CN103392605A - 一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，该发明包括一套配套器具与实施方法步骤。配套器具的构件由培养皿、玻璃罩、平底盘组成。实施方法步骤如下：1）配套器具准备；2）育苗用水琼脂基质平板的制备；3）微稻苗培育；4）接种体准备；5）接种操作；6）接种后管理。本发明的优点是：无土育苗，容易实现全过程的无菌化；整套方法全程时间短；占用空间小；空间利用率高；温度、湿度和水肥等重要发病条件容易控制，一致性好；病害反应清晰稳定，结果重现性好；实施操作简易，过程管理简单；总体技术简单，容易实现技术方法的标准化。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术和生物技术。具体是一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法。
背景技术
稻纹枯病是我国水稻生产的首要病害，每年可造成68亿多公斤稻粮损失。该病害的科学有效防治有赖于该病害的基础研究，而许多基础研究又离不开人工接种发病这基本手段。至今，有关该病害的人工发病技术，已有不少成熟的方法，归结起来，主要有成株期接种和苗期接种方法两大类，并派生出撒施接种、嵌入接种等方法。一般地，成株期接种能获得更切合生产实际的结果，因而在品种抗病性评比和某些生产试验中应用较多，但在成株期接种方法体系中，存在费力耗时；占用空间场地较大；试验结果易受环境条件影响等突出弊病，因而阻碍了其在许多试验工作中的应用；苗期接方法，所用的稻苗相对地比成株期的小，试验占用时间和空间方面，与成株期接种方法相比，已大有改观，不过，当前国内外广为应用的苗期接种方法均是在稻苗的3～5叶期后进行接种，这种方法体系中，育苗耗时2周以上，接种观察耗时1周以上，试验工作一般要跨越3周多的时长，这对某些要求短期内获得结果的试验工作，如分子植病研究的致病突变体鉴定，抗病基因表达，以及侵染过程的病菌-寄主互作信息传递等，仍有时间过长之嫌；为获得健壮的稻苗，需要提供充分的阳光和补充肥料，实施全套工作仍需使用温室等较大的空间场地；而且在试验期间的局部条件，如湿度、温度、肥水等控制方面，仍存在一定的难度，或者受到装备条件的限制等。
发明内容
本发明的目的是利用病菌能侵染微小稻苗而正常致病的特性，提供一种利用无土培育微稻苗接种稻纹枯病的配套器具与实施方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
1.一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法的配套器具，其特征在于：该配套器具的构件由培养皿、玻璃罩、平底盘组成。
所述的玻璃罩将培养皿全部罩住；玻璃罩和培养皿全部置在平底盘内。
2.一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，其特征在于，实施操作步骤如下：
1)配套器具准备：使用前用洁净剂洗涤干净配套器具培养皿、玻璃罩、平底盘。
2)育苗用水琼脂基质平板的制备：用水琼脂作无土培育微稻苗的基质，水琼脂基质平板的制备方法是：按比例：琼脂/水=3g/1000ml，称取琼脂放入干净水中，加热至全部琼脂熔化后，倒入培养皿中，形成约5mm厚的水琼脂基质平板。琼脂的用量比例，以熔化冷却后，能凝固但不过硬为宜，不同供货商的琼脂性能可能有异，因而用量有别。
3)微稻苗培育：取水稻种子按常规方法浸种催芽。选取催芽萌动一致的种子点播到制备好的水琼脂基质平板面上，将种子留在面上或按压入琼脂平板内；将播种后的培养皿转入平底盘内，取玻璃罩将培养皿罩在平底盘内，取清水注入平底盘，形成和保持薄层浅水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态。
将全套育苗装置放在室内能采光的地方。一般明亮的室内散射光即能满足微稻苗生长的要求，应避免直射阳光的照晒，这容易引起玻璃罩内增温。在温度为30℃条件下培育。
培育的微稻苗的苗高小于8cm，以4～5cm最合适。
4)接种体准备：将待接种菌株移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g；蔗糖20g；琼脂20g；水1000ml；在温度30℃下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为定量接种的接种体。
5)接种操作：取步骤3）培育获得的微稻苗，打开微稻苗上方的玻璃罩，挑取步骤4）的菌丝块定量接种放置在微稻苗基部琼脂平板面上，菌丝块边缘触及微稻苗基部。
6)接种后管理：接种完成后，补充平底盘的薄层浅水，重新罩上玻璃罩，回到原来育苗的条件下继续培育，将温度条件改变为28℃。接种30小时后可见发病坏死斑，随时间推移到接种3天后，微稻苗上呈现清晰的较大病斑。
本发明的优点是：
1）无土法育苗，容易实现全过程的无菌化。
2）整套方法全程时间短；一般不超过一周。
3）占用空间小；且配套器具装置可以叠放，空间利用率高。
4）温度、湿度和水肥等重要发病条件容易控制，一致性好。
5）病害反应清晰稳定，结果重现性好。
6）实施操作简易，过程管理简单。
7）总体技术简单，容易实现技术方法的标准化。
附图说明
图1是本发明用的配套器具示意图。
图中：培养皿1，玻璃罩2，平底盘3。
图2是本发明配套器具的配套工作示意图。
图中：培养皿1、玻璃罩2、平底盘3。
图3是本发明整套育苗器具装置的多个(层)叠放示意图。
图4是本发明培育的适合接种使用的微稻苗。
图5是本发明在微稻苗基部接种菌丝块后的示意图，示定量接种菌丝块的位置和状态。
图6是本发明无病菌对照接种3天后的微稻苗图。
图7是本发明微稻苗接种病菌3天后的发病症状图。
图8是本发明无病菌对照接种3天后的多个培养皿微稻苗原位状态图。
图9是本发明无病菌对照接种3天后的单个培养皿微稻苗原位状态图。
图10是本发明接种病菌3天后多个培养皿微稻苗发病的原位状态图。
图11是本发明接种病菌3天后单个培养皿微稻苗发病的原位状态图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
配套器具如图1所示，一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法的配套器具，该配套器具的构件由培养皿1、玻璃罩2、平底盘3组成。
培养皿1是实验室用的普通培养皿。玻璃罩2为方形，一面开口，最好用有机玻璃制成。平底盘3是材料结实的普通平底浅盘。
器具配套要点是：玻璃罩2能将培养皿1全部罩住；玻璃罩2和培养皿1能全部置在平底盘3如图2所示。
实施例1
应用本发明一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，以水稻品种中优679为寄主材料，稻纹枯病菌菌株Rs-1为病菌材料，培育微稻苗接种稻纹枯病，按如下步骤实施操作：
1)配套器具准备：使用前用洁净剂洗涤干净配套器具培养皿1、玻璃罩2、平底盘3；在需要无菌化操作的情况下，将培养皿1灭菌。
2)育苗用水琼脂基质平板的制备：用水琼脂作无土培育微稻苗的基质，水琼脂基质平板的制备方法是：按比例：琼脂/水=3g/1000ml，称取琼脂放入干净水中，加热至全部琼脂熔化后，倒入培养皿1中，形成约5mm厚的水琼脂基质平板。琼脂的用量比例，以熔化冷却后，能凝固但不过硬为宜，不同供货商的琼脂性能可能有异，因而用量有别。在需要无菌化操作的情况下，将水琼脂灭菌后再用。
3)微稻苗培育：取水稻种子按常规方法浸种催芽。选取催芽萌动一致的种子点播到制备好的水琼脂基质平板面上，将种子留在面上或按压入琼脂平板内；将播种后的培养皿1转入平底盘3内，取玻璃罩2将培养皿1罩在平底盘3内，取清水注入平底盘3，形成和保持薄层浅水，使玻璃罩2内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态。
在需要无菌化操作的情况下，将稻种表面消毒，并在无菌条件下浸种、催芽和播种。
将全套育苗装置放在室内能采光的地方。一般明亮的室内散射光即能满足微稻苗生长的要求，应避免直射阳光的照晒，这容易引起玻璃罩2内增温。在温度为30℃条件下培育，培育期间注意补充维持平底盘3的薄层浅水。
本发明设计的全套育苗器具装置小巧平稳，育苗期间可以多个(层)叠放，能高效利用室内空间如图3所示。
本发明培育的微稻苗，用来接种的适合大小是，微稻苗的苗高小于8cm（约播种后4天内），以苗高约4～5cm的最好（约播种后培育3天）如图4所示。使用苗高超过8cm的稻苗来接种发病的效果较差，且全程历时延长。
4)接种体准备：将该菌株移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g；蔗糖20g；琼脂20g；水1000ml；在温度30℃下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为定量接种的接种体。
5)接种操作：取步骤3）培育获得苗高约4～5cm的微稻苗，打开微稻苗上方的玻璃罩2，挑取步骤4）的菌丝块定量接种放置在微稻苗基部琼脂平板面上，菌丝块边缘触及微稻苗基部，如图5所示。
6）接种后管理：接种完成后，补充平底盘3的薄层浅水，重新罩上玻璃罩2，回到原来育苗的条件下继续培育，将温度条件改变为28℃。高湿度是稻纹枯病发病的关键条件，本发明通过简单的物理封闭使玻璃罩内维持稳定的高湿状态，满足发病条件，不需要特殊的加湿设备。
一般接种30小时后可见发病坏死斑，随时间推移到接种3天后，微稻苗上呈现清晰的较大病斑，如图6～11所示。接种导致病情发展的快慢或轻重，随不同的菌株（或不同的品种）而有所不同。病情的轻重可以用病斑高度等指标来衡量。本实施例1用菌株Rs-1接种品种中优679的微稻苗，接种3天后观察调查，微稻苗发病的病斑高度为7.6cm。
实施例2
应用本发明一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，以水稻品种中优679为寄主材料，稻纹枯病菌菌株Rs-2为病菌材料，培育微稻苗接种稻纹枯病，按实施例1的步骤1)至步骤7)操作实施；结果接种发病症状与实施例1的一样，接种3天后观察调查，微稻苗发病的病斑高度为6.9cm。
实施例3
应用本发明一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，以水稻品种中优679为寄主材料，稻纹枯病菌菌株Rs-3为病菌材料，培育微稻苗接种稻纹枯病，按实施例1的步骤1)至步骤7)操作实施；结果接种发病症状与实施例1的一样，接种3天后观察调查，微稻苗发病的病斑高度为5.5cm。
实施例4
应用本发明一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，以水稻品种中浙优1号为寄主材料，稻纹枯病菌菌株Rs-1为病菌材料，培育微稻苗接种稻纹枯病，按实施例1的步骤1)至步骤7)操作实施；结果接种发病症状与实施例1的一样，接种3天后观察调查，微稻苗发病的病斑高度为5.3cm。
实施例5
应用本发明一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，以水稻品种中浙优1号为寄主材料，稻纹枯病菌菌株Rs-2为病菌材料，培育微稻苗接种稻纹枯病，按实施例1的步骤1)至步骤7)操作实施；结果接种发病症状与实施例1的一样，接种3天后观察调查，微稻苗发病的病斑高度为4.3cm。
Claims (2)
1.一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法的配套器具，其特征在于：该配套器具的构件由培养皿、玻璃罩、平底盘组成；
所述的玻璃罩将培养皿全部罩住；玻璃罩和培养皿全部置在平底盘内。
2.一种无土培育微稻苗接种稻纹枯病的人工发病方法，其特征在于，实施操作步骤如下：
1)配套器具准备：使用前用洁净剂洗涤干净配套器具培养皿、玻璃罩、平底盘；
2)育苗用水琼脂基质平板的制备：用水琼脂作无土培育微稻苗的基质，水琼脂基质平板的制备方法是：按比例：琼脂/水=3g/1000ml，称取琼脂放入干净水中，加热至全部琼脂熔化后，倒入培养皿中，形成5mm厚的水琼脂基质平板，琼脂的用量比例，以熔化冷却后，能凝固但不过硬为宜，不同供货商的琼脂性能可能有异，因而用量有别；
3)微稻苗培育：取水稻种子按常规方法浸种催芽，选取催芽萌动一致的种子点播到制备好的水琼脂基质平板面上，将种子留在面上或按压入琼脂平板内；将播种后的培养皿转入平底盘内，取玻璃罩将培养皿罩在平底盘内，取清水注入平底盘，形成和保持薄层浅水，使玻璃罩内部封闭并形成罩内稳定的高湿状态；
将全套育苗装置放在室内能采光的地方，一般明亮的室内散射光即能满足微稻苗生长的要求，应避免直射阳光的照晒，这容易引起玻璃罩内增温。在温度为30℃条件下培育；
培育的微稻苗的苗高小于8cm，以4～5cm最合适；
4)接种体准备：将待接种菌株移植到PSA平板培养基上，PSA培养基为：马铃薯200g；蔗糖20g；琼脂20g；水1000ml；在温度30℃下培养至菌落刚长满平板，取直径为6mm打孔器在平板菌落外周打取大小一致的菌丝琼脂圆块，以此菌丝块作为定量接种的接种体；
5)接种操作：取步骤3）培育获得的微稻苗，打开微稻苗上方的玻璃罩，挑取步骤4）的菌丝块定量接种放置在微稻苗基部琼脂平板面上，菌丝块边缘触及微稻苗基部；
6)接种后管理：接种完成后，补充平底盘的薄层浅水，重新罩上玻璃罩，回到原来育苗的条件下继续培育，将温度条件改变为28℃，接种30小时后可见发病坏死斑，随时间推移到接种3天后，微稻苗上呈现清晰的较大病斑。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105104147A (zh) * | 2015-09-10 | 2015-12-02 | 广西大学 | 一种琼脂基质育苗快捷诱发稻瘟病的方法 |
| CN105145303A (zh) * | 2015-09-10 | 2015-12-16 | 广西大学 | 一种纯沙土育苗快捷诱发稻瘟病的方法 |
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| CN103392605B (zh) | 2015-07-29 |
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