CN103205501A - 一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法，该方法包括从野生稻植株上剪取叶片中部并放于放有单层滤纸的培养皿内，每皿加适量的无菌水，在每个叶片上滴入5uL的孢子悬浮液，各接种5个点，并盖上盖子，将培养皿放入23℃的光照培养箱中，黑暗培养24小时，然后光照培养，光照强度为3400Lux/1310Lux(12h/12h)，培养6-7天后调查病情，调查病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病；本发明优化了接种稻瘟病的方法，创立了更简便，大批量的野生稻抗性鉴定方法。解决了因野生稻不育率高、容易落粒，采种困难，且有程度不同的休眠性和发芽生长的不一致性等造成的抗病性鉴定困难的问题。

Description

一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法

技术领域

本发明涉及一种基因的鉴定方法，特别涉及一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法。

背景技术

稻瘟病是全球性的水稻最主要的病害之一，可给水稻造成11％-30％的产量损失，损失稻谷高达数亿公斤，全球每年约值损失1.57亿美元。实践证明，利用抗性品种是防治稻瘟病最经济有效的措施的措施之一，也符合人类绿色食物的要求。然而，由于稻瘟病菌生理小种的多样性和易变性，抗性品种连续使用3-5年后，品种的抗性就会明显衰退。因此，寻找和筛选稳定持久的抗病品种，尤其是从古老的地方品种和野生稻资源中发掘利用持久抗性资源，是防治稻瘟病经济、有效的措施，也是保证稻作稳产、高产的主要途径之一。

无论是常规育种，还是分子育种，研究清楚不同水稻品种所蕴藏的基因和发现它们的新基因是关键的一步。

稻瘟病抗性鉴定的方法有2种：(1)人工接种鉴定。这种方法根据选用菌株的接种方式不同，又可分为①抗谱测定，即多个菌株单个接种鉴定：②多个菌株混合接种鉴定。(2)自然诱发鉴定。人工接种鉴定的优点是接种的菌株是已知的，尤其是抗谱测定能知道被鉴定品种的抗菌株频率和抗哪些小种，这对抗病基因的鉴定、定位、以及抗性品种利用和推广有明确的指导作用，通常作为精细研究时采用人工接种鉴定。自然诱发鉴定通常是在稻瘟病病区设立病圃，发病条件好，叶瘟和穗瘟鉴定都很方便，由于病圃鉴定无论是叶瘟鉴定还是穗瘟鉴定，都是多次连续侵染，因此鉴定的结果准确性高，但它的不足在于田间稻瘟病菌是一种混合群体，鉴定的结果不知道品种抗那些小种和抗谱，通常作为传统的抗病育种和大批量的抗源筛选。

野生稻的抗稻瘟病性鉴定主要是通过对宿根进行分盆种植，并利用其长出的新叶进行鉴定。但可用于移植的宿根很有限，只能满足接种几个稻瘟病菌生理小种的需求。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术中的不足，提供一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法，本发明方法利用离体接种具有方法简便，准确可靠，易于控制温度、湿度等外界环境因素，故在植物抗性鉴定中应用价值较大。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具体步骤：

(4)叶片的取样：在温室中，剪取野生稻和感病对照品种丽江新团黑谷(LTH)的叶片，放入冰盒中保鲜，并带回实验室，把叶片剪成长5cm的片段；

(5)把滤纸放入直径为9cm培养皿中，并加入无菌水2ml，使滤纸变湿；把上述剪好的叶片平置于滤纸上，每个培养皿放置4段叶片；在每个叶片上滴入5uL的孢子悬浮液，各接种5个点，并盖上盖子，放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，每天24小时光照，光照强度3400Lux/1310Lux (12h/12h)，每天观察滤纸湿度，以保持培养皿内的湿度(相对湿度为100％)，培养6-7天后调查发病情况。

(3)发病调查及标准：调查病斑大小，并以LTH为对照品种，判定抗感，病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病。

病斑分级：

0级：无病斑；

1级：深棕色，病斑没有可见的中心

2级：病斑直径为0.1厘米，病斑小，没有显著的中心：

3级：病斑直径为0.2厘米，病斑小，没有显著的中心：

4级：病斑大，形成菌丝和分生孢子。

本发明的优点是：本发明优化了接种稻瘟病菌的方法，创立了更简便、大批量快速的野生稻抗稻瘟病的鉴定方法。解决了因野生稻不育率高、容易落粒，采种困难，且有程度不同的休眠性和发芽生长的不一致性等造成的抗病性鉴定困难的问题，加速了野生稻抗稻瘟病基因的鉴定及利用效率，为水稻抗性基因的发掘和抗性育种提供方法。

具体实施方式

实施例1：

1、供试菌株：采自云南省水稻种植区的2个稻瘟病菌株YNC08-30和YNC08-20。

2、水稻的种植：野生稻(普通野生稻、药用野生稻、疣粒野生稻)3种和感病对照品种丽江新团黑谷(LTH)，LTH在30℃的培养箱内催芽3天后，播于塑料育苗盒(15×5×10cm)内，土壤为灭菌土，每品种一行播5粒，置于24-30℃温室育苗，每盒追施尿素0.2-0.3g，3种野生稻为宿根再生植株，保存于温室。

3、稻瘟病菌株的培养及产孢：用稻谷粉琼脂培养基培菌，菌丝长满培养基表面时，用自来水洗去气生菌丝，置于日光灯下约40小时促其产孢。用蒸馏水洗下孢子，制成孢子悬浮液(孢子浓度5×10⁶个/m)加入适量0.02％Tween-20使，并置于冰上以保持稻瘟病菌孢子的侵染活力。

4、稻瘟病菌接种：

(6)叶片的取样：在温室中，剪取野生稻的心叶，放入冰盒中保鲜，并带回实验室，选取叶片中部，把叶片剪成长5cm的片段；

(7)稻瘟病菌的接种：把滤纸放入直径为9cm培养皿中，并加入无菌水2ml，使滤纸变湿；把上述剪好的叶片平置于滤纸上，每个培养皿放置4段叶片；用10uL的移液枪取5uL前面制备好的稻瘟病菌孢子悬浮液，并点接种于水稻叶片上，每段叶片接种5个点，盖上盖子，放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，12小时光照(光照强度3400Lux/1310Lux)，每天观察滤纸湿度，并加2ml无菌水，以保持培养皿内的湿度(相对湿度为100％)。培养6-7天后调查发病情况。

5、接种后发病调查及标准：

调查接种点的病斑大小，并以LTH为对照品种，判定抗感。调查病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病。

病斑分级：

0级：无病斑；

1级：深棕色，病斑没有可见的中心；

2级：病斑直径为0.1厘米，病斑小，没有显著的中心；

3级：病斑直径为0.2厘米，病斑小，没有显著的中心；

4级：病斑大，并产生菌丝和分生孢子。

Claims (4)

1.一种鉴定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具体步骤：

(1)叶片的取样：在温室中，剪取野生稻和感病对照品种丽江新团黑谷的叶片，放入冰盒中保鲜，并带回实验室，把叶片剪成片段；

(2)把滤纸放入直径为9cm培养皿中，并加入无菌水2ml，使滤纸变湿；把上述剪好的叶片平置于滤纸上，每个培养皿放置4段叶片；在每个叶片上滴入5uL的孢子悬浮液，各接种5个点，并盖上盖子，放入光照培养箱内培养，24-26℃，相对湿度100％，黑暗培养24小时，然后光照培养，每天24小时光照，光照强度分别为3400Lux和1310Lux，每天观察滤纸湿度，以保持培养皿内的湿度(相对湿度为100％)，培养6-7天后调查发病情况，

(3)发病调查及标准：调查病斑大小，并根据对照品种，判定抗感，病级分5级，0-2级的为抗病，3-4级的为感病。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述(1)中把叶片剪成长5cm的片段。

3.如权利要求1所述的方法，其中(2)中光照强度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h。

4.如权利要求1所述的方法，其中(3)中病斑分级为：

0级：无病斑；

1级：深棕色，病斑没有可见的中心

2级：病斑直径为0.1厘米，病斑小，没有显著的中心：

3级：病斑直径为0.2厘米，病斑小，没有显著的中心：

4级：病斑大，形成菌丝和分生孢子。