CN106399399B - 一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法 - Google Patents
一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物降解叶黄素生成8‑甲基‑α‑紫罗兰酮的方法，所述的方法是利用霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8‑甲基‑α‑紫罗兰酮。本发明首次采用霍氏肠杆菌降解叶黄素，生成具有香味的物质8‑甲基‑α‑紫罗兰酮，开辟了微生物降解叶黄素生成香味物质的新途径，解决了传统使用物理化学方法降解叶黄素生成香味物质不易分离，试剂多，对环境造成负担的技术问题，具有反应条件温和、易分离、绿色环保等特点。本发明通过对比不同底物浓度的降解效果，发现叶黄素在发酵培养基中的浓度为400～700mg/L时，叶黄素降解最佳。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物降解叶黄素的方法，特别涉及一种利用霍氏肠杆菌生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
叶黄素又名植物黄体素，英文名为Lutein，分子式为C40H56O2，相对分子量为568.85，是含氧类胡萝卜素的一种。叶黄素在自然界中分布较广，很多蔬菜、瓜果，如：豆类、黄桃、万寿菊中均富含叶黄素。叶黄素是许多重要香气成分的前体物，在烟叶的成熟、调制、醇化和燃烧过程中，叶黄素可降解转化，形成多种致香成分，如β-大马酮、紫罗兰酮和异佛尔酮等。这些成分具有浓郁的花香和果香，且香气阈值很低，在制备香精香料方面具有重要价值。然而现有的叶黄素降解方法主要是利用物理化学降解，传统的物理降解和化学降解产物多为混合物，不易于分离，且由于有机试剂的影响，其降解产生的香气成分在应用上受到很多限制。微生物降解相比于物理化学降解，具有其独特的优势：微生物种类多、含酶丰富，利用微生物可进行多种生物转化反应；生物转化反应具有高度选择性，可顺利地完成一般化学方法难以实现的反应；反应条件温和，尤其适用于对热不稳定化合物的制备。因此，生物降解叶黄素将越来越受到大家的关注，但是目前利用酶和微生物来降解叶黄素产生香味物质的研究还很少。
霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)是一种直杆菌，革兰氏阴性，周生鞭毛运动，兼性厌氧，容易在普通培养基上生长，发酵葡萄糖，一般可利用柠檬酸盐和丙二酸盐作为唯一的C源和能源。多数菌株可将明胶缓慢液化，不产生脱氧核糖核酸酶。目前还没有利用霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的相关报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，该方法利用霍氏肠杆菌降解叶黄素，能够得到具有香味的物质8-甲基-α-紫罗兰酮，方法简单、转化率高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，所述的方法是利用霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮。
具体的，所述的方法是将叶黄素溶液加入发酵培养基中，再加入霍氏肠杆菌种子液，霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮。
优选的，所述的方法是将叶黄素溶液加入发酵培养基中，至叶黄素的终浓度400-700mg/L，再加入霍氏肠杆菌种子液，霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮。
所述的叶黄素溶液的制备方法为：将200mg叶黄素分散在2g吐温80中，得到叶黄素分散液，再将叶黄素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中即得。
所述的霍氏肠杆菌种子液与发酵培养基的体积比为1.5:100。
所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖3g、天门冬酰胺4.5g、酵母粉3g、K2HPO4 1.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g、蒸馏水1L；pH 7.0。
所述的霍氏肠杆菌降解叶黄素的条件为：25℃、200r/min摇床培养。
本发明利用的叶黄素降解生成8-甲基-α-紫罗兰酮的路径图见图1。
本发明的有益效果：
1、8-甲基-α-紫罗兰酮是重要的香味物质，广泛使用在日化香精和烟用香精中，在烟草中添加少量的该香味物质就能够很大程度上提升烟草品质。本发明首次采用霍氏肠杆菌降解叶黄素，生成香味物质8-甲基-α-紫罗兰酮，开辟了微生物降解叶黄素生成香味物质的新途径，解决了传统使用物理化学方法降解叶黄素生成香味物质不易分离，试剂多，对环境造成负担的技术问题，具有反应条件温和、易分离、绿色环保等特点。
2、本发明的发酵培养基是通过反复筛选，最终得到的最佳发酵培养基。本发明的最佳发酵培养基，能够提高霍氏肠杆菌的活性，从而提高叶黄素的降解率。采用本发明的发酵培养基，使叶黄素降解率从初始的40.16％提高到89.7％，与初始的发酵培养基相比提高了123.35％。
3、叶黄素溶液的浓度太高，会对微生物有毒害作用，影响微生物的生长及对叶黄素的降解效果，因此本发明通过对比不同底物浓度的降解效果，发现叶黄素在发酵培养基中的浓度为400～700mg/L时，叶黄素降解最佳。
4、实验证明，霍氏肠杆菌在25℃、pH 7.0、200r/min、接种量1.5％、叶黄素终浓度400mg/L的条件下降解叶黄素，其细胞生物量在42h时OD600达到最高值2.817；叶黄素含量随着时间变化而减小，即叶黄素的降解率随着时间变化而增大，在42h时叶黄素的降解率达到89.7％。
5、本发明的方法简单、操作方便、生产成本低，易于工业化推广，具有良好的社会和经济效益。
附图说明
图1为叶黄素降解路径图。
图2为叶黄素的标准曲线图。
图3为叶黄素浓度的筛选图。
图4为霍氏肠杆菌的生长曲线图。
图5为发酵降解过程中叶黄素含量的变化图。
图6为叶黄素降解产物GC-MS分析的总离子流图。
图7为图6中降解产物I的质谱图。
图8为图6中降解产物II的质谱图。
图9为图6中降解产物III的质谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所采用的生物降解叶黄素的菌种为霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)，其菌种编号为【CICC 10432】，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
霍氏肠杆菌种子液的制备方法：种子液培养基为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，蒸馏水1L，pH＝7.0-7.2，将每5mL的种子液培养基装到试管中，密封后在121℃的高温下灭菌20min，冷却至室温待用。挑选单菌落接种到种子液培养基中，放置于25℃、200r/min的摇床中进行发酵培养，反应至菌液浓度测得OD600值为2～2.5时，得到种子液，将种子液放置在4℃冰箱中备用。
实施例1叶黄素浓度的筛选
首先配置用于叶黄素降解的发酵培养基：葡萄糖3g、天门冬酰胺4.5g、酵母粉3g、K2HPO41.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g、蒸馏水1L，调节pH至7.0，将每100mL的发酵培养基装在250mL的三角瓶中，密封后在121℃的高温下灭菌20min，冷却至室温待用。
叶黄素溶液的配制：将200mg的叶黄素分散在2g吐温80中，得到叶黄素分散液，再将叶黄素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中；将叶黄素溶液过0.45μm的有机滤膜，除去内部的杂菌，备用。
生物降解过程：将叶黄素溶液分别加入到多个发酵培养基中，至叶黄素的终浓度分别为300、400、500、600、700、800、900mg/L。再分别接种1.5mL霍氏肠杆菌种子液到发酵培养基中，放置于25℃、200r/min的摇床中进行发酵培养。反应48h后测量发酵液中的菌体浓度以及叶黄素降解量。
发酵液中菌体浓度的测定方法为，取1mL发酵液稀释3倍，用紫外分光光度计测量稀释后的发酵液(菌液)在600nm时的OD值，再乘以稀释倍数(同时设置有未加叶黄素的培养基作为对照)。
发酵液中叶黄素降解量的测定方法如下：
发酵液在避光条件下，高速离心(4℃，6500r/min，30min)，将分离出的上清取出来，加入等体积二氯甲烷反复萃取3次，得到叶黄素发酵提取物，加入无水Na2SO4干燥过夜，真空浓缩，蒸干溶剂，再加2mL甲醇，过0.45μm的有机滤膜，除去内部的杂菌后，进行HPLC分析(实验组)，并以等体积不接霍氏肠杆菌培养基作为对照。
HPLC分析的条件：色谱柱选择C18柱(4.6mm×250mm，粒径为5μm)，柱温为30℃，流动相为甲醇：水(1:99体积比)，流速为0.6mL/min，波长为460nm，进样量为5μL。
叶黄素标准曲线的绘制：分别以甲醇配制0、200、400、600、800、1000mg/L的叶黄素标准溶液，根据建立的色谱条件进行HPLC分析后，以峰面积为纵坐标(Y)，横坐标(X)代表质量浓度，制作出标准曲线(图2)。
发酵液中叶黄素浓度的计算方法：根据标准曲线可知，峰面积(Y)与浓度(X)的回归方程为Y＝44.633X-138.79，相关系数R2＝0.9988，表明在0～1000mg/L浓度范围内，叶黄素浓度与峰面积线性关系良好。
叶黄素降解率计算公式：
式中：C实验，实验组中叶黄素的浓度，单位mg/L；C对照，对照组中叶黄素的浓度，单位mg/L。
叶黄素降解量计算公式：
叶黄素降解量＝叶黄素降解率*叶黄素加入时的浓度
叶黄素浓度对降解效果的影响如图3所示。在发酵培养基中叶黄素的浓度大于700mg/L时，发酵液的OD600值和叶黄素降解量明显下降，说明叶黄素的浓度太高会对微生物具有毒害作用，反而影响其生长和叶黄素降解效果，当叶黄素浓度在400-700mg/L时，叶黄素降解量基本不变，霍氏肠杆菌在100mL发酵液中可降解的叶黄素终浓度为358.8mg/L，故在100mL发酵液中加入的叶黄素溶液的量以叶黄素终浓度400mg/L为宜。
本发明利用霍氏肠杆菌降解叶黄素，每隔6小时取样并测量培养基中的菌体浓度以及剩余叶黄素的浓度，降解效果如图4、5所示，霍氏肠杆菌在25℃、pH为7.0、200r/min、接种量1.5％、叶黄素终浓度400mg/L的条件下降解叶黄素的细胞生物量在42h时OD600达到最高值2.817，并在随后一段时间基本维持不变；叶黄素含量随着时间变化而减小，即叶黄素的降解率随着时间变化而增大，在42h时叶黄素的降解率为89.7％，随后一段时间基本维持不变。
实施例2叶黄素降解产物的测定
对本发明霍氏肠杆菌发酵降解叶黄素的降解产物进行测定，具体方法为：
发酵液在避光条件下，高速离心(4℃，6500r/min，30min)，将分离出的上清液取出来，加入等体积二氯甲烷反复萃取3次，得到叶黄素发酵提取物，加入无水Na2SO4干燥过夜，真空浓缩至1mL，进行GC-MS定性分析。
气相条件：色谱柱：HP-5(30m×0.25mm；0.25μm)；升温程序：初始温度45℃，保持5min，以4℃/min升到110℃，保留5min，以1℃/min升到150℃，保留5min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到280℃，保留5min；进样口温度：270℃；传输线温度：270℃；分流比：1:1；载气：He气；流速：1mL/min。
质谱条件：电离方式EI，电离电压70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围：30-550amu。
结果见图6-9。图6为GC-MS分析的总离子流图，经GC-MS分析主要叶黄素的降解产物主要有三种。图7-9为图6中检测到的主要降解产物的质谱图，结果表明，降解产物I为8-甲基-α-紫罗兰酮，降解产物II为3-氧化-α-紫罗兰酮，降解产物III为3-羟基-β-紫罗兰酮，其中8-甲基-α-紫罗兰酮的含量最高。
Claims (7)
1.一种生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的方法是利用霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮，所述的霍氏肠杆菌菌种编号为CICC 10432。
2.根据权利要求1所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的方法是将叶黄素溶液加入发酵培养基中，再加入霍氏肠杆菌种子液，霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮。
3.根据权利要求2所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的方法是将叶黄素溶液加入发酵培养基中，至叶黄素的终浓度400-700mg/L，再加入霍氏肠杆菌种子液，霍氏肠杆菌降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮。
4.根据权利要求2或3所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的叶黄素溶液的制备方法为：将200mg叶黄素分散在2g吐温80中，得到叶黄素分散液，再将叶黄素分散液溶解在400mL二氯甲烷中，溶解完全后将二氯甲烷减压蒸出，减压蒸出后的残留物溶解在10mL乙醇中即得。
5.根据权利要求2或3所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的霍氏肠杆菌种子液与发酵培养基的体积比为1.5:100。
6.根据权利要求2或3所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖3g、天门冬酰胺4.5g、酵母粉3g、K2HPO4 1.5g、MgSO4 0.5g、FeSO4 0.01g、蒸馏水1L；pH 7.0。
7.根据权利要求1-3任一项所述的生物降解叶黄素生成8-甲基-α-紫罗兰酮的方法，其特征在于，所述的霍氏肠杆菌降解叶黄素的条件为：25℃、200 r/min摇床培养。
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Citations (1)
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Bioconversion of lutein by Enterobacter hormaechei to form a new compound, 8-methyl-a-ionone;Guifang Zhong;《Biotechnol Lett》;20170428;第39卷;全文 * |
| 叶黄素的几类降解反应研究;古昆;《化学研究与应用》;19991130;第11卷(第5期);全文 * |
| 霍氏肠杆菌A20降解类胡萝卜素的条件优化;杨雪鹏;《中国酿造》;20160915;第35卷(第9期);全文 * |
| 霍氏肠杆菌降解叶黄素的研究;汪芳芳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180115;全文 * |
| 静息细胞降解叶黄素生产香味物质的条件优化;汪芳芳;《河南工业大学学报（自然科学版）》;20170228;第38卷(第1期);全文 * |
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