CN112369314A - 一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法 - Google Patents

一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于水稻抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，包括如下操作步骤：(1)浸种消毒，(2)催芽播种，(3)接种覆膜，(4)培养参数，(5)结果调查。本发明比土培法稳定，采用的营养液元素来源稳定，采用菌核接种，接菌比较均匀，相对于菌块接种接菌量适中，能够更好的区分出抗性和敏感品种，接种后放入培养箱中条件各方面更好控制，能够保证每一批接种后表型鉴定的准确性，能有效地把抗性和敏感品种区分开来。

Description

一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法
技术领域
本发明涉及水稻抗病性鉴定技术领域，特别是一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法。
背景技术
水稻纹枯病是一种世界性病害，为水稻的三大病害之一，最早于1910年由宫宅在日本发现，随后在菲律宾、美国、斯里兰卡等国家相继报道，1934年植物病理学家魏景超在我国发现此病，1975年成为全国防治对象。该病害在水稻整个生育期均可发生，主要危害叶鞘、叶片，危害大、流行性强、寄主范围广，其产生的菌核能抗逆和忍耐极端环境，对水稻高产稳产造成重大影响。随着矮杆、多孽良种的推广应用以及栽培密度、氮肥使用量的增加，其危害程度日益严重，在我国尤其是南方造成了严重的经济损失。
水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状,现有种植资源中未发现对此病害免疫的品种,高抗品种也是寥寥无几。因此,正确评价现有资源中的抗性种质,以及鉴定其中的数量抗病基因并将其应用于育种实践,显得极为重要。目前，水稻纹枯病抗性鉴定主要依靠分蘖末期接种纹枯病菌的田间鉴定方法。该方法的鉴定结果比较稳定可靠，但是工作量较大，试验周期长，且受季节限制。已报道的苗期纹枯病接种方法主要有温室－可乐瓶－琼脂块法(即微室法，micro-chamber meth-od)、控温室－尼龙薄膜－稻谷法、离体叶片法、牙签法等。但是这些方法的接种环境不太稳定，接种物、接种时水稻苗龄、接种方法、病情评价体系等尚不统一，实验数据的可重复性不高。同时，现有公开文献中，现有苗期微室法鉴定，用的是土培，菌块接种(王子斌.水稻纹枯病接种鉴定体系新探索及抗病新种质YSBR1抗性分析[D].扬州大学,2013；徐国娟,袁正杰,左示敏，等.水稻苗期纹枯病抗性鉴定微室接种技术的改良[J].中国水稻科学,2015,29(01):97-105；马晨燕,袁正杰,杨海河，等.水稻离体叶片抗纹枯病接种方法的研究[J].浙江农业学报,2016,28(10):1730-1737.)。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对性强、检测效率高、准确性好、简便易行的鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法。
为达到上述目的，主要提供如下技术方案：
一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，包括以下步骤：
(1)浸种消毒：水稻种子浸种10-15h，再用有效含量为0.1％-0.2％强氯精水溶液浸泡10-15h杀菌消毒处理，消毒后用清水冲洗掉残留的强氯精；
(2)催芽播种：把浸种消毒后的种子置于光照培养箱中催芽，培养箱设置催芽温度为28-32℃；催芽3d后，取出种子，把种子播入播种板中；把播种后的播种板置于不透明容器中，配置营养液倒入不透明容器内；
(3)接种覆膜：水稻长至3.1-3.7叶时做接种处理；所述接种处理采用菌核接种方式，挑选大小一致的菌核，将其卡在第一片叶的叶鞘上；接种后在所述不透明容器上覆膜；
(4)培养参数：把接种覆膜的水稻放入光照培养箱，培养箱设定为光照12h，无光照12h；
(5)结果调查：接种覆膜后6d调查，于当天测量病斑高度、叶枕高，计算发病度，每份试验材料调查30株秧苗的单株病级，用每个品种单株病级的平均数代表该品种病级；调查发病度后把幼苗转移至炼苗室继续培养，5天后调查幼苗死亡率；根据平均单株病级和死亡率判断水稻品种对纹枯病的抗性。
作为优选，所述步骤(2)中播种板的下端剪孔，种子从上端插入，下端露出根部。
作为优选，所述步骤(2)中营养液调节pH值至5.8-6.2，每3天更换一次。
作为优选，所述步骤(5)中单株病级计算公式为：单株病级＝病斑高度/叶枕高×9。
作为优选，所述步骤(5)中炼苗室设定指标为白天环境温度28-30℃，光照强度设定20000LX，湿度设定为70-75％，时间12h；夜间环境温度设定为25℃，光照强度设定0LX，湿度设定为70-75％，时间12h。
作为优选，所述步骤(5)中死亡率计算公式为：死亡率＝死亡株数/总株数×100％。
作为优选，所述死亡率计算公式中死亡株判断方法：整株枯黄或整片心叶枯黄且培养5天后未继续生长判定为死亡。
作为优选，所述死亡率计算公式中存活株判断方法：整株未见枯黄，或有叶片枯黄但心叶未见枯黄，或心叶有部分枯黄但是培养5天后心叶仍继续生长判断为存活。
作为优选，所述步骤(5)中纹枯病抗性评价标准为：按平均单株病级：＞7，高感；＞5且≤7，感病；＞3.5且≤5，中抗；＞2且≤3.5，抗病；＞0且≤2，高抗；0，免疫；
按死亡率：＞80％且≤100％，高感；＞50％且≤80％，感病；＞20％且≤50％，中抗；＞0且≤20％，抗病；0且发病程度很轻，高抗；0且不发病，免疫；
当平均单株病级与死亡率评价结果不一致时，以抗性低的结果为最终结果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
现有技术不能准确的鉴定苗期纹枯病表型，本发明有诸多优点，首先培养水稻苗长势均一，水稻在水培环境下生长迅速，缩短处理周期；其次水培法采用营养液培养，大量元素和微量元素来源稳定且可控，避免了土培造成的不同批次土壤内含的元素干扰，增加了实验的可重复性；最后采用菌核接种+覆膜的方法，保证了足够的湿度，使纹枯病发病非常稳定，菌核接种相对于菌块接种接菌量适中，能够更好的区分出抗性和敏感品种，利用此方法在苗期做水稻抗纹枯病的表型鉴定，效果显著，能把抗性和敏感品种有效区分开来。
附图说明
图1为播种，其中A图为PCR板。B图为剪孔后的PCR板。C图为PCR板置于黑色方盒。
图2为接种，其中A图为水稻纹枯病菌核的培养基。B图为接种了水稻纹枯病菌核的水稻。C图为接种后覆盖保鲜膜的试验装置。
图3为抗敏品种局部发病情况(接种后4d)。
图4为抗敏品种表型鉴定(接种后6d)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的材料均可自常规途径购买得到。
以下实施例中光照培养箱用的是东南的RDN-1000E-4型，菌核培养用的立枯丝核菌C30是由湖南省水稻研究所李小湘老师提供。秧苗纹枯病发病度调查方法参照徐国娟,袁正杰,左示敏，等.水稻苗期纹枯病抗性鉴定微室接种技术的改良[J].中国水稻科学,2015,29(01):97-105.
实施例1
(1)浸种消毒：水稻种子浸种12h，再用有效含量为0.13％的强氯精水溶液浸泡12h杀菌消毒处理，浸种温度保持在25-30℃之间。消毒后用清水冲洗掉残留的强氯精。
(2)催芽播种：把浸种消毒后的种子置于培养箱中催芽，培养箱设置催芽温度为30℃。催芽3d后，取出种子，把种子播入PCR板中，PCR板的下端用剪刀剪孔，种子从上端插入，下端露出根部；PCR板及剪孔后的PCR板见图1-A及图1-B。把播种后的PCR板配置于黑色方盒内，每个黑色方盒最多可容纳6块PCR板，配置上述营养液3L倒入黑色方盒内，调节PH值至5.8-6.2，营养液每3天更换一次；放置了播种的PCR板的黑色方盒见图1-C。
营养液配制方法：
表1母液配置
Figure BDA0002679067380000041
强酸：浓硝酸：浓度为14.4-15.1mol/L,配备1M母液，需要33.0(33.1-34.7)ml/0.5L。浓硫酸：浓度为17.8-18.4mol/L,配备0.15M母液，需要4.143(4.075-4.2125)ml/0.5L。
试剂A：以500ml母液计，将表中所需质量的NH4NO3，NaH2PO4·2H2O和K2SO4混合，用蒸馏水溶解，根据母液的摩尔数量按比例加入浓硫酸或浓硝酸，再用蒸馏水定容到500ml。
试剂B、C、D：以500ml母液计，分别将表中所需质量的Fe-Na-EDTA/MgCl2·6H2O/CaCl2·2H2O用蒸馏水溶解，根据母液的摩尔数量按比例加入浓硫酸或浓硝酸，再用蒸馏水定容到500ml。得到试剂B/C/D。
试剂E：以500ml母液计，将表中所需质量的H3BO3，MnSO4·1H2O，ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和Na2MoO4·2H2O混合，用蒸馏水溶解，根据母液的摩尔数量按比例加入浓硫酸或浓硝酸，再用蒸馏水定容到500ml。
稀释比例：配制目标营养液时，按每L营养液加入2ml试剂A、1ml试剂B、1ml试剂C、1ml试剂D和0.1ml试剂E的比例配制。营养液配制完成后用NaOH调整pH值至5.8-6.2。
(3)接种覆膜：水稻培养2个星期左右，长至3.1～3.7叶期，可做接种处理。接种采用菌核接种方式，挑选大小一致的菌核，用消毒的镊子夹住菌核，把它卡在第一片叶的叶鞘上，接种后的水稻见图2-B；接种后黑色方盒用支架撑住再用保鲜膜罩住保持湿度，薄膜上留两个直径2cm的通气孔；保持湿度的装置见图2-C。
菌核培养：
PDA培养基制备：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加入1000m L水，煮沸20min,纱布过滤，待煮沸后的液体充分冷却后加入20g琼脂和18g葡萄糖，继续煮沸10min，搅拌均匀后装瓶高压灭菌(121℃，20min)。
接种：灭菌后的培养基倒入直径9cm的一次性培养皿中，每皿倒入量25～30ml，之后至于超净工作台冷却，待培养基冷却后，选取立枯丝核菌C30为接种体，将该菌的菌核移植到PDA培养基正中央，盖上皿盖并用封口膜缠绕数圈封口。
培养：将接种后的培养皿置于生化培养箱28℃培养5d，待菌核铺满培养基表面后即可作为水稻幼苗接种的菌源。
(4)培养参数：把接种覆膜的水稻放入光照培养箱，培养箱设定为光照12h，无光照12h，有光照时培养箱温度设定为30℃，光照强度设定20000LX，湿度设定为92％；无光照时培养箱温度设定为28℃，光照强度设定0LX，湿度设定为90％。
(5)结果调查：接种覆膜后6d调查，第一次调查揭开薄膜，于当天测量病斑高度、叶枕高，计算发病度，单株病级＝(病斑高度/叶枕高)×9。每份试验材料调查30株秧苗的单株病级，用每个品种单株病级的平均数代表该品种病级。
调查发病度后把幼苗转移至炼苗室继续培养，白天环境温度28-30℃，光照强度设定20000LX，湿度设定为70-75％，时间12h；夜间环境温度设定为25℃，光照强度设定0LX，湿度设定为70-75％，时间12h。白天和夜间循环培养5天期间使用的营养液与接种前的营养液相同。5天后调查幼苗死亡率。死亡率(％)＝死亡株数/总株数×100％。
死亡株判断方法：整株枯黄或整片心叶枯黄且培养5天后未继续生长可判定为死亡。
存活株判断方法：整株未见枯黄、或有叶片枯黄但心叶未见枯黄、或心叶有部分枯黄但是培养5天后心叶仍继续生长则判断为存活。
病情级别及判断标准见表2。
表2水稻纹枯病病情级别划分
Figure BDA0002679067380000061
如果平均病级调查和死亡率调查结果不统一，抗性评价趋向敏感的结果为最终结果，即抗性低的结果。例如某品种平均病级鉴定结果为4.2属于中抗，但是5d后调查死亡率为0属于抗病，则以中抗为最终鉴定等级。
鉴定结果有效性判断：调查完毕后，同一批次处理下只有抗病品种材料高品6鉴定为抗病且高感品种Lemont鉴定为高感，该批次的苗期水稻纹枯病表型鉴定认定为有效。
实验例2
以实施例1的鉴定方法对水稻品种Lemont、高品6、67号、995和14-150进行苗期水稻纹枯病表型鉴定。在一块PCR板中培养30株相同品种的水稻苗，全部菌核接种。6天后观察发病程度和记录死亡水稻苗数，计算死亡率。接种4天后的高品6、Lemont与未接种的水稻苗的叶片见图3，接种6天后高品6、995、14-150和Lemont水稻苗生长状况见图4。
本实验例结果见表3，结果表明水稻品种高品6，用该方法鉴定为抗病；水稻品种995，用该方法鉴定为抗病；水稻品种14-150,用该方法鉴定为中抗；水稻品种Lemont，用该方法鉴定为高感；水稻品种67号，用该方法鉴定为高抗。表明该方法结果准确可靠，可用于鉴定苗期水稻纹枯病表型。
表3实验材料病情及死亡率情况
品种 平均病级调查 死亡率 抗性评价
高品6 2.65 6.7％ 抗病
995 3.24 10％ 抗病
14-150 4.86 40％ 中抗
Lemont 8.26 100％ 高感
67号 1.82 0％ 高抗

Claims (9)

1.一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
(1)浸种消毒：水稻种子浸种10-15h，再用有效含量为0.1％-0.2％强氯精水溶液浸泡10-15h杀菌消毒处理，消毒后用清水冲洗掉残留的强氯精；
(2)催芽播种：把浸种消毒后的种子置于光照培养箱中催芽，培养箱设置催芽温度为28-32℃；催芽3d后，取出种子，把种子播入播种板中；把播种后的播种板置于不透明容器中，配置营养液倒入不透明容器内；
(3)接种覆膜：水稻长至3.1-3.7叶时做接种处理；所述接种处理采用菌核接种方式，挑选大小一致的菌核，将其卡在第一片叶的叶鞘上；接种后在所述不透明容器上覆膜；
(4)培养参数：把接种覆膜的水稻放入光照培养箱，培养箱设定为光照12h，无光照12h；
(5)结果调查：接种覆膜后6d调查，于当天测量病斑高度、叶枕高，计算发病度，每份试验材料调查30株秧苗的单株病级，用每个品种单株病级的平均数代表该品种病级；调查发病度后把幼苗转移至炼苗室继续培养，5天后调查幼苗死亡率；根据平均单株病级和死亡率判断水稻品种对纹枯病的抗性。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(2)中播种板的下端剪孔，种子从上端插入，下端露出根部。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(2)中营养液调节pH值至5.8-6.2，每3天更换一次。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(5)中单株病级计算公式为：单株病级＝病斑高度/叶枕高×9。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(5)中炼苗室白天环境温度28-30℃，光照强度设定20000LX，湿度设定为70-75％，时间12h；夜间环境温度设定为25℃，光照强度设定0LX，湿度设定为70-75％，时间12h。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(5)中死亡率计算公式为：死亡率＝死亡株数/总株数×100％。
7.根据权利要求6所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述死亡率计算公式中死亡株判断方法：整株枯黄或整片心叶枯黄且培养5天后未继续生长判定为死亡。
8.根据权利要求6所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述死亡率计算公式中存活株判断方法：整株未见枯黄，或有叶片枯黄但心叶未见枯黄，或心叶有部分枯黄但是培养5天后心叶仍继续生长判断为存活。
9.根据权利要求1所述的一种鉴定苗期水稻纹枯病表型的方法，其特征在于，所述步骤(5)中纹枯病抗性评价标准为：
按平均单株病级：＞7，高感；＞5且≤7，感病；＞3.5且≤5，中抗；＞2且≤3.5，抗病；＞0且≤2，高抗；0，免疫；
按死亡率：＞80％且≤100％，高感；＞50％且≤80％，感病；＞20％且≤50％，中抗；＞0且≤20％，抗病；0且发病程度很轻，高抗；0且不发病，免疫；
当平均单株病级与死亡率评价结果不一致时，以抗性低的结果为最终结果。
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