CN1709030A - 一种鉴定茄科作物青枯病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定茄科作物对青枯病抗性的方法。该抗性鉴定方法是将生理年龄一致的植株的茎或/和枝接种于青枯菌菌液中，在可控条件下培养，定期观察其发病情况并调查相关指标，作出抗性评价。所述植株为任一适于水培的茄科作物，如马铃薯，番茄，茄子，烟草等。茎或/和枝可来自于同一个植株，还可来自于遗传背景相同的不同植株，茎为主茎，枝为侧枝、主枝或次生枝。本发明不仅适用于茄科作物对青枯病的抗性鉴定和筛选，还将在茄科作物的细菌性病害的抗性筛选和鉴定，种质资源评价，特别是病菌诱导产生抗性的抗(感)病植株的快速鉴定及其幼苗的先期快速筛选等方面发挥巨大作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物对病害抗性的鉴定方法，特别涉及一种鉴定茄科作物青枯病抗性的方法。
背景技术
中国是世界上马铃薯生产量最大的国家，全国常年种植面积达470多万公顷，总产7000多万吨，约占世界的19％，亚洲的70％。但生产水平偏低，全国平均水平仅14吨/公顷，远远低于发达国家20-40吨/公顷的生产水平。影响马铃薯产量的因素很多，如品种、品种质量、生产投入、耕作制度等。其中，细菌和真菌病害是影响马铃薯产量的重要因素。多年来，国内外科学家投入大量的人力物力致力于马铃薯品种的改良及其病虫害防治，并取得了一定的成效。
马铃薯青枯病是由青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是仅次于马铃薯晚疫病的一种细菌性病害，可侵害马铃薯、番茄等数百种植物。青枯病是一种维管束病害，典型症状是叶片、分枝或植株出现急性萎蔫，枝叶未等发黄，青枝绿叶即萎蔫枯死。其致病机理主要是通过胞外多糖等大分子阻碍植物导管内水分的运输，从而引起萎蔫症状；一些胞外酶，如果胶酶类、纤维素酶类等在致病过程中也起到一定的作用。该病害可通过土壤、灌溉、植株、种薯等进行传播，寄主范围广，并随着气候变化、土壤类型、地理位置和耕作方式的不同而变化，造成不同程度的减产，严重时可使马铃薯减产80％，甚至绝产(He liyuan.Characterization of Pseudomonassolanacearum from China.Pl.Dis.，1987，67：1357-1362)。该病害在我国长江流域及其以南的西南单双季混作区、南方和中原二季作地区马铃薯生产为害很大，并且由于青枯病菌的寄主不断增加，且防治技术有限，导致该病已成为目前危害许多栽培植物的最严重病害之一。
提高马铃薯抗性，培育抗病品种是防治马铃薯青枯病的重要方法，目前国内外研究已取得一定的进展。现已发现马铃薯二倍体野生种、原始栽培种、四倍体野生种及四倍体栽培种等很多材料具有对青枯病不同程度的抗性和耐性。屈冬玉等利用产生2n配子的材料进行4x-2x有性多倍化，筛选出了既能高频率产生2n配子又具有青枯病抗性的二倍体种质，并利用2n配子将Solanum phureja的抗青枯病基因转移到四倍体栽培种中，获得了MS42.3×CD1045，AVRDC1287×ED1022，B927017×CD1045，W2×D-2-1等一批高抗青枯病的四倍体组合及后代材料(Qu Dongyu.Use of unreduced gametesof potato for TPS production through 4x-2x crosses：〔dissertation〕.Wageningen：Wageningen Agricultural University，1996.38-46)；何礼远等利用Mira与自国际马铃薯中心(CIP)引进材料中的377852.2和800928组配杂交组合，从中筛选出了895010和898006两个抗病高产的优良品系；南方马铃薯研究中心也从中筛选出了800935、385233-3、388193-21等14份抗病材料。但如何评价、特别是先期评价所培育出的马铃薯品系(种)的抗病性强弱仍是进行马铃薯抗病育种的重要环节。
目前进行马铃薯抗青枯病种质资源的鉴定方法主要分为室内鉴定和田间鉴定。室内鉴定可为田间鉴定提供参考，具有一定的优越性：可人工控制生长环境条件，进行工厂化作业和管理，保持条件的一致性，不易受外界因素干扰；可对育种研究初期获得的杂交后代，或无性系的试管苗等进行早期大量鉴定和筛选；也可对育成的优良材料在标准化条件下，采用多个菌系(小种或致病型)和不同菌量接种，进行抗病性鉴定和评价。目前进行马铃薯抗青枯病鉴定所采用的接种方法主要有灌根法(伤根灌注法、不伤根灌注法)和茎部毛细管菌液滴注法(即茎部刺伤微吸管滴注接种法)，另外还有水培法等(李乃坚，黄爱兴，袁四清，王得元.茄科作物抗青枯病水培法鉴定研究II.液体培养青枯菌的致病力.广东农业科学，2000年第3期，38-40)。这些方法各有优、缺点。研究表明：接种方法对抗性有显著的影响，如伤根接种跟不伤根接种相比，对于抗性主要表现为抗侵入的植株，伤根法则难以真实反映材料的自然抗性(Perera K D A，Hartman G L，Poulos J M.Introduction procedures and theevaluation of peppers for resistance to P.solanacearum.Bacterial Wilt.TheAustralian Center for International Agricultural Research，1992，193-198.)；而对于诱导产生抗性的植株二者则没有明显差别。此外灌根法周期长、操作繁琐、费时费力，同时伤根灌注也存在因伤根程度不同带来的人为误差。茎部毛细管菌液滴注法同样也存在因作物茎杆粗细不同导致接种时伤害程度不同的问题，且操作不便。水培法则需要专用设备和一定浓度的营养液进行作物与菌液的共培养，成本较高，但该方法却能保持所鉴定植株的生理年龄的基本一致性。鉴于上述方法的不足，迫切需要一种更为经济有效、快速简便的茄科作物(特别是马铃薯)抗病鉴定新方法，以更好的进行抗病种质资源评价及进行快速准确的筛选和鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便实用的鉴定茄科作物对青枯病菌抗性的方法。
本发明所提供的鉴定茄科作物对青枯病菌抗性的方法，是将生理年龄一致的植株的茎或/和枝接种于青枯病菌菌液中，在可控条件下培养，定期观察其发病情况并调查相关指标，作出抗性评价。
在上述鉴定方法中，青枯菌菌液浓度的选择是较宽的，如可以是1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL等，可根据待测植株品种及实际需要进行选择。如当待测植株为马铃薯时，菌液浓度优选为1×106cfu/mL；当待测植株为番茄时，菌液浓度优选为1×104cfu/mL。
可控培养条件为待测植株品种或品系对青枯菌的最适发病条件。如鉴定马铃薯对青枯病菌小种3号P041的抗性时，可控培养条件优选为：在26-28℃可控温室内，空气相对湿度大于70％下培养；当鉴定番茄对青枯病菌小种1号TM60的抗性时，可控培养条件优选为：在28-32℃可控温室内，空气相对湿度大于70％下培养。
所述植株可为任一易于水培的马铃薯，番茄，茄子，烟草等茄科作物，优选为马铃薯。所述植株可为大田生长的植株，组培幼苗或小气候环境下的植株(开放环境下的盆栽植株和温室内盆栽植株)。
所述茎或/和枝可来自于同一个植株，还可来自于遗传背景相同的不同植株，茎为主茎，枝为侧枝、主枝或次生枝。
将茎或/和枝接种于菌液中的方法为：从生长正常、旺盛、整齐、无病虫害的待测植株上切取茎、枝，首先存放于自来水或无菌水(优选)中保湿，待取完全部所需的茎、枝后，同时插入青枯菌菌液中浸泡培养。
可按下述方法对青枯菌进行培养并对菌液的浓度进行调整：挑取致病力强的单菌落画线，于28℃斜面培养24～48小时后，转接至培养平板中，在相同温度下继续培养12～24小时，待长至菌台后，用无菌蒸馏水将其洗下，通过测定菌液OD600的吸光值，用无菌水调整菌液的浓度，如1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL等。
培养过程中定期观察植株的发病情况，逐个材料或逐株(枝)详细记载发病期和严重度，以发病高峰期且最能反映抗(感)病性差异的调查记载数据为依据作出抗病性评价。
可参照下述方法对植株的青枯病抗病性进行评价：
1)供试材料接种后，从第二天开始持续观察发病情况，以发病高峰期且最能反应抗、感病差异的调查记载数据，参照传统方法(孙惠生.马铃薯育种学.中国农业出版社.2003，238.)，将植株的发病严重度分为以下5级：
1级：无症状，健康；
2级：1-2个叶片萎蔫；
3级：3-4个叶片萎蔫；
4级：全部叶片萎蔫；
5级：茎枝死亡。
根据抗病级别对植株材料作出抗病性评价，这也是利用该方法进行植株抗病鉴定的主要依据。
2)测定接种后第10天浸泡有植株茎枝的青枯菌菌液的OD600吸光值，然后根据该值对植株的青枯病抗病性进行初步判断，OD600吸光值的高低与植株的抗病呈负相关，吸光值越高植株越感病。
3)观察浸泡部位的瘤状乳突数量，抗性越强，所形成的瘤状乳突数量越多。
浸泡菌液的OD600吸光值大小及浸泡部位所形成的瘤状乳突数量的多少均作为参考依据，可对植株抗病性作出初步评价。在实际操作中，可综合上述三种方法对植株的抗病性作出综合评价。
本发明提供了一种茄科作物对青枯病抗性鉴定的新方法，取名为“茎枝菌液浸泡法”。该方法是在综合传统作物抗病鉴定方法，并结合作物无土栽培的水培法的基础上，发明的一种茄科作物对青枯病抗性鉴定新方法。该方法较传统的灌根法、茎部毛细管菌液滴注法等具有以下优点：①简单易行：只需将生理年龄一致的不同植株的茎、枝或同一植株的主茎和侧枝剪下浸泡在含有一定浓度的菌液中即可，不需将所有植株进行伤根浸染，保证了实验试材生理年龄的一致性，也增加了鉴定的准确性。②可操作性更强，更加经济：可通过去掉植株顶芽使其产生大量侧枝的方法获得足够数量的茎、枝，无需培养大量植株，降低了工作量，同时也保证了所取茎枝生理年龄的一致性；同一个容器内可浸泡多个植株的茎枝，节省了空间，有利于控制发病条件，更加便于管理，也有利于对大量不同的材料进行鉴定；可通过改变浸泡菌液的浓度人为控制发病的速度，节省时间，降低能耗。③鉴定结果的一致性更强、重复性更高：由于对每一个茎、枝在菌液浸泡前均经过同样的锋利刀片的垂直切割，所受到的伤害基本一致，避免了伤根灌注法因伤根程度不同和毛细管滴注法对不同粗细的植株茎所造成的伤害程度不同的弊端及由此引起的植株抗感表现的差异，同时浸泡所用菌液均匀一致，减少其他条件的干扰，保证了鉴定结果的一致性和可重复性；并且同一植株的多个茎枝可同时进行鉴定，增加了单株鉴定的准确性，这对于无性繁殖的作物具有重要意义。④适用对象更广：大田生长的植株，组培幼苗，小气候环境下的植株(开放环境下的盆栽植株和温室内盆栽植株)，植株的主枝和次生枝等，同时对所要鉴定的群体大小没有严格的限制，只要每个基因型的植株茎枝能够满足5个以上即可。⑤适用范围更宽：能够进行水培的植物均可使用该方法进行(快速)抗病性鉴定。⑥可人为控制发病时间的早晚：增加所使用菌液的浓度，可进行植株抗病性的快速鉴定；降低浸泡菌液的浓度，则可推迟发病时间，按照传统的调查方法进行调查后，确定植株的抗病级别。⑦鉴定后的植株可直接利用：由于用于鉴定的是植株的茎枝，所剩余的植株没有接触病菌，因此可直接进行利用，而用灌根法和毛细管法鉴定后的植株因直接接触了菌液则不能直接利用，因此，茎枝菌液浸泡法对于珍贵稀有的植株材料的鉴定、保存和繁殖具有重要意义。本发明不仅适用于茄科作物对青枯病的抗性鉴定和筛选，还将在茄科作物的细菌性病害的抗性筛选和鉴定，种质资源评价，特别是病菌诱导产生抗性的抗(感)病植株的快速鉴定及其幼苗的先期快速筛选等方面发挥巨大作用。
附图说明
图1为茎、枝菌液浸泡法流程示意图
图2A-图2C为不同抗病性的马铃薯植株茎、枝经青枯菌菌液浸泡后形成的瘤状突起
图3为不同接种方法接种马铃薯的结果对比
图4接种于不同菌液浓度下的抗病番茄393浸泡培养10天后的生根表现
图5为抗病番茄在不同接菌浓度下浸泡培养14天后的抗病表现
图6抗病性不同的番茄接菌后14天的抗病表现
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、马铃薯对青枯病菌小种3号(P041)的抗性鉴定
供试青枯病菌株：
青枯病菌小种3号P041，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室提供。
供试植物材料：
马铃薯抗病植株和感病植株，来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所马铃薯组，其遗传背景参见文献(Qu Dongyu.Use of unreduced gametes of potato for TPSproduction through 4x-2x crosses：(dissertation).Wageningen：WageningenAgricultural University，1996.38-46)，抗病对照植株(MS42.3)源自国际马铃薯中心(CIP)。
参照图1进行马铃薯对青枯病菌小种3号(P041)的抗性鉴定，具体方法如下：
一、青枯病菌的培养及菌液浓度的调整
挑取致病力强的青枯病菌单菌落进行画线培养，待长至菌台后，用无菌蒸馏水将其洗下，分光光度计测定其OD600的光吸收值，并调整菌液浓度分别为1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL备用。
二、用本发明的方法进行抗性鉴定
采用“茎枝菌液浸泡法”进行接种，具体方法为：取生长正常、旺盛、整齐、无病虫害的块茎繁殖的不同基因型(见表1)的马铃薯植株，待其长至7-8片展叶时，去除主茎顶芽，促使侧芽继续生长至5-6片展叶时，用手术刀片切取带有4-5片展叶的主茎或侧枝，首先存放于自来水中保湿，待取完全部所需的主茎或侧枝后，同时插入盛有不同浓度(1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL)的青枯病菌小种3号菌液(该菌液为菌的水溶液，水为无菌水。)的容器内进行浸泡，做好详细标记，并于浸泡后第3、5、7、10、14天调查发病情况，同时测定第10天浸泡菌液的OD600光密度值。同时，采用灌根法和毛细管菌液滴注法进行接菌作为对照，所使用的菌液浓度为1×108cfu/mL，灌根法所使用的器具、土壤等均进行相应的消毒灭菌处理，其菌液接种量为30mL，毛细管菌液滴注法接种量为30μL。接种后的马铃薯植株培养在26-28℃可控温室内，空气相对湿度为70％以上，灌根法的土壤湿度约为土壤最大持水量的60％。
采用本发明的方法接菌后植株的发病情况如表1所示，以菌液浓度为1×106cfu/mL为例，接菌后第3天，感病植株的茎枝开始出现萎蔫，第4天萎蔫程度明显加重，个别高感植株的茎枝已大部分萎蔫，第5天高感植株的茎枝已全部萎蔫，高抗植株的茎枝也出现萎蔫症状，第7天抗病植株的茎枝萎蔫程度明显加重，高抗植株的茎枝萎蔫程度基本不变；第10天高抗植株茎枝萎蔫症状减轻，有的已基本恢复健康，而感病植株的茎枝则腐烂死亡；第14天高抗植株的茎枝已恢复健康，个别的已开始生根。抗感植株茎、枝的发病程度与浸泡菌液的浓度和浸泡时间呈高度相关，浸泡时间越长、菌液浓度越高，发病越快，这对于研究者要求植株尽早发病，确定准确的取材时期至关重要，但试验中不同浓度的浸泡菌液浸泡植株茎枝所得的抗、感结果一致，因此该方法对于种质资源的抗病筛选、资源评价和抗病锻炼具有重要的指导意义。同时在试验中还发现抗病植株主枝浸泡菌液后，在其受菌液浸泡部位形成了一些瘤状乳突结构，抗性级别越高的植株茎、枝所形成的瘤状乳突结构越多，如图2A-图2C所示，且浸泡菌液变得澄清；而在感病植株的茎枝上未发现有瘤状乳突结构的形成，且其浸泡菌液的末端发生褐变，浸泡菌液变得混浊。测定菌液OD600光密度值，结果表明随着植株感病程度的增加，浸泡其茎、枝的菌液OD600吸光值也逐步升高，这可能是由于抗病植株所产生的瘤状乳突或茎枝本身能够释放一种抑菌物质所致，Yuan等(Yuan F H，He L Y.An anti-Ralstonia solanacearum protein form and its immunogoldlocalization in vivo.Bacterial wilt Disease.Germany Springer Press.1998，209~217.)从马铃薯近缘栽培种Solanum phureja的杂交后代中分离纯化了抗青枯病菌蛋白AP1，该AP1蛋白对5种源自马铃薯和其它作物的青枯菌系及源自马铃薯的2种真菌病原均具有较好的抑菌活性，同时该基因的原核表达产物具有与源自马铃薯的AP1蛋白同样的抑菌活性(冯洁，何礼远，袁凤华.马铃薯32kD抗菌蛋白的cDNA分子克隆研究.农业生物技术学报，1999，7(1)：37-40.；Feng J，Yuan F，Gao Y，LiangC，Xu J，Zhang C，He L.A novel antimicrobial protein isolated from potato(Solanum tuberosum)shares homology with an acid phosphatase.Biochem J.2003，376(2)：481-487)，并且转AP1蛋白编码基因的马铃薯和烟草植株对青枯病菌具有不同程度的抗性(梁成罡，何礼远.抗菌蛋白AP1编码基因对马铃薯的转化及其介导的青枯病抗性研究.植物保护学报，2002，29(1)：51～56.)。因此根据植株茎枝经菌液浸泡后所形成的瘤状乳突结构的有无、多少及浸泡菌液OD600光密度值的大小可以对相应植株的抗病性进行初步判定。
表1 不同接菌浓度下3次鉴定马铃薯茎枝的综合发病情况(部分结果)
| 接菌浓度 | 基因型 | 抗性 | 发病严重度 | ||||
| 接菌后3天 | 接菌后5天 | 接菌后7天 | 接菌后10天 | 接菌后14天 | |||
| rep1 rep2 rep3 | rep1 rep2 rep3 | rep1 rep2 rep3 | rep1 rep2 rep3 | rep1 rep2 rep3 | |||
| 105106107 | MS423EED11ED13ED25MS42.3EED11ED13ED25MS42.3EED11ED13ED25 | RMRSRSRMRSRSRMRSRS | 1 1 11 1 12 2 21 1 12 3 21 1 11 2 12 3 21 1 13 3 31 1 12 2 23 3 31 1 13 3 3 | 2 1 23 2 23 4 31 2 13 4 32 2 22 3 33 4 32 2 24 4 42 3 24 3 34 4 42 2 24 4 4 | 1 2 24 4 44 4 41 1 24 4 42 2 24 5 44 5 41 2 25 4 42 2 25 4 44 5 42 2 25 5 5 | 1 2 14 5 55 5 51 1 15 5 52 1 25 5 55 5 51 2 15 5 51 2 25 5 55 5 51 2 25 5 5 | 1 1 15 5 55 5 51 1 15 5 51 1 1a5 5 55 5 51 1 1a5 5 51 1 1b5 5 55 5 51 1 1b5 5 5 |
1：健康 2：1-2个叶片萎蔫 3：3-4个叶片萎蔫 4：全部叶片萎蔫 5：茎枝死亡
a茎枝恢复健康，但有少数老叶死亡 b茎枝恢复健康，但有部分老叶死亡
三、茎枝菌液浸泡法与灌根法、毛细管菌液滴注法鉴定结果的比较
多年实践证明，灌根法及毛细管菌液滴注法对于马铃薯抗病性的筛选和评价是有效的，但这些方法所需时间较长，特别是灌根法需要3周时间，无疑会加大资源评价的成本，从三种方法的比较中发现：茎枝菌液浸泡法同灌根法及毛细管菌液滴注法的评价结果是一致的，如图3所示(图中A-D为茎枝菌液浸泡法接种；E-H为茎部毛细管菌液滴注法接种；I-L为伤根灌注法接种；竖排为相应基因型不同接种方法的抗病表现)。同时试验中还发现茎枝菌液浸泡法接种后，植株茎枝抗病表现的变异范围小于伤根灌注法和毛细管滴注法(表2)，这可能是由于茎枝菌液浸泡接种法接种时茎枝所受伤害基本一致，避免了伤根灌注法伤根程度不同和毛细管滴注法对不同粗细的植株茎枝所造成的伤害程度不同等引起的植株抗感表现的差异所致。采用茎枝菌液浸泡法时，不同的浸泡菌液浓度之间存在茎枝发病早晚的差异，菌液浓度与发病早晚存在高度相关，菌液浓度越高，茎枝发病越早。这对于要求待评价植株快速发病，研究植株抗病基因表达及植病互作具有重要意义。对于马铃薯而言，浸泡菌液的浓度以1×106cfu/mL为宜，以第4或第5天调查结果为标准进行评价。若提高浸泡菌液的浓度，则适当提前调查时间。
表2 三种接种方法接菌后马铃薯(茎枝)的发病情况(部分结果)
| 基因型 | 株(茎枝)抗性及总数 | 灌根法接菌后10天(108cfu/mL) | 毛细管法接菌后7天(108cfu/mL) | 茎枝菌液浸泡法接菌后5天(106cfu/mL) | |||
| 平均值 | 变异范围 | 平均值 | 变异范围 | 平均值 | 变异范围 | ||
| MS42.3EED11ED13ED25 | R 60MR 76S 55R 82S 83 | 2.003.333.931.834.35 | 1-32-43-51-43-5 | 1.923.333.652.564.00 | 1-42-43-52-43-5 | 1.932.833.361.914.11 | 1-22-33-41-24-5 |
实施例2、番茄对青枯病菌小种1号TM60的抗性筛选与鉴定
供试青枯病菌株：
青枯病菌小种1号TM60，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所植保室提供。
供试植物材料：
番茄抗病植株和感病植株，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄组提供。
参照图1进行番茄对青枯病菌小种1号TM60的抗性鉴定，具体方法如下：
一、青枯病菌的培养及菌液浓度的调整
挑取致病力强的青枯病菌单菌落进行画线培养，待长至菌台后，用无菌水将其洗下，用分光光度计测定其OD600的吸光值，调整菌液浓度分别为1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL，备用。
二、用本发明的方法进行抗性鉴定
采用“茎枝菌液浸泡法”进行接种，具体步骤与实施例1相同，同时采用灌根法接菌作为对照，所使用的菌液浓度为1×108cfu/mL，灌根法所使用的器具、土壤等均进行相应的消毒灭菌处理，其菌液接种量为30mL。接种后的番茄植株培养在28-32℃可控温室内，空气相对湿度为70％以上，灌根法的土壤湿度约为土壤最大持水量的60％。
采用本发明的方法接菌后番茄植株的发病情况如表3所示，以菌液浓度为1×104cfu/mL为例，接菌后第3天，高感植株的茎枝萎蔫程度已达3级，抗病植株的茎枝则刚开始有症状；第5天时，高感植株的茎枝已经全部萎蔫，抗病植株的茎枝萎蔫程度加重；第7天时抗病植株的茎枝的萎蔫症状有所缓解，而感病植株的茎枝已部分死亡。第10天时高抗植株的茎枝已经开始恢复健康，仍然存活的感病植株茎枝的萎蔫症状也有所缓解；到第14天时，高抗植株的茎枝已恢复健康，仍然存活的感病植株的茎枝也基本恢复正常。其中，抗病番茄品种393茎、枝浸泡于1×103、1×104、1×105cfu/mL菌液后10天抗病表现如图4所示，抗病番茄品种393茎、枝浸泡于0、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL菌液后14天抗病表现如图5所示，抗病性不同番茄植株茎、枝浸泡于1×105cfu/mL菌液后14天抗病表现如图6所示(D3、D14、D5为感病植株，393、395、419为抗病植株)，表明当植株受病菌浸染后，感病植株因不含有抗病因子，无法抵御病菌的浸染而发病，甚至死亡；而抗病植株由于含有抗病因子，病菌的浸染刺激，激活了其体内抗病基因的表达，抗病基因的表达产物对病菌在植株体内的存活和扩散具有一定的抑制作用，二者经过一段时间的互作，虽然高抗植株最初也表现出感病，但最终仍能恢复健康，这与前人的分析是一致的(Vasse J et al.Microscopic studies of intercellular infection and protoxylem invasion oftomato rests by Pseudomonas solanacearum.MPMI.1995，8：241-251.)。如果接菌浓度太高，抗病基因的表达不足以抑制病菌在植株体内的存活和扩散，抗病植株仍然会像感病植株那样感病后无法恢复而最终死亡。
表3 不同菌液浓度、不同基因型番茄茎枝的发病程度(部分结果)
| 接菌浓度 | 基因型 | 抗性 | 发病严重度 | ||||
| 接菌后3天 | 接菌后5天 | 接菌后7天 | 接菌后10天 | 接菌后14天 | |||
| 103104 | D3D5D14393395419D3D5D14393395 | SSSRRRSSSRR | 22211132322 | 22211144422 | 1111(开始生根)1(开始生根)1(开始生根)4(部分死亡)4(部分死亡)4(部分死亡)11 | 1(开始生根)1(开始生根)1(开始生根)3331(开始生根)1(开始生根) | 11111 |
| 105106107 | 419D3D5D14393395419D3D5D14393395419D3D5D14393395419 | RSSSRRRSSSRRRSSSRRR | 2334322444334444434 | 35454335554445554(部分死亡)44(大部分死亡) | 2-5-434---434(部分叶片死亡)---34(部分死亡)4 | 1---113(部分叶片死亡)---223---334 | 1(开始生根)---1(开始生根)1(开始生根)2---112---223 |
三、茎、枝菌液浸泡法与灌根法鉴定结果的的比较
茎、枝菌液浸泡法同灌根法对于番茄的评价结果是一致的；采用茎枝菌液浸泡法时，不同的浸泡菌液浓度之间也存在茎枝发病早晚的差异，菌液浓度与发病早晚同样存在高度相关，菌液浓度越高，茎枝发病越早。对于番茄而言，浸泡菌液的浓度以1×104cfu/mL为宜，以第5-7天调查结果为标准进行评价，若要获得高抗植株，则可适当提高菌液浓度(如1×105cfu/mL)，根据接菌后14天植株的茎枝是否可以恢复正常进行筛选。
Claims (10)
1、一种鉴定茄科作物对青枯病抗性的方法，是将生理年龄一致的植株的茎或/和枝接种于青枯菌菌液中，在可控条件下培养，定期观察其发病情况并调查相关指标，作出抗性评价。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述青枯菌菌液的浓度为1×102-1×108cfu/mL。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述植株为马铃薯时，菌液浓度为1×106cfu/mL；植株为番茄时，菌液浓度为1×104cfu/mL。
4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述可控培养条件为待测植株品种或品系对青枯菌的最适发病条件。
5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述鉴定马铃薯对青枯病菌小种3号P041的抗性时，可控培养条件为：在26-28℃可控温室内，空气相对湿度大于70％下培养；鉴定番茄对青枯病菌小种1号TM60抗性时，可控培养条件为：在28-32℃可控温室内，空气相对湿度大于70％下培养。
6、根据权利要求1或2所述的抗性鉴定方法，其特征在于：所述植株品种为马铃薯，番茄，茄子，烟草；所述植株为大田生长的植株，组培幼苗或小气候环境下的植株。
7、根据权利要求1或2所述的抗性鉴定方法，其特征在于：所述茎或/和枝来自于同一个植株或来自于遗传背景相同的不同植株。
8、根据权利要求1或2所述的抗性鉴定方法，其特征在于：所述茎为主茎，枝为侧枝、主枝或次生枝。
9、根据权利要求1或2所述的抗性鉴定方法，其特征在于：所述将茎或/和枝接种于菌液中的方法为：从生长正常、旺盛、整齐、无病虫害的待测植株上切取茎或/和枝，首先存放于水中保湿，待取完全部所需的茎或/和枝后，同时插入青枯菌菌液中浸泡培养。
10、根据权利要求1或2所述的抗性鉴定方法，其特征在于：所述抗性评价是采用传统方法，测定培养液OD600吸光值，和/或浸泡部位的瘤状乳突数量的方法进行的。
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