株根部病害发生的时间、进程和发病的程度，操作复杂，成本高，准确性较差。鉴定试验占地面积大，鉴定周期长，需要很多的植物材料等，试验费用较高。
因此，研发一种操作简单、快速、成本低，可用于适宜根部病抗性鉴定的方法,对于提高鉴定效率和抗性资源的筛选有重要价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足与缺陷，本发明提供一种通过接种于离体叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法，该方法操作简单、成本低、速度快、准确性高和适宜根部病抗性鉴定。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是通过如下技术实现的：将从感病植株根部病害分离的病原体接种到离体叶片上，在适宜发病的条件下，诱导叶片感病产生症状，植物品种对病原致病的敏感性可在叶片体现出来，通过观察不同品种的叶片不同程度的发病表现，来鉴定出不同品种的抗病性。
本发明所述的技术方案，具体步骤如下：
S1.病原的分离与培养：从感病植株根部病斑组织中分离发病组织，培养分离出纯化病原菌落，通过菌丝、孢子形态进行鉴定，确定病原种类；
S2.菌种的制备：将步骤S1分离保存的菌种，挑取菌丝转接培养于新的培养基上活化，并通过刮伤菌比诱导孢子产生,挑取孢子制备成一定密度的悬浮液；
S3.鉴定对象材料的制备：取苗龄相同、大小一致的植株，取新展开成熟新叶片，常为植株生长点上第二片，用有效氯为0.1％的次氯酸钠溶液进行灭菌处理，然后用无菌水清洗，将叶片置于垫有无菌吸水纸的培养皿中待用；
S4.接种：用无菌化处理后的接种针或牙签，沾取菌液或菌丝体，接种于叶表面中间位置，轻划叶表组织，用无菌水代替菌液作对照；
S5.培养条件：盖上培养皿并密封进行培养，培养条件；
S6.统计与抗病性分析：7d后，记录接种病原叶片发病情况，统计分析发病率、病情指数。
进一步地，步骤S2中所述孢子悬浮液浓度为1×105个/ml。
进一步地，步骤S5中培养相对湿度为90％-95％，温度25℃，5000lx光照，每天8-10小时。
进一步地，步骤S6中所述病情指数按如下指标分类与统计：
0级：无病斑；
1级：病斑直径小于2mm；
2级：主病斑径3-6mm；
3级：主病斑径7-12mm；
4级：多病斑相连成大病斑但小于2cm；
5级：病斑相连形成不规则大病斑，大于2cm，或病斑面积占叶片(块)1/2以上。
将统计发病数据，按如下公式计算病情指数(DI)＝(∑各级发病叶片数×病级代表值)/(统计总叶片数×病害最高代表值)。以感病最严重品种病情指数不低于60时认为试验及评价有效。
进一步地，通过病情指数进行抗病性分析，分析指标如下：
高抗或免疫(I)：病情指数为0；
抗病(R)：病情指数为0.01-0.20；
中抗(MR)：病情指数为0.21-0.40；
中感(MS)：病情指数为0.41-0.60；
感病(S)：病情指数为0.61-0.80；
高感(HS)：病情指数为0.81-1.00。
本发明原理在于，植物根部或根茎部病害一般不会在叶片表现出特征性症状，但不同植物叶对根部病害的敏感性会反映到植株或如叶片等器官上，如将根部病害病原接种到叶片上，不同品种间也会表现出不同程度的发病情况，从而可以鉴定出不同品种的抗病性，且叶部容易操作和进行症状观察。本发明的方法操作简单、成本低、准确性高，适宜白掌及天南星科植物育种研究中根部病害的抗性鉴定。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明所提供的一种通过接种叶片快速鉴定植物根部病害抗性的方法，克服了传统根部病害抗性鉴定的不足，鉴定一批次只需8-10天即可完成；在控制条件的环境中进行，对温度、湿度进行控制，减少发病条件所产生的差异，准确性提高；可节省了大量人力物力，实现了高通量、快速鉴定的目的。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
本实施例将通过接种病原体到叶片进行白掌根茎腐病抗性的鉴定。
1、供鉴定白掌品种与病原
实施例中供试材料为绒叶白掌、加尼白掌、科迪白掌、帕里斯白掌、泰绿白掌5个品。所用的根茎腐病菌(Cylindrocladiumspathiphylli)分离自感病白掌植株病斑，菌株培养保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上。
2、根茎腐病菌的培养及其分生孢子悬浮液的制备
将保存的菌株转接到新的PDA培养基上活化培养，生长形成新的菌落后用无菌刀片刮伤菌丝，诱导产生孢子，后将孢子刮下，用无菌水配制成用于接种的孢子悬浮液，孢子密度1×105个/ml。
3、不同品种白掌叶片的制备
选取株龄相同的健康植株，取第二片完全展开的成熟新叶，清水冲洗干净，吸干，用有效氯为0.1％的次氯酸钠溶液进行灭菌处理，无菌水清洗3次以上，吸干，将叶片剪成5×5㎝的小块，置于铺有无菌吸水纸培养皿中。
4、接种
用灭菌处理后的接种针或牙签，沾取菌液，轻刺叶并待菌滴沾于叶表面。或挑取菌丝，接种于叶片块中部，轻刺叶组织，盖上培养皿并密封，用无菌水同样操作处理作为对照。
5、培养
将培养皿于相对湿度为90％-95％，温度在25℃条件下，每天光照8-10小时，光照度5000lx。
6、调查植株发病情况和统计分析
7d后统计发病叶块、病斑大小、病斑数，依据调查数据进行病情指数和发病率计算，将统计发病数据按如下公式计算病情指数(DI)＝(∑各级发病叶片数×病级代表值)/(统计总叶片数×病害最高代表值)。
7、品种抗病性评价标准如下：
高抗或免疫(I)：病情指数为0；
抗病(R)：病情指数为0.01-0.20；
中抗(MR)：病情指数为0.21-0.40；
中感(MS)：病情指数为0.41-0.60；
感病(S)：病情指数为0.61-0.80；
高感(HS)：病情指数为0.81-100。
通过上述鉴定方法，鉴定结果显示，5个受鉴定品种的平均病情指数是泰绿白掌0.797，帕里斯白掌0.655，科迪白掌0.583，加尼白掌0.197，绒叶白掌0.125。可见在5个供鉴定试验材料中泰绿白掌、帕里斯白掌为感病材料，泰绿白掌接近高感，抗性水平最低；科迪白掌为中感材料；加尼白掌和绒叶白掌为抗病材料，其中绒叶白掌抗性最强。此结果与大田根茎部接种鉴定结果一致,感病指数分别是:泰绿白掌0.87，帕里斯白掌0.58，科迪白掌0.57，加尼白掌0.177，绒叶白掌0.097。

Claims (7)

1.一种通过接种于离体叶片快速鉴定植物根茎部病害抗性的方法，其特征在于，将从感病植株根部病害分离的病原体接种到离体叶片上，在适宜发病的条件下，诱导叶片感病产生症状，植物品种对病原致病的敏感性可在叶片体现出来，通过观察不同品种的叶片不同程度的发病表现，来鉴定出不同品种的抗病性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1.病原的分离与培养：从感病植株根部病斑中分离发病组织，经培养分离，形成纯化的病原菌落，通过菌丝、孢子形态进行病原鉴定，确定病菌种类；
S2.菌种的制备：将步骤S1分离的菌种，转接于新的培养基上培养活化，诱导产生孢子，挑取孢子制备成悬浮液；
S3.鉴定材料的准备：取苗龄相同、大小一致的植株，选取植株上新展开的生长完成的叶片，常为生长点的第二片生长完整叶；用有效氯为0.1％的次氯酸钠溶液进行灭菌处理，然后用无菌水清洗，将叶片或叶片切块置于垫有无菌吸水纸的培养皿中待用；
S4.接种：用无菌化处理后的接种针或牙签，沾取菌液或菌丝体，接种于中间位置的叶表面，轻划叶表组织，用无菌水代替菌液作对照；
S5.培养条件：盖上培养皿并密封，在控制条件的人工气候箱或生长箱中进行培养；
S6.统计与抗病性分析：接种7d后，记录接种病原叶片发病情况，统计分析发病率、病情指数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述孢子悬浮液浓度为1×105个/ml；所述菌丝体为已产生分子孢子的菌丝。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3所述叶片为无菌的离体的叶片或叶片切块，为初展开的新叶。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5中培养相对湿度为90％-95％，温度25℃，5000lx光照，每天8-10小时。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤S6中所述病情指数按如下指标分类与统计：
0级：无病斑；
1级：病斑直径小于2mm；
2级：主病斑径3-6mm；
3级：主病斑径7-12mm；
4级：多个病斑，相连成大病斑但小于2cm；
5级：多病斑相连成大病斑，大于2cm，或病斑面积占接种叶片(块)的1/2以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过病情指数进行抗病性分析，分析指标如下：
高抗或免疫(I)：病情指数为0；
抗病(R)：病情指数为0.01-0.2；
中抗(MR)：病情指数为0.21-0.40；
中感(MS)：病情指数为0.441-0.60；
感病(S)：病情指数为0.61-0.80；
高感(HS)：病情指数为0.81-1.00。
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