CN104450536B - 一种丛枝菌根真菌的分离、菌剂制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种丛枝菌根真菌的分离、菌剂制备及其应用，属于生物技术领域；丛枝菌根真菌是发明人自土壤中分离的丛枝菌根真菌根内根生囊霉并命名为丛枝菌根真菌根内根生囊霉CD‑1(Rhizophagus irregularis CD‑1)，鉴定其核糖体28S rDNA的特异序列如SEQ ID NO.1所示，利用该真菌制备获得的菌剂，可以提高番茄的株高、叶柄数、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重，以及可显著促进菌根侵染率>80％的玉米自交系株高、地上部鲜重、地上部干重，并提高玉米对纹枯病的抗性，具有极高的遗传性利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种丛枝菌根真菌的分离、菌剂制备及其应用，属于生物技术领域，提供了一种从土壤中分离的丛枝菌根真菌根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis CD-1)、及其菌剂的制备方法和在玉米和番茄上的应用。
背景技术
丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)是属于Gtomeromycota门的土壤有益真菌,与约80％的陆生植物根系间形成互惠共生体丛枝菌根(ArbuscularMycorrhiza，AMF)。植物与AMF的共生互作关系主要表现在:AMF从植物根系中获得碳水化合物来维持自身的生长和完成生活史，但同时可促进植物吸收水分和矿质营养，并能增强植物对生物和非生物胁迫的耐受性，进而促进宿主植物的生长发育，提高植物耐盐、耐旱、耐重金属和抗病能力。
目前AMF的培养方法主要有盆栽培养法、培养基培养法、玻璃珠分室培养法、离体无菌纯培养、AMF与植物根器官的双重无菌培养法、AMF与Ri T-DNA转型根的双重单胞无菌培养法等。盆钵培养法和雾化培养法为用于商业化生产的主要方法，AMF的离体双重培养方法是获得AMF纯净体和研究AMF遗传、生理、生化等特性的理想方法，但目前还未获得商业化的生产方法。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种丛枝菌根真菌的分离、菌剂制备及其应用；这种真菌是发明人自土壤中分离的丛枝菌根真菌根内根生囊霉，鉴定其核糖体28S rDNA的特异序列如SEQ ID NO.1所示，利用该真菌制备获得的菌剂，可以提高番茄的株高、叶柄数、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重以及可显著促进菌根侵染率>80％的玉米自交系株高、地上部鲜重、地上部干重，具有极高的遗传性利用价值。
发明人首先提供了一种土壤中分离的丛枝菌根真菌，根据其形态学和分子生物特征，将其命名为丛枝菌根真菌根内根生囊霉CD-1(Rhizophagus irregularis CD-1)，发明人对其进行了生物保藏，其保藏号为CCTCC NO M2014532，验证结果为存活；
其核糖体28S rDNA的特异序列如SEQ ID NO.1所示，并利用Rhizophagusirregularis CD-1与Ri T-DNA胡萝卜根双重培养的方法，得到大量Rhizophagusirregularis CD-1的孢子和菌丝，并以此制备成高纯度的AMF菌剂。
发明人进一步的将该菌剂应用到番茄、玉米上，调查了该真菌的促生效果。在番茄上发现Rhizophagus irregularis CD-1可侵染各种供试番茄品种，番茄根部观察到丛枝菌根真菌的各种形态，包括泡囊、菌丝、孢子和丛枝，根系菌根侵染率都达到90％以上，并且品种间侵染率没有显著差异。测定番茄接种丛枝菌根后各种农艺性状指标，结果表明AM真菌能显著提高番茄的株高、叶柄数、地上鲜重、地上干重、根鲜重和根干重，番茄的菌根依存度都达到55％以上。在玉米上发现八个玉米自交系同Rhizophagus irregularis CD-1都可共生，但菌根侵染率差异很大。Rhizophagus irregularis CD-1可显著促进菌根侵染率>80％的玉米自交系株高、地上部鲜重、地上部干重，而对菌根侵染率≤15％的玉米自交系的促生效果不显著。玉米B73接种Rhizophagus irregularis CD-1后可显著提高玉米对玉米纹枯病菌的抗性。
综上所述，可见该Rhizophagus irregularis CD-1可促进供试番茄苗期的生长发育，促进根系侵染率较高玉米的生长发育，还可以提高玉米B73对玉米纹枯病菌的抗性。
保藏信息
保藏时间：2014年10月30日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC NO：M2014532
保藏单位地址：中国 武汉 武汉大学
分类命名:丛枝菌根真菌根内根生囊霉CD-1(Rhizophagus irregularis CD-1)
附图说明
图1为丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis CD-1的形态图，
图中为丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis CD-1孢子和菌丝的形态图，
其中h为菌丝，s为孢子；
图2为接种和未接种Rhizophagus irregularis CD-1的番茄根系形态图；
图中A为未接种的对照；B、C、D为菌根化的番茄根系，其中eh为外生菌丝，ih为内生菌丝，ar为丛枝，v为泡囊，s为孢子；
结果表明，在接种AMF的番茄根系中可观察到AMF的形态，包括泡囊、菌丝、孢子和丛枝，可见Rhizophagus irregularis CD-1与番茄形成了良好的共生体系；而不接种在接种Rhizophagus irregularis CD-1的番茄根系未见AMF的形态；
图3为AMF对不同番茄品种的侵染率柱状图；
图中差异显著性用Duncan新复极差测验，不同字母表示p＜0.01水平上差异极显著。non-AMF：未接种AMF的番茄品种；五种番茄品种为黄五彩番茄、花玫瑰水果番茄、紫圣女番茄、黄美人、金黄一点红，分别用以下编号表示：Z3、Z11、Z30、Z33、Z34。
结果表明R.irregularis CD-1对五种番茄的侵染率都很高，侵染效率在90.5％—98.5％之间，番茄品种间菌根侵染效率差异不显著；五种番茄品种间形成泡囊或产生菌丝(包含丛枝结构)的根段数各不相同，其中Z3、Z11、Z33、Z34更易形成泡囊，而Z30的泡囊率和菌丝率差异不大，图中差异显著性用Duncan新复极差测验，不同字母表示p＜0.01水平上差异极显著；
图4为番茄植株整体长势图；
图中五种番茄品种为黄五彩番茄、花玫瑰水果番茄、紫圣女番茄、黄美人、金黄一点红，分别用以下编号表示：Z3、Z11、Z30、Z33、Z34A：Z3；B：Z11；C：Z30；D：Z33；E：Z34；－：未接种AMF；+：接种AMF；
结果表明接种R.irregularis CD-1后，可显著促进番茄植株的生长；与未接种AMF的对照相比，经AMF处理的番茄植株长势更好，株高整体更高；
图5为AMF对番茄生长的影响图；
图中五种番茄品种为黄五彩番茄、花玫瑰水果番茄、紫圣女番茄、黄美人、金黄一点红，分别用以下编号表示：Z3、Z11、Z30、Z33、Z34图中：*表示显著水平0.05，**表示极显著水平0.01；-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF；
结果表明与未接种AMF相比，接种AMF的番茄的株高、叶柄数、根冠比、地上鲜重、地上干重、根鲜重、根干重都有显著或极显著性的增加(P<0.05为显著，P<0.01为极显著)；
图6为番茄对菌根的依存度图；
图中五种番茄品种为黄五彩番茄、花玫瑰水果番茄、紫圣女番茄、黄美人、金黄一点红，分别用以下编号表示：Z3、Z11、Z30、Z33、Z34，差异显著性用Duncan新复极差测验，不同字母表示P＜0.05水平上差异显著；
结果表明五种番茄对R.irregularis的依存度存在差异，但依存度都达到55％以上，其中Z33的菌根依存度最高，达到72.11％。5种番茄菌根依存度高低顺序为：Z33＞Z30＞Z34＞Z3＞Z11，菌根依存度越高，番茄对AMF的依赖性越强；
图7为AMF对不同玉米自交系株高的影响图；
图中-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF,**表示极显著水平0.01；
结果显示根系侵染率>80％的几个玉米自交系，如GEMS63、CIMBL21、ZZ03、CIMBL1、GEMS13，接种丛枝菌根真菌后的株高显著高于未接种的植株的株高；而接种丛枝菌根真菌则对根系侵染效率≤15％的玉米自交系的株高没有显著的促进作用；
图8为AMF对不同玉米自交系地上部鲜重的影响图；
图中-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF,*表示显著水平0.05，**表示极显著水平0.01；
统计分析发现，根系侵染率>80％的几个玉米自交系，接种丛枝菌根真菌的地上部分鲜重显著大于未接种的植株的地上部分鲜重；而接种丛枝菌根则对根系侵染效率≤15％的玉米自交系的地上部分鲜重没有显著的促进作用；
图9为AMF对不同玉米自交系根部干重的影响图；
图中-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF,*表示显著水平0.05；
结果表明根系侵染率>80％的几个玉米自交系，接种丛枝菌根真菌的地上部分干重显著大于未接种的植株的地上部分干重；而接种丛枝菌根真菌则对根系侵染效率≤15％的玉米自交系的地上部分干重没有显著的促进作用；
图10为AMF对不同玉米自交系根部鲜重的影响图；
图中-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF；
结果表明接种丛枝菌根对所有供试玉米自交系的根鲜重都没有显著的促进作用；
图11为AMF对不同玉米自交系根部干重的影响图；
图中-AMF：未接种AMF；+AMF：接种AMF；
结果表明接种丛枝菌根对所有供试玉米自交系的根干重都没有显著的促进作用。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；
实施例1：丛枝菌根真菌R.irregularis CD-1的分离鉴定
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，从山东省泰安市山东农业大学实验田采集玉米地的土样，阴干后采用湿筛倾注法(郭秀珍,毕国昌.林木菌根及应用技术.北京:中国林业出版社,1989.216-220)从土样中分离到丛枝菌根真菌的孢子，然后在解剖镜下用解剖针挑选孢子。以传统的形态学和PCR为基础的现代技术相结合，对AMF孢子进行分类鉴定。在体视显微镜下根据孢子的形态特征进行分类，挑选出具备丛枝菌根真菌特征的孢子。
对挑选出的具备丛枝菌根真菌特征的孢子提取基因组DNA，以之为模板进行PCR，扩增28S rDNA的序列，PCR采用AMF特异性引物LR15-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，和8.225-AACTCCTCACGCTCCACAGA-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
反应程序如下：预变性93℃3min，变性93℃1min，退火62℃1min，延伸72℃1min，反应30个循环，后延伸72℃10min(郑世学,董秀丽,喻子牛,赵斌.以新鲜根段进行AMF的分子检测及竞争性侵染研究[J].菌物学报,2004,23(1)：126-132.)；结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成，序列为SEQ ID NO.1。随后在http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/上进行检索，发现目的片段与Rhizophagus irregularisDAOM181602的28s rRNA的DNA序列(HF968923)相似度最高，达到99％，两者之间有3个碱基的差异，最终确定分离物为丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis，我们对这一丛枝菌根分离物命名为丛枝菌根真菌根内根生囊霉CD-1(Rhizophagus irregularis CD-1)，发明人对其进行了生物保藏，其保藏号为CCTCC NO M2014532，验证为存活。
实施例2：丛枝菌根真菌与Ri T-DNA胡萝卜根的双重培养和AMF菌剂的制备
本发明使用将分离得到Rhizophagus irregularis CD-1的孢子经表面消毒后与发根农杆菌诱导出细胞中整合有Ri T-DNA胡萝卜根放到M培养基上(G.,andJ.A.FORTIN.Early events of vesiculararbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots.New Phytologist,1988,108:211218；St-Arnaud M,Hamel C,Vimard B,Caron M,Fortin JA.Enhanced hyphal growth and spore production of thearbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices in an in vitro system inthe absence of host roots.Mycol Res,1996,100:328332；毕银丽,李晓林,汪洪钢.VA菌根真菌对转移Ri T-DNA胡萝卜根器官的侵染[J].植物营养与肥料学报,1999,5(1)：76-80；毕银丽，汪洪钢，李晓林.丛枝菌根的双重培养方法及其菌丝际的建立.菌物系统,2000，19(4):517-521)，待培养基上看到菌丝、孢子时将胡萝卜菌根用双重无菌培养法培养Rhizophagus irregularis CD-1的孢子和菌丝，
制备AMF菌剂，具体方法如下：
(1)配制含蔗糖和不含蔗糖的M培养基，121℃高压蒸汽灭菌8min，待培养基温度降至约50℃时，在无菌条件下，将含有蔗糖的M培养基倒入有隔板的培养皿的一侧，厚度不要超过隔板，而不含蔗糖的M培养基倒入另一侧，厚度基本与隔板持平。
(2)将Rhizophagus irregularis CD-1与胡萝卜的共生体转入有蔗糖的M培养基的一侧，18℃黑暗培养。
(3)随着胡萝卜根的生长，部分根会越过隔板，在无蔗糖侧AMF的菌丝、孢子得以大量繁殖。大约2-3个月在无糖侧出现大量的菌丝和孢子，待孢子颜色变暗后，将无糖侧培养皿中的胡萝卜根用镊子去除，收集无糖侧的孢子和菌丝，以约100mL灭菌的蒸馏水/皿的比例，用榨汁机充分破碎，以制备孢子悬浮液。将所有孢子悬浮液收集到一起，用抽样调查法计算孢子悬浮液中孢子的浓度。
AM菌剂制备完成，主要的侵染物包含孢子、菌丝，一个直径为9厘米的培养皿大约可以产出20000个孢子。常用的AM菌剂为含供试菌种孢子、被侵染根段及根外菌丝的土壤混合物，不方便测定孢子的数量，而我们制备的AM菌剂为纯的Rhizophagus irregularis CD-1的孢子和菌丝，孢子的数量可以简单测定。
实施例3：丛枝菌根真菌对五种番茄生长发育的影响
为了测定丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis CD-1对番茄的生长发育有何种影响，我们以五种不同番茄品种为材料，通过盆栽试验接种Rhizophagus irregularisCD-1，研究不同番茄品种与AMF的共生效率，以及AMF对五种番茄品种的促生作用。
(1)育苗基质的准备
育苗基质为蛭石、草炭、珍珠岩以3:4:4的体积比混合所得，育苗基质于121℃灭菌30min，自然冷却至室温时，装入体积为600cm3的钵子中，在钵子的3/4处接种含900个孢子的AMF菌剂，之后用育苗基质填满钵子；同时以育苗基质中接种等量水为对照。
(2)供试植物的处理
番茄种子用70％酒精浸泡1分钟后用蒸馏水洗净，28℃催芽。将催芽的番茄种子种于钵子中，每个钵子2粒种子，最后每个钵子留一棵长势一致的番茄，每个处理重复8次。每个番茄品种的对照与处理放于不同的托盘中。植株于日光温室内进行培养，3天浇一次水。
(3)测量指标
番茄种植2个月后处理番茄植株。用常规方法测定番茄的株高、叶柄数、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重等。番茄根系剪成约1cm根段，用台盼蓝染色(Phillips J M,Hayman D S.Improved procedures for clearing roots and stainingparasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment ofinfection[J].Transactions of the British mycological Society,1970,55(1):158-161)后随机选取50段根段，在光学显微镜下观察丛枝菌根真菌的结构。镜检后通过频率标准法(Kormanik P P，McGraw A C.Quantification of vesicular-arbuscularmycorrhizae in plant roots[J].In Methods and Principles of MycorrhizalResearch(Ed.by N C Schenck).AMFerican Phytopathological Society,St Paul,Minnesota,1982:37-45)计算根系侵染率，根系侵染率(％)＝被侵染的根段数/检测根段数×100％，泡囊侵染率(％)＝含泡囊的根段数/检测根段数×100％，菌丝侵染率(％)＝含菌丝或丛枝的根段数/检测根段数×100％。菌根依存度按下式计算：菌根依存度(％)＝(接种处理干重—不接种处理干重)/接种干重×100(Takacs T,Voros I.Effect of metal non-adapted arbuscular mycorrhizal fungi on Cd,Ni and Zn uptake by ryegrass[J].Acta Agronomica Hungarica,2003,51(3):347-354)。
分析结果表明，接种两个月后，五种番茄都能与供试真菌建立共生关系，在番茄根部观察到丛枝菌根真菌的各种形态，包括泡囊、菌丝、孢子和丛枝，根系菌根侵染率都达到90％以上，并且品种间侵染率没有显著差异(如图2、3所示)。
接种Rhizophagus irregularis CD-1后，调查发现该真菌能显著促进番茄植株的生长(如图4所示)。与未接种AMF的对照相比，经AMF处理的番茄植株长势更好，株高整体更高。
本试验发现与未接种AMF相比，接种AMF的番茄的株高、叶柄数、根冠比、地上鲜重、地上干重、根鲜重、根干重都有显著或极显著性的增加(P<0.05为显著，P<0.01为极显著，如图5所示)。经AMF处理的不同番茄品种的植株高度提高0.70倍—1.05倍，其中Z34受AMF的影响最为明显，提高到2.05倍，但这五个番茄品种之间提高的倍数差异不大。AMF极显著性增加了番茄的叶柄数，经AMF处理的番茄植株叶柄数比对照组多出2—4个。
AMF极显著性增加了番茄的地上鲜重，与对照组相比，经AMF处理的番茄植株地上鲜重提高1.56倍—2.12倍，Z30、Z34这两个品种受AMF的影响尤为明显，地上鲜重都提高了2倍以上。AMF极显著性增加了番茄的地上干重，而经AMF处理的番茄植株地上干重提高1.33倍—2.22倍，其中Z34提高到2.99倍，Z30提高到3.22倍，这两个品种受到AMF的影响尤为明显。AMF极显著性增加了番茄的根鲜重，与对照组相比，经AMF处理的番茄植株根鲜重提高0.98倍—3.80倍，其中Z33提高到4.80倍，受到AMF的影响尤为明显。AMF极显著性增加了Z3、Z30、Z33的根干重，而显著性增加了Z11、Z34的根干重，与对照组相比，经AMF处理的番茄植株根干重提高1.28倍—9倍，其中Z33提高9倍，受到AMF的影响最为明显。
以上结果说明丛枝真菌Rhizophagus irregularis CD-1可以与不同的番茄品种都能形成良好的共生关系，且显著促进番茄植株生长和发育，具有良好的应用价值。现有技术中，接种丛枝菌根真菌促生效果最好的为番茄品种中杂9接种G.intraradices后，同对照相比植株生物量提高45.1％(贺忠群,李焕秀,汤浩茹.不同AMF对番茄养分吸收及果实品质的影响[J].北方园艺,2010(9):8-10.)，而本试验中接种AMF后，所测试番茄品种地上部分干重提高了1.33倍—2.22倍，可见显著优于前人分离的丛枝菌根真菌对番茄的促生效果。
实施例4：丛枝菌根真菌对八种玉米自交系生长发育的影响
为了测定丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis CD-1对玉米生长发育的影响，我们以8种不同玉米自交系品种为材料，通过盆栽试验接种Rhizophagus irregularis CD-1，研究不同玉米品种与AMF的共生效率，以及AMF对玉米自交系的促生作用。
培养基质为育苗基质与土以1：1比例混合后，121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却至室温时，装入体积为1000cm3的钵子中，在钵子的3/4处接种含1000个孢子的AMF菌剂，之后用育苗基质填满钵子。同时以育苗基质中接种等量水为对照。
玉米种子用70％酒精浸泡1分钟后用蒸馏水洗净，28℃催芽。将催芽的番茄种子种于钵子中，每个钵子5粒种子，最后每个钵子留3棵长势一致的玉米，每个处理重复9次。对照与处理放于不同的位置。植株于日光温室内进行培养，3天浇一次水。
玉米种植2个月后用常规方法测定番茄的株高、叶柄数、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重等。玉米根系剪成约1cm根段，用台盼蓝染色后随机选取50段根段，在光学显微镜下测定丛枝菌根真菌的侵染率。
结果发现Rhizophagus irregularis CD-1可侵染八种玉米自交系，根系菌根侵染率各不相同(如表1)。
表1 AMF对不同玉米自交系的侵染率
结果显示同未接种丛枝菌根真菌的玉米自交系相比，根系侵染率>80％的几个玉米自交系，如GEMS63、CIMBL21、ZZ03、CIMBL1、GEMS13，丛枝菌根真菌显著或极显著的提高了玉米自交系的株高、地上部鲜重、地上部分干重高于未接种的植株的对应指标，而丛枝菌根真菌对根系侵染效率≤15％的玉米自交系的株高没有显著的促进作用(如图7、8、9)。丛枝菌根对所有供试玉米自交系的根鲜重、根干重都没有显著的促进作用(如图10、11)。
实施例5：丛枝菌根真菌对玉米B73抗玉米纹枯病菌的影响
培养基质为育苗基质与土以1：1比例混合后，121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却至室温时，装入体积为1000cm3的钵子中，在钵子的3/4处接种含2040个孢子的AMF菌剂，之后用育苗基质填满钵子。同时以育苗基质中接种等量水为对照。
玉米B73种子用70％酒精浸泡1分钟后用蒸馏水洗净，28℃催芽。将催芽的番茄种子种于钵子中，每个钵子5粒种子，最后每个钵子留3棵长势一致的玉米，每个处理重复5次。对照与处理放于不同的托盘中。植株于日光温室内进行培养，3天浇一次水。玉米种植一个月后对第三叶鞘用牙签法接种YWK196，半个月后测定植株发病情况和根系侵染情况。
结果发现接种YWK196后，玉米的第三叶鞘全部枯死，同时R.irregularis CD-1可侵染玉米B73，并且极显著提高玉米对YWK196的抗性(如表2)。
表2 丛枝菌根真菌对提高玉米纹枯病抗性影响
注：Duncan新复极差测验，不同字母表示p＜0.01水平上差异极显著。
Claims (4)
1.一种丛枝菌根真菌，命名为丛枝菌根真菌根内根生囊霉(Rhizophagusirregularis)CD-1，其保藏号为CCTCC NO M2014532，其核糖体28S rDNA的特异序列如SEQID NO.1所示。
2.一种菌剂，其特征在于含有权利要求1所述丛枝菌根真菌。
3.权利要求2所述菌剂在番茄和玉米上促生中的应用。
4.权利要求2所述菌剂在对抗玉米纹枯病中的应用。
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| HF968923.1;Thiery,O. 等;《Genbank》;20140620;序列表 * |
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