CN104694618A

CN104694618A - 一种棉花黄萎病抗病性的检测方法

Info

Publication number: CN104694618A
Application number: CN201510111867.9A
Authority: CN
Inventors: 王振宇; 范森淼; 桑素玲; 崔小伟; 李绍建; 王娜; 高蒙
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明公开了一种棉花黄萎病抗病性的检测方法，包括将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后棉苗中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性，并根据棉苗中几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。本发明的检测方法，通过将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性来判断棉花黄萎病抗病性，该方法无需等待棉苗发病，即可在育苗阶段快速、准确的获知棉花黄萎病抗病性；可根据该方法的检测结果移栽抗病或耐病性好的植株，经过田间发病情况验证筛选，进而得到抗病的棉花植株和品系；该检测方法便于从育苗阶段得到抗病或耐病性好的单株和材料，直接进行丰产和品质育种，加快可品种选育进程，适合推广应用。

Description

一种棉花黄萎病抗病性的检测方法

技术领域

本发明属于棉花抗病性检测技术领域，具体涉及一种棉花黄萎病抗病性的检测方法。

背景技术

黄萎病是一种毁灭性土传维管束病害，可侵染多种草本作物、木本作物、花卉及木本观赏植物。棉花黄萎病是世界性的棉花重要病害之一，一般在幼苗期几乎不会出现，生长中后期棉花现蕾后田间大量发病，容易导致整个植株枯死或萎蔫。棉花黄萎病的病原为大丽花轮枝菌和黑白轮枝菌，由于其致病因子种类繁多，变异较快，抗病遗传规律又尚未明确，因此选育抗病品种是防治棉花黄萎病最经济有效的措施之一，棉花黄萎病抗病品种(系)对棉花品种的产量和品质具有很大的影响。在棉花黄萎病研究及选育抗病品种的过程中，黄萎病抗性鉴定是病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制抗病种质筛选、抗病品种(系)选育等研究工作的重要基础，

目前，较常用的棉花黄萎病抗病性的检测鉴定方法主要是人工病圃或自然重病田进行成株期鉴定，该方法主要依赖于植株发病情况进行鉴定，接近生产实际，可对棉花黄萎病进行全程检测，是棉花品种从区域试验走向生产、对黄萎病抗性进行把关鉴定的最准确有效的方法。但是，棉花成株期检测鉴定所需时间长和占据空间多，不适合大批量材料的抗黄萎病筛选工作，且受到土壤菌量、温度、湿度等多种环境条件的影响和季节的限制，稳定性和重复性较差。如何在快速、准确的对棉花黄萎病抗病性进行苗期检测鉴定，是急需解决的问题；通过对棉花黄萎病抗病性的检测，可进行科学快速的棉花育种，进而获得对黄萎病具有高抗病性的棉花新品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、准确的棉花黄萎病抗病性的检测方法，无需等待棉苗发病，即可判断棉花黄萎病抗病性。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种棉花黄萎病抗病性的检测方法，包括将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性，并根据棉苗中几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。

根据棉苗中几丁质酶(CHI)活性和/或葡聚糖酶(GLU)活性判断棉花黄萎病抗病性是指根据几丁质酶酶活力单位和/或葡聚糖酶酶活力单位的量判断棉花黄萎病抗病性。

所述几丁质酶酶活力单位，是以样品中每毫克蛋白中1min内由CHI(几丁质酶，chitinase)催化反应生成的N-乙酰氨基葡萄糖量(N-乙酰葡萄糖胺)定义为一个酶活力单位。所述葡聚糖酶酶活力单位，是以每分钟水解β-葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活力单位。

所述棉花黄萎病抗病性的判断标准为：

几丁质酶酶活力单位>36.1，和/或葡聚糖酶酶活力单位>90.8，为免疫材料；

几丁质酶酶活力单位为32.2～36.1，和/或葡聚糖酶酶活力单位为78.3～90.8，为高抗材料；

几丁质酶酶活力单位为28.7～32.1，和/或葡聚糖酶酶活力单位为67.3～78.2，为抗病材料；

几丁质酶酶活力单位为25.9～28.6，和/或葡聚糖酶酶活力单位为58.0～67.2，为耐病材料；

几丁质酶酶活力单位为24.7～25.8，和/或葡聚糖酶酶活力单位为53.9～57.9，为易感材料；

几丁质酶酶活力单位为<24.7，和/或葡聚糖酶酶活力单位为<53.9，为感病材料。

所述酶活力单位的结果数值保留一位小数。

所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材料、感病材料的棉花黄萎病抗病性依次降低。除感病材料以外，所述免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料、易感材料在生产上可以应用；但用于品种选育时，选择划分为耐病材料及以上的指标范围(免疫材料、高抗材料、抗病材料、耐病材料)。

所述的判断标准中，为减少操作和节约成本，可单独检测几丁质酶活性或葡聚糖酶活性进行初步判断，检测结果达耐病等级以下指标时，不再进行另一指标检测；检测结果达抗性水平以上时，再增加另一检测指标，优选两项指标同时达标才最终判定其相应等级。

对于同一种检测对象，当几丁质酶活性与葡聚糖酶活性的检测结果对应不同的材料等级时，以相对较低的等级作为该材料的对应等级。即两项指标的检测结果出现冲突时，本着从严从重的原则，以相对较低等级判定所检测材料的对应等级。

优选的，所述检测方法中，检测接种后棉苗叶片中的几丁质酶活性和葡聚糖酶活性，并根据棉苗中几丁质酶活性和葡聚糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。

所述接种方法为伤根蘸菌液法，包括将棉苗主根剪掉1～3cm后，将棉苗的剪切伤口浸入黄萎病病菌菌液中7～10s进行接种。

所述伤根蘸菌液法在室内进行，对棉苗无损害，植株成活率高，接种方便快捷；后期黄萎病发病较快速、稳定和明显。

所述接种是当棉苗长至两片真叶完全展开时进行接种。

所述棉苗是由以下方法制备的：取棉籽，在育苗穴盘内进行单粒播种后，覆盖灭菌后的基质至基质层厚1cm，再盖土至土层厚为2cm；出苗期间保证水分充足；出苗后，控制环境昼夜温度为25～30℃。

育苗所用的棉籽，选择颗粒饱满均匀、适宜当地的自然条件、质量达到国家标准的优良种子。

接种时，将育苗穴盘取出，从穴盘下面直接将外露的主根剪切1-3cm再进行接种操作。

所述育苗穴盘中单穴直径3cm、高3cm。

所述基质为草炭土。使用草炭土便于棉苗的健壮生长，和接种后方便带土移栽(容易抱团)；草炭土高压灭菌后备用。

所述黄萎病病菌为中等致病力黄萎病病原菌。

所述黄萎病病菌为黄萎病病菌VD-1。

所述黄萎病病菌菌液中，黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml。

所述黄萎病病菌菌液是由以下方法制备的：将黄萎病病菌接种至PDA固体培养基，培养3～7天后转入PDA液体培养基中培养，至菌液中黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml，4℃冷藏备用。

所述PDA固体培养基中，马铃薯、葡萄糖、琼脂与水的质量比为200:10～20:17～20:1000。

所述PDA液体培养基中，马铃薯、葡萄糖与水的质量比为200:10～20:1000。

PDA培养基对于棉花黄萎病病菌VD-1菌种的生长和孢子的繁殖具有十分快速有效的作用。

接种后的棉苗继续育苗，接种后72h时进行几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性检测。

所述检测是检测棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性。

所述几丁质酶活性的检测方法为Reissing法。

所述Reissing法包括下列步骤：

a)酶样制备：取待测植物叶片，加入提取液中进行提取后，离心得上清液A，即为粗酶提取液，备用；

b)酶样测定：取步骤a)所得粗酶提取液，与缓冲液、胶体几丁质溶液混合进行反应，后进行离心，得上清液B；在上清液B中加入蜗牛酶溶液继续反应，后进行离心，得上清液C；在上清液C中加入饱和硼砂溶液，体系呈黄色，经沸水浴后冷却，向体系中加入冰醋酸和二甲基胺硼烷(DMAB)溶液，水浴保温处理后，得红色溶液；

c)取步骤b)所得红色溶液，在585nm处测定该溶液的吸光值，并根据N-乙酰葡萄糖胺标准曲线计算得几丁质酶活性。

几丁质酶活性表示为样品每毫克蛋白中1min内由CHI催化反应生成的N-乙酰氨基葡萄糖量(N-乙酰葡萄糖胺)。

所述Reissing法中，步骤a)所述提取液为醋酸；步骤b)所述缓冲液为醋酸。

所述葡聚糖酶活性的检测方法为葡聚糖底物法。

所述葡聚糖底物法包括下列步骤：

i)酶样制备：取待测植物叶片，加入缓冲液中，研磨匀浆，离心后将所得上清液透析过夜，得底物溶液；

ii)酶样测定：向步骤1)所得底物溶液中加入酶稀释液进行反应后，再加入DNS试剂，经沸水煮后冷却，定容，在540nm处测OD值，并根据葡萄糖标准曲线计算葡萄糖的含量，以每分钟水解β-葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活力单位，计算得酶活力单位。

所述葡聚糖底物法中，步骤i)所述缓冲液为乙酸钠溶液。步骤ii)所述酶稀释液为pH值为5.6、乙酸钠浓度为0.05mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液。

棉苗接种后一周开始出现发病症状，10～15天普遍发病。可在接种15天后调查各材料黄萎病的发病情况，参照朱荷琴病害分级方法调查，计算病情指数，对本发明的棉花黄萎病抗病性的检测方法进行验证。

所述朱荷琴病害分级方法的分级标准为：

0级，健苗，无病状；

1级，1～2片子叶表现病状，子叶变黄，真叶不显病状；

2级，子叶和1片真叶表现病状；

3级，2片真叶表现病状；

4级，全部叶片表现病状，严重时叶片脱落，顶心枯死。

病情指数计算方法：

病情指数％＝Σ(病级×相应病株数)×100/4/调查总株数。

本发明的棉花黄萎病抗病性的检测方法中，未接菌的不同棉花材料苗期的CHI和GLU活性含量基本相同，且与病情指数没有明显的相关性。接种黄萎病病菌之后，棉苗中的CHI和GLU酶活与抗病性有显著正相关关系，与病情指数呈显著负相关关系。因此，将病情指数与接种后棉苗的酶活检测结果(酶活力单位增量)进行曲线拟合，获得二次方程，通过模拟值，加上各材料相应的酶活性单位即可根据通用的病情指数分级标准获得本发明的棉花黄萎病抗病性的判断标准，只需在接种后检测酶活力单位总量，方便应用。

计算所得病情指数与本发明的棉花黄萎病抗病性判断标准的对照表如表1所示。

表1 病情指数与本发明的棉花黄萎病抗病性判断标准对照表

棉花黄萎病抗病性

免疫材料

高抗材料

抗病材料

耐病材料

易感材料

感病材料

病情指数

-

≤5.0

5.1～20.0

20.1～30.0

30.1～35.0

>35.0

GLU酶活力单位

>36.1

32.2～36.1

28.7～32.1

25.9～28.6

24.7～25.8

<24.7

CHI酶活力单位

>90.8

78.3～90.8

67.3～78.2

58.0～67.2

53.9～57.9

<53.9

注：表中所示酶活力单位指总量结果；在抗病性鉴定时耐病病情指数放宽到>35，但在品种选育时应控制在30以内。

本发明的棉花黄萎病抗病性的检测方法，通过将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后棉苗叶片中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性来判断棉花黄萎病抗病性，该方法无需等待棉苗发病，即可在育苗阶段快速、准确的获知棉花黄萎病抗病性；通过对接种后棉苗酶活的快速检测结果，可快速筛选所需的抗病植株和材料，为培育抗病品种(系)奠定基础；可根据该方法的检测结果移栽抗病或耐病性好的植株，经过田间发病情况验证筛选，进而得到抗病的棉花植株和品系，使最终的棉花产量高、品质好；该检测方法便于从育苗阶段得到抗病或耐性性好的单株和材料，直接进行丰产和品质育种，加快可品种选育进程，适合推广应用。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1

本实施例的棉花黄萎病抗病性的检测方法，包括下列步骤：

1)准备种子：选择转基因品种及其受体材料：中24转(转双价(Chi+Glu)基因的棉花品种中棉所24)、中24(中棉所24)、感病对照冀棉11(SCK)、抗病对照豫棉21(RCK)；挑选颗粒饱满均匀的籽粒，备用；

2)播种育苗：取步骤1)挑选的籽粒，在单穴直径3cm、高3cm的育苗穴盘内进行单粒播种，所述育苗穴盘每盘190穴、育两个材料，播种后覆盖上灭菌后的基质(草炭土)至基质层厚1cm，再盖土至土层厚2cm；将育苗穴盘放入底部铺有塑料布的人工池(人工在地里挖的池，池高5cm、长120cm、宽40cm，上面盖有弓棚，棚高5cm)内，进行育苗；

苗期管理：出苗期间，保证光照和水分充足，进行常规的管理；出苗后，控制环境昼夜温度在25℃～30℃；

3)制备接种菌液：将棉花黄萎病中等致病菌VD-1接入PDA固体培养基进行培养，3天后转入PDA液体培养基中，并将其放入摇床使之繁殖生长3天，用3层灭菌纱布过滤，得黄萎病病菌菌液，用显微镜直接计数法计算菌液中孢子含量为10⁷个/ml，4℃冷藏备用；

其中：所述PDA固体培养基中，马铃薯、葡萄糖、琼脂与水的质量比为200:20:17:1000；

所述PDA液体培养基中，马铃薯、葡萄糖与水的质量比为200:20:1000；

4)接种：使用伤根蘸菌液法接种，具体为：当棉苗长至两片真叶完全展开时，将育苗穴盘从池用中取出，从穴盘下面直接将外露的主根剪切1-3cm，并放入盛有步骤3)所得黄萎病病菌菌液的培养皿或其它大口容器中，使棉苗的剪切伤口浸入黄萎病病菌菌液中7s进行接种，所述菌液中黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml，接种后将棉苗重新放入育苗穴盘中，用草炭土重新覆盖，室温培养，常规浇水；

5)酶活测定：于接种后72h时，取棉苗第二片真叶，采用Reissing法和葡萄糖底物法分别检测棉苗叶片中的几丁质酶(GLU)活性和葡聚糖酶(CHI)活性，并根据几丁质酶酶活力单位和葡聚糖酶酶活力单位的量判断棉花黄萎病抗病性。

其中，所述Reissing法包括下列步骤：

a)N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的制备：

①配制浓度为100μg/ml的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)母液(称取1mg N-乙酰葡萄糖胺溶于10ml水中)，取9支试管，标号1-9，分别取GlcNAc母液0、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml、0.25ml、0.3ml、0.35ml、0.4ml、0.4ml置于试管中，分别加水定容至0.4ml，则1-9号试管中GlcNAc的浓度分别为0、12.5μg/ml、5μg/ml、37.5μg/ml、50μg/ml、62.5μg/ml、75μg/ml、87.5μg/ml、100μg/ml；

②每试管中加入0.2ml饱和硼砂溶液，沸水浴7min；冷却，每试管中加2ml冰醋酸、1ml质量浓度为1％的DMAB溶液，37℃水浴保温；15min后(溶液呈红色)，在585nm处测定吸光值(OD值)；

③将测得OD值与GlcNAc浓度进行拟合曲线，得到Y＝ax+b的一元线性方程，曲线相关系数R²≥0.999；

b)酶样制备：

称取0.1g植物叶片，加2ml醋酸(提取液，0.05mol/L，pH5.0)，转移入2ml离心管，4℃下12000r/min离心15min；吸取上清液(上清液A，即为粗酶提取液)转移到新的1.5ml离心管中，4℃冰箱中保存备用；

c)酶样测定：

取0.4ml粗酶提取液、0.4ml醋酸缓冲液(0.05mol/L，pH5.0)和0.4ml胶体几丁质溶液(质量浓度1％)混合，37℃水浴反应2h后，4000r/min离心10min，终止反应，得上清液B；取0.4ml上清液B，加40μl质量浓度为1％的蜗牛酶溶液，继续在37℃反应30min，离心，得上清液C；取0.4ml上清液C，加0.2ml饱和硼砂溶液(上清液即刻变黄色)，沸水浴7min，冷却后加2ml冰醋酸和1ml、质量浓度为1％的DMAB溶液，37℃水浴保温15min，得红色溶液；

d)取所得红色溶液，在585nm处测定该溶液的吸光值，并根据N-乙酰葡萄糖胺标准曲线计算得几丁质酶活性。酶的活性表示为样品每毫克蛋白中1min内由CHT催化反应生成的N-乙酰氨基葡萄糖量(N-乙酰葡萄糖胺)。

所述葡萄糖底物法包括下列步骤：

i)葡萄糖标准曲线绘制：

①取7支带有15ml刻度的试管，标号1-7，分别吸取标准葡萄糖溶液0、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml；加蒸馏水定容至2ml，则葡萄糖的实际含量分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/ml；

②在各试管中分别加入2ml DNS显色剂，沸水浴10min后，加水定容至15ml；

③使用分光光度计，在波长540nm处测量OD值；将测得OD值与葡萄糖毫克数进行拟合曲线，得到Y＝ax+b的一元线性方程，曲线相关系数R²≥0.999；

ii)酶样制备：

将0.3g的植物叶片样品放入2ml离心管中，加5倍质量的浓度为0.05mol/L的乙酸钠缓冲液(pH 5.6)，研磨匀浆后，15000r/min离心15min，取上清液在4℃下透析过夜，得底物溶液；

iii)酶样测定：

对于每一个被测酶样品(底物溶液)，取四支试管，每管中分别加入1ml底物溶液，三支供测试酶活性，一支作空白；将试管在50±0.2℃条件下保温2-3min后，向三个试管中加1ml酶稀释液(pH值为5.6、乙酸钠浓度为0.05mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液)，空白管中加1ml无离子水代替酶稀释液；四支试管均于50℃反应10min后，每管加2ml DNS试剂，具塞，沸水煮10min；冷却后，用无离子水定容至15ml，充分混匀；用空白管将分光光度计调零，在540nm处测三只试管中样品的OD值；将测得的各平行样求OD值的均值，根据标准曲线求得葡萄糖的含量；以每分钟水解β-葡聚糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量，定义为一个酶活力单位，求得酶单位。

酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/10/1)×100(180指葡萄糖从微克换算成微克分子数，10指待测液与底物的反应时间，0.5指与底物反应的待测酶液量，n指原酶液的稀释倍数)；本实施例中，酶活力＝产生还原糖的浓度×10。

本实施例所测得的几丁质酶酶活力单位和葡聚糖酶酶活力单位如表2所示。

表2 实施例1的棉苗中几丁质酶活性和葡聚糖酶活性检测结果

棉花品种	中24转	中24	豫棉21(RCK)	冀棉11(SCK)
					GLU酶活力单位	31.5	28.41	27.32	20.57
CHI酶活力单位	72.4	66.74	62.58	45.25
					黄萎病抗病性判断	抗病	耐病	耐病	感病

病情调查：在开花期和现蕾期，对本实施例的棉花植株进行黄萎病病情调查，取平均值进行统计，计算病情指数，结果如表3所示。

表3 实施例1中棉花植株病情调查结果

棉花品种	中24转	中24	豫棉21(RCK)	冀棉11(SCK)
					病情指数	15.6	20.83	24.85	65.44
抗病性	抗病	耐病	耐病	感病

从表2和表3可知，本实施例的棉花黄萎病抗病性的检测方法得出的四个材料的抗病性结果与病害调查结果相一致，冀棉11为感病材料，中24、豫棉21为耐病材料，中24转为抗病材料。

实施例2

本实施例的棉花黄萎病抗病性的检测方法，包括下列步骤：

1)准备种子：选择种子质量达标表现稳定的品种或株系材料：豫宝8号×中24杂交种F1(中早熟材料，为豫宝8号与中24的杂交种)、郑杂棉13F6(早熟材料，为郑杂棉6号杂交棉的系选6代品系)、冀棉11(SCK)、豫棉21(RCK)；挑选颗粒饱满均匀的籽粒，备用；

2)播种育苗：取步骤1)挑选的籽粒，在单穴直径3cm、高3cm的育苗穴盘(每盘6穴)内进行单粒播种，然后覆盖上灭菌后的基质(草炭土)至基质层厚1cm，再盖土至土层厚2cm；将育苗穴盘放入盛水深为1.5cm的发芽盒内，进行发芽；

3)制备接种菌液：将棉花黄萎病中等致病菌VD-1接入PDA固体培养基进行培养，5天后转入PDA液体培养基中，并将其放入摇床使之繁殖生长3天，用3层灭菌纱布过滤，得黄萎病病菌菌液，用显微镜直接计数法计算菌液中孢子含量为10⁷个/ml，4℃冷藏备用；

4)接种：使用伤根蘸菌液法接种，具体为：接种时，将育苗穴盘从发芽盒中取出，从穴盘下面直接将外露的主根剪掉1-3cm，并放入盛有步骤3)所得黄萎病病菌菌液的培养皿或其它大口容器中，使棉苗的剪切伤口浸入黄萎病病菌菌液中7s进行接种，所述菌液中黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml，接种后将棉苗重新放入发芽盒中，室温(25～30℃)培养，常规浇水。

5)酶活测定：接种后的72h时，取棉苗第二片真叶，采用Reissing法和葡萄糖底物法分别检测棉苗叶片中的几丁质酶(GLU)活性和葡聚糖酶(CHI)活性，并根据几丁质酶酶活力单位和葡聚糖酶酶活力单位的量判断棉花黄萎病抗病性。

其中所述Reissing法和葡萄糖底物法分别同实施例1。

本实施例所测得的几丁质酶酶活力单位和葡聚糖酶酶活力单位如表4所示。

表4 实施例2的棉苗中几丁质酶活性和葡聚糖酶活性检测结果

病情调查：待棉苗接种15天后，按照病情调查各材料黄萎病的发病情况，计算病情指数，结果如表5所示。

表5 实施例2中棉苗病情调查结果

从表4和表5可知，本实施例的棉花黄萎病抗病性的检测方法得出的四个材料的抗病性结果与病害调查结果相一致，郑杂棉13、冀棉11为感病材料，豫宝8号×中24杂交种F1为抗病材料，豫棉21为耐病材料。

Claims

1.一种棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：包括将黄萎病病菌接种至棉苗，检测接种后棉苗中的几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性，并根据棉苗中几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性判断棉花黄萎病抗病性。

2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述棉花黄萎病抗病性的判断标准为：

3.根据权利要求1或2所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述接种方法为伤根蘸菌液法，包括将棉苗主根剪掉1～3cm后，将棉苗的剪切伤口浸入黄萎病病菌菌液中7～10s进行接种。

4.根据权利要求3所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述接种是当棉苗长至两片真叶完全展开时进行接种。

5.根据权利要求4所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述棉苗是由以下方法制备的：取棉籽，在育苗穴盘内进行单粒播种后，覆盖灭菌后的基质至基质层厚1cm，再盖土至土层厚为2cm；出苗期间保证水分充足；出苗后，控制环境昼夜温度为25～30℃。

6.根据权利要求3所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述黄萎病病菌菌液中，黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml。

7.根据权利要求6所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述黄萎病病菌菌液是由以下方法制备的：将黄萎病病菌接种至PDA固体培养基，培养5～7天后转入PDA液体培养基中培养，至菌液中黄萎病病菌孢子的浓度为10⁷个/ml，4℃冷藏备用。

8.根据权利要求1或2所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：接种后的棉苗继续育苗，接种后72h时进行几丁质酶活性和/或葡聚糖酶活性检测。

9.根据权利要求1或2所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述几丁质酶活性的检测方法为Reissing法。

10.根据权利要求1或2所述的棉花黄萎病抗病性的检测方法，其特征在于：所述葡聚糖酶活性的检测方法为葡聚糖底物法。