CN107227314A - 一种用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的方法 - Google Patents

一种用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的方法。所述的米曲霉菌株分类命名为：AspergillusoryzaeYNCA9804，保藏编号CCTCC NO：M 2016654。将该菌株液体种子接种到添加叶黄素储备液的培养基中进行发酵培养，发酵产物再经过滤除渣、减压浓缩后得到所需烟用香料。该香料具有浓郁木香味，添加到卷烟中进行评吸，具有丰富卷烟香气，降低喉部刺激性，改善余味的作用。本发明所用培养基简单，菌株性状稳定、易于保存、活化和发酵。生产工艺简单、操作性、规范性及可控性强，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的方法
技术领域
本发明属于卷烟香精香料制备技术领域，具体是涉及一种利用特殊的米曲霉菌株降解叶黄素制备烟用香料的方法。
背景技术
在烟草行业中，香精香料对卷烟产品的口味起着决定性作用。现今生产的香料、香精中约85％的产品是通过化学合成方法得到的。但是用化学法合成的香料不仅合成较困难、且大量使用会对人体健康造成影响。随着人们生活水平的提高，对烟用香料的需求趋向于天然、健康、安全、营养和多功能性。
天然香精香料是高价值的精细化工产品，但由于原料有限、提取成本高，仅仅依靠从天然动、植物中提取天然香料，远远满足不了卷烟香料市场的需求。利用微生物发酵技术可以制备香料或进行香料的转化，在提高香料产品质量的同时，还能够节约能源、降低成本，因此，科技人员对于卷烟用香精香料的生物制取技术进行了不断尝试。
类胡萝卜素是一大类在自然界广泛分布的四萜类化合物，其降解的致香物质包括β-紫罗兰酮、β-大马酮、和二氢猕猴桃内酯等，因具有较低的感观阈值，是许多香料的特征香味，这类香味物质在天然材料中含量很低，且提取成本昂贵，近年来一些研究者尝试通过酶或微生物体系模拟类胡萝卜素的自然降解，以获得新型香料。等以地丝菌属菌株(Geotrichum sp.)和芽孢杆菌(Bacillus sp.)两株菌混菌培养，降解叶黄素产生紫罗兰酮和紫罗兰醇等有烟草特征香味的物质。Zelena等以来源于蒜头状小皮伞的过氧化物酶降解叶黄素得到降解叶黄素得到3羟基α-紫罗兰酮和3羟基β-紫罗兰酮。但现有技术的效果尚不理想，难以满足工业化生产的实际需要。
米曲霉(Aspergillusoryzae)在自然界广泛分布，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，但关于用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的研究，在现有技术中尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以特殊的米曲霉菌株降解叶黄素制备烟用香料的方法。所得产品符合天然香料的要求，具有浓郁木香味，能够与烟香形成良好的配伍。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明从云南省红河州陈化烟叶中分离了一株真菌YNCA 9804作为试验菌种，对其进行了ITS序列分析，鉴定结果表明该细菌属于曲霉属，其分类命名为米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804，保藏号为CCTCC No：M2016654。
本发明所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株的形态学特征为：菌落微膨大、疏松粉状，中间淡黄绿色，边缘白色，背面乳白色；菌丝体发达，菌丝不光滑，有隔多分枝；分生孢子梗粗糙或有麻点，孢子囊呈球形或半球形，孢子链着生于小孢子梗上。
本发明所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株的分子鉴定特征为：测序结果在GenBank中进行同源性比对，提取相似度98％以上的序列，利用MEGA6.0软件，以领域连接法构建系统发育树，YNCA9804与菌株Aspergillusoryzae strain ATCC 42149聚为一簇，同源性为100％，鉴定菌株YNCA9804为米曲霉(Aspergillusoryzae)。
利用所述米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA 9804菌株降解叶黄素制备烟用香料的方法，包括以下步骤：
(1)将米曲霉菌株YNCA 9804置于斜面固体培养基中保存备用；
(2)叶黄素储备液的制备：称取5g叶黄素，溶于10mL的二氯甲烷中，待叶黄素彻底溶解后加入1g Tween-80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；
(3)降解叶黄素的产香发酵：
①将保存备用的米曲霉菌株YNCA 9804转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min，得米曲霉种子液；所述的液体种子培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；
②取步骤①所得米曲霉种子液，按培养基体积比1％接入50L发酵罐中进行液体培养，同时按培养基体积比0.05％～1％加入叶黄素储备液，50L发酵罐定容30L；所述的培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5；培养控制条件：温度25～40℃，通气比0.1～10，罐压：0.03～0.08MPa，DO≥20％，搅拌速率120～400r/min，发酵时间48h～192h；
(4)发酵完成后过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得所需烟用香料。
进一步的，为防止香料变质，按烟用香料重量的5％添加丙二醇。
步骤(1)中所述的斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5～6.8，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒平板备用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)首次以米曲霉降解叶黄素制备烟用香料，经感官评吸测定，所得香料具有丰富烟香，增加卷烟木甜香的作用。
(2)经由米曲霉菌株YNCA 9804降解叶黄素得到的烟用香料，具有浓郁木香味，通过GC-MS检测，结果表明香料中含有β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯及β-环柠檬醛等致香物质成分；将该香料添加到卷烟中进行评吸，结果表明香气量较为充足，甜韵感丰富，地方性杂气减少，喉部舒适性增加，余味较为舒适，口腔收敛较强。
(3)本发明原料来源充足；所用培养基简单，菌株性状稳定、易于保存、活化和发酵。
(4)生产工艺简单、操作性、规范性及可控性强，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。
保藏生物材料的说明
本发明的菌株，已于2016年11月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，该中心地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学内，该菌株分类命名为：米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804，保藏编号CCTCC NO：M 2016654。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
(1)将保存于固体斜面的米曲霉YNCA 9804菌株(CCTCC M 2016654)转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min。
斜面固体培养基：马铃薯(去皮)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5-6.8。121℃，25min灭菌，冷却致60℃倒平板备用。
液体种子培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5-6.8。装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用。
(2)称取5g叶黄素，溶于10mL的二氯甲烷中，待叶黄素彻底溶解后加入1g Tween-80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；
(3)将步骤(1)培养生长米曲霉YNCA 9804种子液6瓶，按1％(v/v)接入50L发酵罐中进行液体培养，50L种子罐定容30L。叶黄素储备液的投料量比例为0.1％(w/v)。
培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5。
(4)培养控制条件：温度32℃，通气比1(v/v)，罐压：0.03MPa，DO≥20％，搅拌速率120r/min，发酵时间72h。
(5)发酵完成后过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得发酵烟用香料。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，木甜香味突出，刺激性减少，改善余味。
实施例2
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为0.05％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度30℃，发酵时间48h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，木甜香味突出，刺激性减少。
实施例3
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为0.2％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度35℃，发酵时间72h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，增加木甜香味，刺激性减少，改善余味。
实施例4
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为0.5％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度38℃，发酵时间72h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，增加木甜香味，刺激性减少，改善余味。
实施例5
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为0.5％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度32℃，发酵时间96h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(5)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，木甜香味突出，刺激性减少，改善余味。
实施例6
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为1％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度32℃，发酵时间120h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，增加木甜香味，刺激性减少，改善余味。
实施例7
重复实施例1，有以下不同点：
(3)培养基：叶黄素储备液的投料比例为0.3％(w/v)。
(4)培养控制条件：温度32℃，发酵时间72h。
(5)为防止变质，按发酵所得香料重量的5％添加丙二醇。
(6)专家品吸结果：与未加发酵香料卷烟相比烟香丰富，增加木甜香味，刺激性减少，改善余味。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和变化等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用米曲霉降解叶黄素制备烟用香料的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将米曲霉菌株CCTCC：M2016654置于斜面固体培养基中保存备用；
(2)叶黄素储备液的制备：称取5g叶黄素，溶于10mL的二氯甲烷中，待叶黄素彻底溶解后加入1g Tween-80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；
(3)降解叶黄素的产香发酵：
①将保存备用的米曲霉菌株CCTCC：M2016654转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min，得米曲霉种子液；所述的液体种子培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；
②取步骤①所得米曲霉种子液，按培养基体积比1％接入50L发酵罐中进行液体培养，同时按培养基体积比0.05％～1％加入叶黄素储备液，50L发酵罐定容30L；所述的培养基：NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KCL 0.5g/L，FeSO4.7H2O 0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5；培养控制条件：温度25～40℃，通气比0.1～10，罐压：0.03～0.08MPa，DO≥20％，搅拌速率120～400r/min，发酵时间48h～192h；
(4)发酵完成后过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得所需烟用香料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：为防止香料变质，按烟用香料重量的5％添加丙二醇。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5～6.8，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒平板备用。
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