CN106034733A

CN106034733A - 一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法和应用

Info

Publication number: CN106034733A
Application number: CN201610372699.3A
Authority: CN
Inventors: 孙锦; 吴亚胜; 郭世荣; 张�杰; 靳露; 束胜; 吴建强; 李舒展
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2016-10-26

Abstract

本发明公开了一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法和应用。向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中添加亚精胺。本发明通过大量实验发现通过在含有丛枝菌根真菌的基质中添加特定浓度范围的亚精胺，能够增强丛枝菌根真菌的侵染率、活性和增殖速率，促进宿主植物与菌根形成共生体，从而提高AMF的使用效果。

Description

一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域方面，具体涉及一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法和应用。

背景技术

丛枝菌根是一类由土壤微生物—丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizalfungi，AMF)与维管束植物根系形成的一种互惠共生体。它通过与植物根系结合增加了根系的吸收表面积，菌丝分泌的螯合物还有利于难利用元素特别是P的降解利用。AMF共生后可以不同方式和途径影响植物的代谢过程，能够促进植物生长、改善根际环境、通过延长的菌丝提高植物对矿质营养的吸收、提高植物耐受逆境的能力、保护根系、抵御其他有害微生物对植物的侵害，同时能够提高作物的产量和品质。

蔬菜生产中工厂化穴盘育苗技术能够提高育苗生产效率，其秧苗具有质量好、移栽缓苗快和操作简便等特点，为蔬菜生产向产业化方向发展起到了积极的作用。在蔬菜育苗基质中添加丛枝菌根真菌，通过育苗形成菌根化苗后再移至大田或温室，可以更加充分地发挥丛枝菌根真菌的作用。但是，现有的育苗基质主要是用草炭、蛭石等天然基质为主要原料混配而成，基质中有机质和养分含量较高。在此情况下，AMF活性较低、侵染状况差，影响宿主植物高效菌根共生体的建立。因此，寻求一种既有利于AMF侵染、增强AMF活性又不影响蔬菜幼苗生长的物质来调节丛枝菌根真菌的使用效果具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法。

本发明的另一目的在于提供一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质及其应用。

本发明的又一目的在于提供一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率基质的制备方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法，向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中添加亚精胺。

上述的方法，其在于以添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质的体积为基准，所述亚精胺添加量优选为0.05～0.3mg/m³，进一步优选为0.25mg/m³。

一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质，其在于它包括添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质和亚精胺，以添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质的体积为基准，所述的亚精胺的添加量优选为0.05～0.3mg/m³，进一步优选为0.25mg/m³。

上述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质，其在于所述的有机基质包括按照1～2:1～2:1:1的体积比复配的泥炭、椰糠、蛭石和珍珠岩；按体积百分含量计，所述的丛枝菌根真菌孢子悬浮液在所述有机基质中的添加量优选为0.05～1％，进一步优选为0.09％。

进一步优选的，所述的有机基质进一步优选为包括按照2:2:1:1的体积比复配的泥炭、椰糠、蛭石和珍珠岩。

一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率基质的制备方法，先将泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩经高压灭菌后按照1～2:1～2:1:1的体积比复配得到有机基质；按体积百分含量计，再向有机基质中添加0.05～1％的丛枝菌根真菌孢子悬浮液，混合均匀；最后向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中加入0.05～0.3mg/m³亚精胺即得所述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和侵染率的基质。

上述丛枝菌根真菌孢子悬浮液的菌含量≥10⁸CFU/L。

上述的丛枝菌根真菌优选为地表球囊霉。

上述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质在促进蔬菜生长中的应用。

所述的蔬菜为瓜果类蔬菜；优选为黄瓜。

所述的丛枝菌根真菌孢子悬浮液优选通过以下方法制备：接种丛枝菌根真菌于PDA培养基，28℃150r/min，光暗交替培养，待培养基悬浮液长出明显菌丝，变为黄棕色，采用灭菌后的纱布过滤，收集孢子悬浮液(4.35×10⁸CFU/L)。

本发明的有益效果：

多胺(polyamine，PAs)是一类广泛存在于原核生物和真核生物中的生物活性物质，是一类低分子脂肪族含氮碱。高等植物中常见的多胺有腐胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)等。曾经认为多胺可能是一类新的植物激素，近年来，许多研究者认为多胺是激素作用的媒介或类似于cAMP那样的“第二信使”，调节植物的生长和发育。随着对多胺研究的不断深入，特别是近年来转基因等分子生物学手段的应用，认识到多胺在植物体内能影响DNA、RNA和蛋白质的生物合成，促进生长和发育，延迟衰老，提高抗逆性，甚至与植物的生存密切相关。

利用多胺增强丛枝菌根真菌的侵染率、活性和增值速率的方法尚未见报道。因此，本发明专利通过大量实验发现在含有丛枝菌根基质中添加特定浓度的亚精胺(Spd)，能够增强基质中丛枝菌根真菌的侵染率、活性和增值速率，促进宿主植物与菌根形成共生体，从而提高AMF的使用效果。

具体实施方式

为了实现本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，现结合以下具体的实施方案对基质配比、丛枝菌根真菌的添加量、亚精胺的添加量等做进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施仅仅用以解释发明，并不用于限定本发明。

本实施提供的一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法和应用，具体如下：

1.材料准备

本发明的纯化丛枝菌根真菌菌种为：地表球囊霉(Glomus versiforme)，供试菌种由青岛农业大学刘润进教授提供。本实施例以纯化丛枝菌根真菌菌种地表球囊霉(Glomusversiforme，简称为V菌，BGC编号：YN05，资源平台编号：1511C0001BGCAM0013)为例说明本发明的技术内容，但不因此限定本发明的保护范围；所有的丛枝菌根真菌均适用于本发明。

丛枝菌根真菌的培养：

采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA)进行培养：200g马铃薯去皮洗净，切块，水煮30min，纱布过滤，加20g葡萄糖，蒸馏水定容到1L，分装，121℃灭菌20min。孢子悬浮液：接种真菌于装有100ml PDA的250ml锥形瓶中，28℃150r/min，光暗交替培养，待培养基悬浮液长出明显菌丝，变为黄棕色，采用灭菌后的纱布过滤，收集丛枝菌根真菌孢子悬浮液(4.35×10⁸CFU/L)。

亚精胺(Spd)由药品市场购得，产品纯度为99.9％；黄瓜品种为盐敏感型的“津春2号”，种子由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所购得。

复配基质材料为泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩，均由镇江培蕾基质科技发展有限公司购得。其中，泥炭容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH5.0～7，EC为0.1～5mS·cm^-1；椰糠容重为0.1～0.25g·cm^-3，pH4.5～6，EC为1.3～3.6mS·cm^-1；蛭石容重为0.1～0.5g·cm^-3，pH6.8～8.0；珍珠岩容重为0.08～0.2g·cm^-3，pH7.0～7.5。

2.试验方法

黄瓜种子分别采用10％的次氯酸钠溶液表面消毒5～10min，然后在55℃温水中处理15min，然后在30℃的温水中浸种8h，之后置于28℃的恒温箱中催芽，湿度80％，保持黑暗，直至发芽。

制备增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率基质：先将泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩经高压灭菌后按照2:2:1:1的体积比复配得到有机基质；按体积百分含量计，再向有机基质中添加0.09％的丛枝菌根真菌孢子悬浮液，混合均匀；最后向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中添加不同浓度的亚精胺，设置0.05mg/m³、0.1mg/m³、0.15mg/m³、0.2mg/m³、0.25mg/m³、0.3mg/m³六个浓度梯度。首先，配制1mg/L的亚精胺母液，然后用喷壶在1立方米的基质中分别添加50mL、100mL、150mL、200mL、250mL、300mL的溶液，以保证丛枝菌根基质与亚精胺母液充分混合。

待种子萌发，选取饱满、发芽整齐一致的种子播种于装有混配基质(含有丛枝菌根真菌和亚精胺)的50孔穴盘中，每穴一粒。播种完成后，将穴盘置于光照良好的温室中，不定期补充基质中的水分，营造适于黄瓜幼苗生长的环境。

待黄瓜植株生长4周后，用清水将幼苗根部的基质冲洗干净，测定植株的生长指标、根系活力和菌根侵染率。分析不同浓度的亚精胺对丛枝菌根真菌使用效果的影响，筛选出能够增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的适宜亚精胺添加量。

设置不添加丛枝菌根真菌和亚精胺的基质、添加丛枝菌根真菌的基质、添加亚精胺的基质、同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺的基质4个处理，进行黄瓜栽培试验，测定生长指标和根系活力和菌根侵染率，用这些指标来判断亚精胺和丛枝菌根真菌对黄瓜幼苗生长以及根系活力和菌根侵染率的影响，目的在于分析多胺对丛枝菌根真菌使用效果的影响。

3.实验结果与分析

结果表明(表1)，在丛枝菌根真菌基质中，随着亚精胺添加量的增加，黄瓜的各生长指标均呈增加的趋势。当亚精胺的添加量为0.25mg/m³时，黄瓜幼苗的株高、茎粗、地上部鲜重、叶面积值最大；亚精胺添加量进一步增大，黄瓜幼苗的各生长指标有明显下降，但仍高于未添加亚精胺的处理(对照)。

表1基质添加不同用量的亚精胺对黄瓜幼苗生长的影响

进一步对对照(不添加丛枝菌根真菌和亚精胺)、添加丛枝菌根真菌、添加亚精胺、同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺4个处理对黄瓜幼苗生长的影响进行分析。结果表明(表2)，与对照相比，基质中添加丛枝菌根真菌和亚精胺处理的黄瓜幼苗，生长指标明显提高，并且同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺处理的黄瓜幼苗均显著高于对照、单独添加亚精胺和单独添加丛枝菌根真菌处理。

表2丛枝菌根真菌和亚精胺对黄瓜幼苗生长的影响

进一步对对照(不添加丛枝菌根真菌和亚精胺)、添加丛枝菌根真菌、添加亚精胺、同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺4个处理对黄瓜幼苗生长的影响进行分析。结果表明(表3)，与对照相比，基质中添加丛枝菌根真菌和亚精胺处理的黄瓜幼苗，根系活力和菌根侵染率、叶绿素a、叶绿素b的含量也明显提高，并且同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺处理的黄瓜幼苗均显著高于对照、单独添加亚精胺和单独添加丛枝菌根真菌处理。

表3丛枝菌根真菌和亚精胺对黄瓜幼苗根系活力、菌根侵染率以及叶绿素含量的影响

上述试验表明，在体积比为0.09％丛枝菌根真菌的育苗基质中添加浓度为0.25mg/m³的亚精胺溶液，显著促进了黄瓜幼苗的生长、菌根侵染率和根系活力；并且同时添加丛枝菌根真菌和亚精胺处理的黄瓜幼苗的生长指标、根系活力和菌根侵染率均显著高于对照、单独添加亚精胺和单独添加丛枝菌根真菌处理，说明亚精胺可通过增强丛枝菌根真菌的活性，提高了使用效果，从而促进了黄瓜幼苗的生长。

上述试验只为说明本发明的技术构思及特点，主要目的是为了公布出一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法，让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种利用多胺增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的方法，其特征在于向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中添加亚精胺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于以添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质的体积为基准，所述亚精胺添加量为0.05～0.3mg/m³，优选为0.25mg/m³。

3.一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质，其特征在于它包括添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质和亚精胺，以添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质的体积为基准，所述的亚精胺的添加量为0.05～0.3mg/m³，优选为0.25mg/m³。

4.根据权利要求3所述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质，其特征在于所述的有机基质包括按照1～2:1～2:1:1的体积比复配的泥炭、椰糠、蛭石和珍珠岩；按体积百分含量计，所述的丛枝菌根真菌孢子悬浮液在所述有机基质中的添加量为0.05～1％，优选为0.09％。

5.根据权利要求4所述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质，其特征在于所述的有机基质包括按照2:2:1:1的体积比复配的泥炭、椰糠、蛭石和珍珠岩。

6.一种增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率基质的制备方法，其特征在于先将泥炭、椰糠、蛭石、珍珠岩经高压灭菌后按照1～2:1～2:1:1的体积比复配得到有机基质；按体积百分含量计，再向有机基质中添加0.05～1％的丛枝菌根真菌孢子悬浮液，混合均匀；最后向添加了丛枝菌根真菌孢子悬浮液的有机基质中加入0.05～0.3mg/m³亚精胺即得所述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和侵染率的基质。

7.权利要求1～6任意一项中所述的丛枝菌根真菌孢子悬浮液的菌含量≥10⁸CFU/L。

8.权利要求1～6任意一项中所述的丛枝菌根真菌为地表球囊霉。

9.权利要求3～5任一项所述的增强丛枝菌根真菌侵染率、活性和增殖速率的基质在促进蔬菜生长中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的蔬菜为瓜果类蔬菜：优选为黄瓜。