CN104357367B - 一种降解邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯的菌株及其在烟草种植中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降解邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯的菌株及其在烟草种植中的应用,属于农业生物技术应用领域。本发明的微生物菌株为嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)zh‑x‑08菌株,于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号:CGMCC No.8075。本发明的菌株经发酵后得到发酵液,发酵液以适宜的比例添加烟草根际中可明显降低烟草根系自毒物质邻苯二甲酸二(2‑乙基己基)酯的含量,促进烟株生长。

Description

一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株及其在烟草种 植中的应用
技术领域:
本发明涉及一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株及其在烟草种植中的应用,属于农业生物技术应用领域。
背景技术:
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP]是酞酸酯类化合物(phthalic acid esters,PAEs)中最为常用的一种,作为增塑剂应用于生产聚氯乙烯树脂(PVC)。PAEs全球年产量约为600万T,DEHP产量约占PAEs总量的(80-85)%,在终端产品中含量可达到75%左右。塑料制品的广泛应用,使PAEs成为全球最普遍的环境有机污染物。
环境介质中存在的DEHP极少部分源于自然,绝大多数源自人类活动的释放。塑料制品在使用和处理过程中释放出DEHP能污染大气、水体、土壤以及食物等,DEHP已成为水体和土壤中最常被检出的内分泌干扰素类优控有机污染物,多年前就有在包括人体在内的很多生物体中均有被检出的报道。
DEHP在环境中化学性质稳定,难被降解,具有生物积累效应(聂湘平, 李桂英, 吴志辉, 等. 4 种酞酸酯在龙须菜-篮子鱼食物链中的积累放大研究[J]. 海洋科学, 2008,32(1): 19-23.)。土壤中的DEHP不仅影响植物的生理代谢,降低产质量,而且还抑制植物种子萌发和幼苗生长,是一种较为典型的化感物质,并可被吸收积累于植物体内,通过食物链传递。土壤中的DEHP能够降低蚯蚓的体重,且下降程度与土壤中DEHP浓度呈现线性相关(陈强, 孙红文, 王兵, 等. 邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)对土壤中微生物和动物的影响[J].农业环境科学学报, 2004, 23(6): 1156-1159.)。动物实验表明,DEHP能降低雌性动物的雌激素水平和受孕率,损伤雄性动物的睾丸,具有较强的生殖毒性,还具有致畸性和胚胎毒性,也是导致男性不育的可疑诱因之一。
微生物的降解作用被认为是DEHP从自然环境中消除的主要途径。DEHP在好氧条件下的生物降解比较快,半衰期2-3周,在厌氧条件下的半衰期约300天(Arias E. Effectsof the peroxisome proliferator di(2-ethylhexyl)phthalate on cell turnover andperoxisome proliferation in primary chick embryo hepatocytes[J].Environmental Toxicology and Chemistry, 2012, 31(12): 2856-2860.)。
国内外就DEHP的微生物降解做了大量的工作,目前已筛选到的能降解DEHP的微生物菌株主要属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)(柴素芬, 曾锋, 傅家谟. DEHP的微生物降解性研究[J]. 中山大学学报(自然科学版), 2000, 39(4): 57-60.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、鞘胺醇单胞菌属(Sphigomonas sp.)等,另外铜绿微囊藻对水体中DEHP亦具有明显的降解作用(迟杰, 董林林, 李金娟.铜绿微囊藻对DBP和DEHP的富集和降解特性[J]. 天津大学学报, 2006, 39(12): 1395-1398.)。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是由Yabuuchi在1990年首先提出划分的一个新属,是一类丰富的新型微生物资源,能够降解高分子有机污染物(胡杰, 何晓红, 李大平,等. 鞘氨醇单胞菌研究进展[J]. 应用与环境生物学报, 2007, 13(3): 431-437.),已成为微生物研究的热点之一(ZHOU Lisha, LI Hui, ZHANG Ying, et al. Development ofgenus-specific primers for better understanding the diversity and populationstructure of Sphingomonas in soils[J]. J Basic Microbiol, 2014, 54(8): 880-888.;YANG Suijuan, ZHang Xinghai, CAO Zhaoyun, et al. Growth-promotingSphingomonas paucimobilis ZJSH1 associated with Dendrobium officinale throughphytohormone production and nitrogen fixation[J]. Microb Biotechnol, 2014.)。
但尚未见嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)可降解DEHP的研究报道。
发明内容:
本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株及其在烟草种植中的应用,该菌株是发明人从郑州郊区塑料废弃物中分离并筛选出来,是具有降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯能力的菌株,经发酵后应用于烟草种植中,可明显促进烟株生长。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株,为嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)Zh-X-08菌株,该菌株于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号,中国科学院微生物研究所,邮编为100101,保藏号:CGMCC No.8075。
所述Zh-X-08菌株在LB平板上圆形,直径1.5~2.5 mm,淡黄,表面光滑,湿润,低凸起,边缘裂叶状。菌体杆状,无鞭毛,不运动,大小为(0.50~0.60)μm×(0.90~2.0)μm; 结合生理生化特性(革兰氏染色、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原以及碳源与利用等指标)及16SrDNA序列,可鉴定为嗜温鞘氨醇杆菌。
Sphingobacterium thalpophilum ZH-X-08菌株接种于无机盐培养基中,28 ℃培养3 d,加入5 mL无菌水,振荡得到菌悬液;将菌悬液以5-7 %的比例接种至装有30-50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中进行发酵培养;培养温度28-30 ℃,摇床转速200 rpm,培养时间72 h,即制得菌株ZH-X-08发酵液。
将由Zh-X-08菌株制备的ZH-X-08菌株发酵液稀释4-8倍后,在烟草移栽时,每株烟草浇灌稀释液100 ml至根系周围,可明显降低土壤中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的含量,促进烟株生长。
所述无机盐培养基成分及配制方法如下:Na2HPO4·12H2O 1.5-2.5 g,KH2PO4 0.3-0.6g,MgSO4·7H2O 0.15- 0.25 g,(NH4)2SO4 0.8-1.2 g,酵母粉0.025-0.06 g,蒸馏水1L,用4 mol/L NaOH 调节pH至7.5;邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(作为底物,能够保持并提升菌株降解活性),溶于丙酮后抽滤灭菌,加到预先灭菌的无机盐培养基中,使邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的浓度为20-30 mg/L,待丙酮挥发后使用。
所述发酵培养基组成为:葡萄糖0.05 g/L,酵母粉0.05 g/L,KH2PO4 0.6 g/L,(NH4)2SO4 1.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,pH7.5。
本发明的最大特点是:利用Zh-X-08菌株经摇瓶发酵所得菌悬液,在烟草种植中能够降低烟草自毒物质邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯含量、促进烟株生长。
具体实施方式:
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。以下实施例中的试验,均设置三次重复,结果取平均值。
实施例1
Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-08菌株按照5%接种量接种于无机盐培养基(Na2HPO4·12H2O 2.0 g,KH2PO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2 g,(NH4)2SO4 1.0 g,酵母粉0.05 g,邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯30 mg/L)中,28 ℃培养3 d,加入5 mL无菌水,振荡得到菌悬液。将菌悬液以5 %的比例接种至装有30 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中进行发酵培养。培养温度28 ℃,摇床转速200 rpm,培养时间72 h。即制得菌株ZH-X-08发酵液。
发酵培养基组成:葡萄糖0.05 g/L,酵母粉0.05 g/L,KH2PO4 0.6 g/L,(NH4)2SO41.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,pH 7.5。
以土壤盆栽方式进行验证试验,试验在郑州烟草研究院温室内进行。盆栽土壤采自郑州市郊,土壤有机质含量为20.33 g·kg-1,总氮2.63 g·kg-1,pH值6.89(土水比为1׃2.5),有效磷26.31 mg·kg-1,速效钾96.72 mg·kg-1,DEHP含量4.23 mg·kg-1。土壤风干后过20目筛,在盆栽前一周采用掺土法拌入NH4NO3、KH2PO4、KNO3和K2SO4等化学纯试剂,使土壤含N量达1.0 g/kg干土,m(N)׃m(P2O5m(K2O)=1׃1׃3,同时采用掺土法设置5.0 mg/kg和10 mg/kg两个DEHP添加水平,每盆装入土壤2.0 kg。将发酵稀释4倍和8倍后作稀释液备用。施用方式1:在装盆时采用掺土法将稀释液100 ml均匀拌入盆栽土壤中(掺土法);施用方式2:将100 ml稀释液在移栽时以灌根方式浇灌在烟草根部土壤周围(灌根法)。同时设置空白对照,重复3次,试验共计30盆。盆栽每3天浇200 ml去离子水1次,移栽后30 d采用破坏性取样,分别采集土壤和烟株样品,测定土壤中DEHP含量和烟草生物量(地上部和根系)。试验结果详见表1。该菌株发酵液能够降低土壤中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯含量15 %以上,较对照提高烟草生物量10 %以上。
实施例2
Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-08菌株按照5%接种量接种于无机盐培养基(Na2HPO4·12H2O 1.5 g,KH2PO4 0.4 g,MgSO4·7H2O 0.15 g,(NH4)2SO4 1.2 g,酵母粉0.04 g,邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯25 mg/L),中,28℃培养3 d,加入5 mL无菌水,振荡得到菌悬液。将菌悬液以6 %的比例接种至装有30 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中进行发酵培养。培养温度28 ℃,摇床转速200 rpm,培养时间72 h。即制得菌株ZH-X-08发酵液。
发酵培养基组成:葡萄糖0.04 g/L,酵母粉0.04 g/L ,KH2PO4 0.5 g/L,(NH4)2SO41.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,pH 7.5。
以大田小区方式进行验证试验。在河南襄城烟区内进行,试验地土壤有机质含量为23.33 g·kg-1,总氮2.48 g·kg-1,pH值7.03(土水比为1׃2.5),有效磷42.13 mg·kg-1,速效钾108.92 mg·kg-1,DEHP含量为1.49 mg·kg-1。氮肥施肥量为纯氮75.0 kg/ha,m(N)׃m(P2O5m(K2O)=1׃0.8׃2.5,移栽烟草行株距为120 cm×60 cm。将发酵液稀释4倍和8倍后,在移栽后对烟株根部浇100 ml稀释液,每个浓度处理处理4株烟草,同时设置空白。移栽后30 d采集烟草根际土壤(抖土法)和烟株样品,测定土壤中DEHP含量和烟草植株生物量。结果详见表2。结果表明该菌株发酵液能够降低根际土壤中邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯含量20 %以上,烟草生物量高于对照8 %以上。
注:(+)表示增加或提高,(-)表示减少或降低。

Claims (5)

1. 一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株,其特征在于:所述降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株为嗜温鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpophilum)Zh-X-08菌株,该菌株于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号: CGMCC No.8075。
2.一种利用权利要求1所述的菌株制备Zh-X-08菌株发酵液的方法,其特征在于:将Sphingobacterium thalpophilum Zh-X-08菌株接种于无机盐培养基中,28 ℃培养3 d,加入5 mL无菌水,振荡得到菌悬液;将菌悬液以5 %的比例接种至装有30 mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养;培养温度28 ℃,摇床转速200 rpm,培养时间72 h,即制得菌株Zh-X-08发酵液。
3.根据权利要求2所述的制备Zh-X-08菌株发酵液的方法,其特征在于:所述发酵培养基组成为:葡萄糖0.05 g/L,酵母粉0.05 g/L,KH2PO4 0.6 g/L,(NH4)2SO4 1.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,pH7.5。
4.一种权利要求1所述的降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株在烟草种植中的应用,其特征在于:将由Zh-X-08菌株制备的ZH-X-08菌株发酵液添加烟草根际中可明显降低土壤邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的含量,促进烟株生长。
5.根据权利要求4所述的降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株在烟草种植中的应用,其特征在于:将发酵液稀释4-8倍后,在烟草移栽时,每株烟草浇灌100ml稀释液。
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