CN107058162B - 一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌及其应用 - Google Patents

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株新鞘氨醇杆菌和作为降解西柏三烯‑4,6‑二醇的应用。所述新鞘氨醇杆菌已于2016年12月08日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其CGMCC No.13436。新鞘氨醇杆菌作为降解西柏三烯‑4,6‑二醇的应用，所述新鞘氨醇杆菌降解西柏三烯‑4,6‑二醇的降解率为70.58%。

Description

一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌及其应用。
背景技术
卷烟的生产从种植到出品有着非常复杂的工艺，一般来说要经过五大工序，其中包括烟叶初烤；打叶复烤；烟叶陈化；卷烟配方；卷烟制丝。其中烟叶复烤后的陈化是个相当重要的环节，其对烟叶的品质有很大的影响。复烤后或者是经过陈化一年以下的烟叶，称为新烟。新烟有较重的青杂气、刺激性，纯净度较低，烟气也相对粗糙不舒适，香味未能显露等。低等级新烟叶更加会出现苦、辣、涩等缺点。因此，一般不直接用新烟进行卷烟加工和制造。陈化后的烟叶颜色变深、青色减少，杂气和刺激都有所减弱，香味得到显现，达到了烟叶生产的工业要求。这一过程就是叶陈化，是提高烟叶品质的关键途径。
西柏三烯二醇主要来源于成熟的新鲜烟叶的表面分泌物，其中以(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（α–CBD）以及(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇（β–CBD）含量较高。西柏三烯-4,6-二醇是烟草中重要的致香前体物，其降解转化产物茄酮、降茄二酮、茄尼呋喃等多种重要中性香味成分能与烟香协调，醇和烟气，增加烟草本香。因此，在烟草调制、陈化及加工过程中如何有效利用西柏三烯-4,6-二醇降解转化产生烟草香味成分，充分挖掘烟草自身潜质，对于提高烟叶品质及使用价值、增加卷烟香气、凸现卷烟风格特征和提高卷烟的安全性具有重要价值。
关于西柏三烯-4,6-二醇类化合物的降解一般认为有两种起始模式，一种是在光或氧化剂作用下进行，另一种是在酶催化作用下。经过一系列的转化，西柏三烯-4,6-二醇类物质可以转化为C8～C18不同碳原子数的香味成分。利用CrO3在硫酸水溶液中和丙酮水溶液氧化西柏三烯-4,6-二醇，得到主要产物为包括降茄二酮在内的八种产物。光催化西柏三烯-4,6-二醇后容易发生在11,12-号位双键的环氧化。生物催化降解西柏三烯二醇方面：雷公藤(Tripterygium wilfordii)的植物细胞催化降解西柏三烯-4,6-二醇后发11,12-位双键容易被环氧化，同时10-、12-和13-号位的羟基化也被发现。利用美花烟草(Nicotiana sylvestris)的植物细胞、细胞均质体、无细胞提取物和细胞小球分别作为催化剂降解西柏三烯-4,6-二醇后，其产物和雷公藤的降解产物相似。
发明内容
本发明为解决西柏三烯-4,6-二醇降解的技术难题，提供了一株新鞘氨醇杆菌及其作为降解西柏三烯-4,6-二醇的应用。
为解决上述技术难题，采用以下技术方案：
一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium panipatense），所述新鞘氨醇杆菌已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其CGMCC No：13436。
所述新鞘氨醇杆菌大小为0.6～0.8μm×1.5～1.9μm，呈细杆状，无鞭毛，在LB平板上为黄色圆斑状。
降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌的培养方法，步骤如下：将新鞘氨醇杆菌菌液按1%的接种量，接种到培养基中，培养条件为pH 5～9，温度28～35℃，转速120~170rpm，培养72h即可。
所述培养基配方为：K2HPO4 1 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L，FeSO4•7H2O 0.005 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO4 0.65 g/L，MnSO4 0.001 g/L，(NH4)2•SO4 0.5 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，Na2MoO4•2H2O 0.005 g/L，西柏三烯-4,6-二醇 0.3g/L。
一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌作为降解西柏三烯-4,6-二醇的应用。
所述新鞘氨醇杆菌降解西柏三烯-4,6-二醇的降解率为70.58%。
本发明的有益效果在于：在烟叶的陈化期间，一个重要的作用是将西柏三烯-4,6-二醇类物质降解成香味物质，从而增加烟叶香味。新鞘氨醇杆菌可以在72h内将70.58%的西柏三烯-4,6-二醇降解，说明未来该菌可用于烟叶的发酵。
附图说明
图1为菌源的平板涂布图。
图2为菌种的纯化平板图。
图3为菌种的显微镜照片。
图4为新鞘氨醇杆菌对西柏三烯-4,6-二醇的降解曲线图。
具体实施方式
一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium panipatense），所述新鞘氨醇杆菌已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其CGMCC No：13436。
所述新鞘氨醇杆菌大小为0.6～0.8μm×1.5～1.9μm，呈细杆状，无鞭毛，在LB平板上为黄色圆斑状。
降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌的培养方法，步骤如下：将新鞘氨醇杆菌菌液按1%的接种量，接种到培养基中，培养条件为pH 5～9，温度28～35℃，转速120~170rpm，培养72h即可。
所述培养基配方为：K2HPO4 1 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L，FeSO4•7H2O 0.005 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO4 0.65 g/L，MnSO4 0.001 g/L，(NH4)2•SO4 0.5 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，Na2MoO4•2H2O 0.005 g/L，西柏三烯-4,6-二醇 0.3g/L。
一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌作为降解西柏三烯-4,6-二醇的应用。
所述新鞘氨醇杆菌降解西柏三烯-4,6-二醇的降解率为70.58%。
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
缺碳富西柏三烯-4,6-二醇培养基的配方：
K2HPO4 1 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L，FeSO4•7H2O 0.005 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO40.65 g/L，MnSO4 0.001 g/L，(NH4)2•SO4 0.5 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，Na2MoO4•2H2O 0.005g/L，在此培养基基础上加0.3g/L 西柏三烯-4,6-二醇。
细菌LB培养基的公开配方：
10g 胰蛋白胨，5g 酵母提取物，10g NaCl，蒸馏水1L，pH至7.0。
一、西柏三烯-4,6-二醇降解菌的筛选
称取新鲜成熟烟叶10 g，剪碎烟叶，放入250 mL三角瓶中，加入100 mL无菌水浸泡过夜，移取200 μL加到20 mL的LB培养基内，30 ℃、转速150 r/min条件下培养两天，得到菌源。
移取1 mL经富集培养得到的菌源到100 mL发酵培养基中，以不加菌源的发酵培养基作为对照，培养7d，通过GC-MS检测，与空白对照的GC-MS检测图进行对比。挑选出能降解西柏三稀-4,6-二醇的菌源，再从中移取1 mL依次进行梯度稀释，选择10-2，10-4这两个浓度梯度在缺碳富西柏三烯-4,6-二醇培养基上进行平板涂布如图1所示。将涂布好的平板于培养箱中，30℃培养2-4 d，挑选出形态较好的菌落反复划线分离纯化，直到平板上无杂菌落出现，再经显微镜镜检如图2、显微镜照片如图3所示，即可确认为纯培养。
二、种子液的制备
将保存在斜面中的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium panipatense Y3-1)接种到30 mL的LB培养基中，培养12 h后备用。
三、西柏三烯-4,6-二醇的细菌降解特性
将新鞘氨醇杆菌种子液按1%的接种量，接种到含有0.3 g/L西柏三烯-4,6-二醇的细菌无机盐培养基中，培养72 h，温度30℃，摇床转速，150 rpm。同时做空白对照。每6 h取样一次每次取样30 mL，利用GC-MS测定发酵液中西柏三烯-4,6-二醇的含量。
经过72 h培养后，原300 mg/L的培养基中的西柏三烯-4,6-二醇的残留浓度为90mg/L，对照为300 mg/L。
四、样品测定前的准备
取10 mL发酵液，在12000 r/min 条件下对其进行离心30 min，取上清液与等体积的CH2Cl2，在分液漏斗中进行萃取，缓缓摇晃，使两相混合均匀，静置10 min后，收集下层有机相，重复以上步骤5次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，静置过夜，过滤，旋转蒸发除去CH2Cl2后，加入1 mL色谱纯CH2Cl2溶解，过0.45 μm有机系滤膜后，上GC-MS分析检测。
降解菌的理化试验结果如图4所示，随着培养时间的推移西柏三烯-4,6-二醇的残留量逐渐降低，在30%以内处达到稳定，检测结果证明西柏三烯-4,6-二醇的降解率为74.58％。

Claims (6)

1.一株降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌，其特征在于：所述新鞘氨醇杆菌已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其CGMCC No：13436。
2.根据权利要求1所述的降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌，其特征在于：所述新鞘氨醇杆菌大小为0.6～0.8μm×1.5～1.9μm，呈细杆状，无鞭毛，在LB平板上为黄色圆斑状。
3.根据权利要求1所述的降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：将新鞘氨醇杆菌菌液按1%的接种量，接种到培养基中，培养条件为pH 5～9，温度28～35℃，转速120~170 rpm，培养72h即可。
4.根据权利要求3所述的降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基配方为：K2HPO4 1 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L，FeSO4•7H2O 0.005 g/L，NaCl0.5 g/L，KH2PO4 0.65 g/L，MnSO4 0.001 g/L，(NH4)2•SO4 0.5 g/L，CaCl2•2H2O 0.1g/L，Na2MoO4•2H2O 0.005 g/L，西柏三烯-4,6-二醇 0.3g/L。
5.权利要求1所述的降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌作为降解西柏三烯-4,6-二醇的应用。
6.根据权利要求5所述的降解西柏三烯-4,6-二醇的新鞘氨醇杆菌作为降解西柏三烯-4,6-二醇的应用，其特征在于：所述新鞘氨醇杆菌降解西柏三烯-4,6-二醇的降解率为70.58%。
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