CN102524046A - 一种兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的选育方法。以生产中应用的水稻品种为轮回亲本，以地方品种为供体亲本通过杂交和回交获得BC2F2混合群体。采用人工接种从BC2F2群体中选择纹枯病发病程度显著低于轮回亲本的单株，跟踪接种至BC2F4代。考察BC2F4株系的农艺性状，对纹枯病抗性稳定的BC2F5株系进行白叶枯病抗性鉴定和配合力测定，确定兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料。本发明能有效地筛选到既抗纹枯病又抗白叶枯病的水稻育种材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种农作物新材料的筛选培育方法，具体涉及一种选育兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的方法。
背景技术
由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的纹枯病是水稻重要的真菌病害之一，由黄单胞杆菌(Xanthomonas.oryzae pv.oryzea)引起的白叶枯病是水稻重要的细菌病害之一。在我国华南、华中和东南亚等水稻种植地区的雨季，由于台风暴雨频繁发生导致这两种病害经常同时暴发，造成水稻严重减产。
目前，国内外在水稻抗纹枯病育种方面进展缓慢，难以有效地选育抗纹枯病品种。其原因主要是水稻抗源对纹枯病菌表现为数量性状的遗传方式，受多个数量性状位点(Quantitativetrait loci，QTL)控制，单个抗病的效应较小，并且抗病位点的表达显著地受遗传背景影响，采用传统的杂交方法难以转育(Li ZK等，1995，Characterization of quantitative trait loci(QTLs)in cultivated rice contributing to field resistance to sheath blight(Rhizoctonia solani)，Theor ApplGenet，91：374～381)。
随着分子生物学技术的发展，国内外学者相继开展了水稻抗纹枯病的QTL定位研究，在水稻12条染色体上均定位到抗纹枯病QTL。然而，水稻抗纹枯病QTL具有显著的背景依赖性，在相同的环境条件下，在一个水稻遗传背景中表达的多数抗纹枯病QTL在另一遗传背景中可能不表达(谢学文等，2008，水稻抗纹枯病QTL表达的遗传背景及环境效应，作物学报，34(11)：1885～1893)，由于以往大多数基因/QTL定位通常与遗传育种的实践完全脱节，迄今，水稻育种中一直难以有效地改良水稻品种对纹枯病的抗性。
水稻对白叶枯病菌存在由单基因控制的垂直抗性和由数量位点控制的水平抗性。目前已经鉴定到35个水稻白叶枯病抗性基因，其中25个为显性基因，9个为隐性基因，Xa27为半显性基因；15个具有全生育期抗性，Xa7、xa8、Xa11、Xa12、Xa15、Xa16、Xa17、Xa18、xa19、xa20、Xa22、Xa25、Xa26、Xa27、xa28及Xa29等16个是成株抗性基因。
20世纪70年代至今，利用抗病单基因培育和种植抗病育种对于控制水稻白叶枯病的危害起到了重要作用，但是育种中尚存在以下困难：来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中全生育期表达、容易利用的广谱抗性基因有限，生产中主要利用的基因包括Xa3、Xa4、Xa7、Xa21和Xa23等。在应用白叶枯病抗病品种防治病害过程中出现的一个突出问题是大面积种植携带单一抗病基因的品种容易导致新的毒力菌株出现而使品种抗性丧失，利用单基因聚合和多基因控制的水平抗性是避免这一问题的重要途径。
研究表明具有一定抗性的亲本与感病品种杂交构建的群体对白叶枯病的抗性遗传符合多基因遗传模式。Koch和Parlevliet较系统地研究发现在中等抗性亲本组合的后代中发现大量抗性超亲的株系，表明感病品种也携带数量性状遗传因子(Koch MF等，1991，Genetic analysisof and selection for factors affecting quantitative resistance to Xanthomonas campestris pv.oryzaein rice，Euphytica，53：235-245)。杨长登等采用对浙-173中抗的品种五丰占二号与中感的品种中早14和另一高感品种蜀恢162杂交配制群体，发现微效多基因控制的中抗品种与感病品种杂交后回交的群体的抗性水平具有一定程度的提高(杨长登等，2004，水稻品种五丰占2号的白叶枯病抗性遗传分析，中国水稻科学，2004，18(2)：99-103)。
近年来，通过对回交群体进行目标性状筛选发现，供体亲本所携带的各种有利基因大多是以隐蔽的形式存在的，回交育种技术是发掘利用水稻原始基因库中的隐蔽基因来改良抗旱性、耐冷性等复杂性状的有效方法(Lafitte H R等，2006，Improvement of rice drought tolerancethrough backcross breeding：evaluation of donors and results from drought nurseries，Field CropRes，97(1)：77-86)。对回交后代群体目标性状的筛选不必拘泥于供体亲本本身在性状上的表现，回交群体通过严格的胁迫和表型选择均能得到目标性状改良的株系。
培育和种植抗病品种是防治植物病害最经济有效的方法之一，选育兼抗纹枯病和白叶枯病的水稻品种在生产中具有重要的应用价值。目前尚无选育兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种选育兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
(1)抗纹枯病导入系的筛选
以生产上应用的优良水稻品种或杂交稻亲本为轮回亲本，以地方品种或其它水稻品种为供体亲本，杂交1次，回交2次，在回交过程中随机选择20～25单株与轮回亲本回交，获得BC2，然后回交F1家系自交一代，将来自每个组合的BC2F2单株的自交种子混收形成回交群体的混合集团。从BC2F2混合集团中取300～500粒种子，采用牙签嵌入法进行纹枯病接种。
牙签嵌入法具体方法为10×1.5×1mm的木质短棒平铺于培养皿底部，然后倒入马铃薯葡萄糖琼脂培养基，121℃灭菌15分钟，然后用打孔器将生长在固体培养基上的菌丝接种到灭菌过的培养皿中进行培养，待菌丝密集的长满培养基时，就可进行田间接种。用镊子将短棒嵌入倒三叶鞘内侧，并确保叶鞘包茎状态不受影响，使植株呈自然发病状态。接种后，待抽穗后30天左右病斑稳定时进行病情调查。计算相对病斑高度度量，即绝对病斑高度与剑叶叶枕高度的比值。
(2)导入系后代纹枯病抗性的跟踪鉴定
将获得的BC2F3抗性株系每个株系种两行，每行10株，采用(1)中的牙签嵌入法人工接种纹枯病菌进行纹枯病抗性鉴定，筛选30～40个纹枯病抗性稳定的BC2F4株系。将所获得的抗病BC2F4选择导入系单本种植，每个株系种1行，每行10株，行株距为20cm×15cm，2次重复，采用牙签嵌入法对每行中间6株接种纹枯病菌。再将BC2F5选择导入系单本插种植，每个株系种1行，每行10株，行株距为20cm×15cm，2次重复，采用牙签嵌入法对每行中间6株接种纹枯病菌。
(3)抗纹枯病导入系农艺形状考察和白叶枯病抗性鉴定
将所获得的BC2F4代抗纹枯病选择导入系种植在适于轮回亲本生长的地区，采用完全随机区组设计，单本插种植，种植密度为20cm×15cm，10株1行，每个株系种植6次重复，其中纹枯病接种和非接种试验分别设置2次重复，白叶枯病菌接种2次重复。浅水灌溉，施肥和病虫害防治如同一般大田。
在植株苗期和分蘖盛期，采用剪叶法对每行中间6株接种白叶枯病菌；在分蘖盛期，采用牙签嵌入法对每行中间6株接种纹枯病菌。待纹枯病病情稳定后在田间进行病斑高、剑叶枕高和株高的测量；白叶枯病情稳定时测量病斑长度。考察每行中间的6株，记载抽穗期。
成熟时从中间6株中选择长势均匀一致的3株用于考察产量相关性状，包括单株有效穗、穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率和千粒重，上述指标考察结束后将3株混合脱粒测定单株产量。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
目前，水稻育种实践中尚无筛选既抗纹枯病又白叶枯病育种材料的有效方法。本发明利用生产上使用的品种为轮回亲本，利用地方品种为供体亲本配置回交混合群体，通过严格的人工接种能够有效的发掘种质资源中的有利基因，筛选到既抗纹枯病又白叶枯病的优良株系，为培育多抗性水稻品种提供一种新的技术。
说明书附图
图1蜀恢527和孟关大麻谷及其抗纹枯病株系在苗期和孕穗期对白叶枯病菌GD1358的反应□和■分别代表人工接种时期为苗期和孕穗期
具体实施方式
下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。应当理解，下列实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护范围。应用实例中以蜀恢527为轮回亲本，以孟关大麻谷作为供体亲本，但本发明实际适用本发明采用的亲本以及其它水稻品种为亲本构成的群体。
(1)抗纹枯病优良选择导入系的筛选
以生产上广泛应用的杂交稻恢复系蜀恢527为轮回亲本，以地方品种孟关大麻谷为供体亲本，配制BC2F2混合群体。
2005年春季在中国农业科学院昌平育种基地种植两个群体各400个BC2F2单株，在水稻分蘖末期，采用抛洒稻壳接种法从群体中筛选到41个纹枯病发病程度低于蜀恢527的单株。2005年冬季将41个BC2F3株系种植在海南岛隔离的田块中，设置2个重复，每行10株，在分蘖末期采用牙签嵌入法接种，选择抗病株系；2006年春季在中国农业科学院昌平育种基地对BC2F3个体采用牙签嵌入法接种鉴定，观察株系抗病性的稳定性。
2007年春季，将筛选到的BC2F5各株系种植在安徽农业大学实验基地，采用完全随机区组设计单本插种植，每个株系种植2次重复，其中纹枯病接种和非接种试验分别设置2次重复。采用牙签嵌入法于植株分蘖盛期接种纹枯病菌，考察各株系中间的6株，记载抽穗期。纹枯病病情稳定后在田间进行病斑高、剑叶枕高和株高的测量。成熟时从中间6株中选择长势均匀一致且周围不缺棵的三株用于考察产量相关性状，包括单株有效穗、穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率和千粒重，上述指标考察结束后将三株混合脱粒测定单株产量。
蜀恢527平均相对病斑高度为0.63，孟关大麻谷的平均相对病斑高度为0.47。根据导入系在接种和正常生长条件下与轮回亲本相比较的纹枯病抗性和相对产量表现，将导入系分为4个类型。
T1类型株系纹枯病抗性较轮回亲本有显著提高，在人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件或其中一种条件下与轮回亲本比较产量有显著提高。群体中有1个株系属于这一类型，人工接种纹枯病菌条件下平均相对病斑高度比蜀恢527降低0.17，人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件下平均产量分别比蜀恢527增加3.95t/ha和1.75t/ha。
T2类型株系纹枯病抗性较轮回亲本有显著提高，但在人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件下与轮回亲本比较产量无显著差别。群体中有15个株系属于这一类型，人工接种纹枯病菌条件下平均相对病斑高度比蜀恢527降低0.19。
T3类型株系纹枯病抗性与轮回亲本无显著差别，但在人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件或其中一种条件下产量显著高于轮回亲本。群体中有2个株系属于这一类型，人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件下平均产量分别比蜀恢527增加5.52t/ha和2.33t/ha。
T4类型株系纹枯病抗性与轮回亲本无显著差别，产量在人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件下与轮回亲本相比均无显著差别。群体中有23株系属于这一类型。
表1以蜀恢527为轮回亲本的2个导入系群体的主要农艺性状相对于蜀恢527在人工接种纹枯病菌和正常种植两种条件下的表现
S代表人工接种纹枯病菌，N代表正常生长条件，MGDMG代表孟关大麻谷，Shuhui527代表蜀恢527。*，**和***分别代表t测验中P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001的显著水平。
(2)抗白叶枯病株系筛选
2008年，在中国农业科学院作物科学研究所隔离的网室内种植(1)中筛选到的T1和T2型的16个株系，鉴定上述株系的白叶枯病抗性。
试验设置3个重复，每个重复各株系种植5株。在植株苗期(5叶期)和孕穗期分别采用剪叶法接种我国V型菌的代表菌株GD1358。菌种保存于-80℃的甘油中，接种前在PSA培养基上复壮，挑取单菌落，经毒力测试后保存于4℃。菌株用PSA培养基于28℃培养48h，配制成109/mL菌液用于接种试验。每个植株接种4-5张叶片。接种后14天左右，当叶片病情发展稳定时，测量接种叶片的病班长度，每株调查3张叶片，计算各株系病班长度平均值。根据国际水稻研究所的标准(IRRI，1996)，病斑长度0-5cm、＞5-10cm、＞10-15cm和＞15cm的株系分别为抗病、中度抗病、中度感病和感病。
结果表明，16个株系接种GD1358后，病斑的长度各不相同(表2，图1)。在苗期接种后蜀恢527和孟关大麻谷的病斑长度分别为6.4±1.9cm和12.9±3.0cm，其抗纹枯病后代中有7个株系的病斑长度小于轮回亲本蜀恢527，病斑长度小于5cm的抗病株系数为2个；在孕穗期接种后，蜀恢527和孟关大麻谷的病斑长度分别为16.0±1.1cm和32.4±2.8cm，抗纹枯病后代中有15个株系的病斑长度均小于轮回亲本蜀恢527，病斑小于5cm的抗病株系数为9个。
表2蜀恢527和孟关大麻谷及其抗纹枯病株系在苗期和孕穗期对白叶枯病菌GD1358的反应
从表2中可以看出，在蜀恢527和孟关大麻谷后代中株系6和株系9在苗期和孕穗期都对白叶枯病菌表现抗病，株系6在苗期和孕穗期的病斑长度分别为3.7±2.2cm和3.0±1.3cm，株系9在苗期和孕穗期的病斑长度分别为4.2±1.3cm和4.1±1.7cm。通过(1)和(2)两步筛选，即可获得兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料。
Claims (3)
1.一种兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的选育方法。其特征是以生产上应用的水稻品种为轮回亲本，以地方品种为供体亲本，通过杂交1次回交2次自交2次获得混合群体。采用牙签法连续跟踪接种3次至BC2F4代，筛选纹枯病抗性稳定的株系。考察BC2F4株系的农艺性状，对抗纹枯病BC2F5株系进行白叶枯病抗性鉴定，确定兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料。
2.根据权利要求1所述的兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的选育方法，其特征在于上述方法中所涉及的轮回亲本为生产上应用的优良水稻品种，供体亲本为地方品种。
3.根据权利要求1所述的兼抗纹枯病和白叶枯病水稻育种材料的选育方法，其特征是可以对遗传背景相近的抗病选择导入系进一步进行杂交。
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