CN103451108A - 一种出芽短梗霉菌of-01菌株及用它制备烟草内源性衍生香料的方法 - Google Patents

Abstract

一种出芽短梗霉菌OF-01菌株（CGMCC No.7609）及用它制备烟草内源性衍生香料的方法和其在烟用添加剂中的应用。利用烟叶碎片作为原料，通过出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）OF-01菌株发酵，产生胞外多聚糖（短梗霉多糖）、酶、抗菌素、单细胞蛋白、挥发性香气成分等多种产物，通过对发酵后烟叶碎片进行提取、浓缩，制备烟草内源性衍生香料，从而减少非烟草来源的香精香料产品在卷烟中的应用，实现烟叶碎片的再利用。致香成分分析表明，含多种烟草香气成分和其他衍生香气成分。加香评吸实验结果表明，该香料具有明显提调烟香、醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果，成本低、香气成分丰富、对人畜安全等特点，可作为香料在卷烟生产中使用。

Description

一种出芽短梗霉菌OF-01菌株及用它制备烟草内源性衍生香料的方法

技术领域

本发明属于烟用添加剂制备技术领域，具体涉及一种出芽短梗霉菌OF-01菌株及用它制备烟草内源性衍生香料的方法，本发明还涉及其在卷烟中的应用。 

背景技术

烟用香料是专供各种烟草制品加香矫味使用的一种添加剂。烟用香料多为人工调配的、含两种或两种以上香气成分的混合物，一般分为天然香料和人工合成香料(余金恒等，2011)。天然香料可来源于植物、动物和微生物，根据不同的提取方法可得到精油、浸膏、净油、香树脂、酊剂等不同的产品。天然烟用香料加入卷烟后经燃烧裂解能释放出香气香味，在卷烟生产中占据着非常重要地位。在国内，各烟草大省都有自己的卷烟品牌，而每一品牌系列的香烟都有其独特的烟叶原料、香料配方和卷烟工艺，进而保证该品牌香烟的独特风味。随着香烟品牌竞争战略意识的加强，从烟叶原料中提取内源性香气成分以及利用微生物发酵转化产生的衍生香气成分是现阶段烟草香料的重要发展方向之一（李旭华,2011）。在卷烟生产加工过程中，产生了大量的烟末、烟叶碎片等烟草废弃物，占烟叶总产量的10-25%。如何有效的利用这些烟叶资源，采用现代微生物发酵技术和现代生化技术，对这些废弃烟叶碎片进行研究开发，提高其利用率，具有重要意义。从复烤线碎片、制丝线碎片中提取的烟叶内源性香料及其衍生香不仅能维持和提升原有香烟品牌的风格特征，而且成本低，稳定性好，从而在卷烟加工中有广阔的应用前景(王娜等，2010)。 

出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一类与酵母有密切关系的真菌。出芽短梗霉能产生胞外多聚糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白、 挥发性香气成分等多种产物,对人体无任何副作用，广泛地用于医药制造,食品包装,水果和海产品保鲜,化妆品工业等（崔堂兵等，2002）。目前，未见有从出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分离得到的芽短梗霉菌株OF-01的报道。利用该菌株发酵烟叶内源性组分能产生多种衍生香料成分，在卷烟加工中有应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于通过利用廉价烟叶碎片，提供从烟叶表面微生物中筛选在烟草香料方面具有工业化生产前景的菌株芽短梗霉菌株OF-01，并提供借助微生物发酵技术，利用微生物转化烟叶内源性香气成分制备烟草内源性衍生香料的方法，实现了废弃烟叶的循环利用和减少了非烟草来源的香精香料在卷烟生产中的应用。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 

一种出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609），其具有产生短梗霉多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白、挥发性香气的能力。 

出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）的ITS基因序列在GeneBank数据库中的序列号为JQ916049，该基因序列用于鉴别OF-01菌株。 

出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）作为烟用添加剂 

出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）在制备烟叶内源性衍生香料中的应用。 

用出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）制备烟草内源性衍生香料的方法，将OF-01菌株通过试管斜面种子培养、液体种子培养、菌株发酵罐大量培养获得的菌体用于烟叶碎片发酵，发酵结束后，通过提取、浓缩得烟草内源性衍生香料。 

所述的制备方法中，OF-01（CGMCC No.7609）菌株试管斜面种子 培养是将该菌株的菌体接种到MYP培养基即麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0斜面上，20-30℃下培养4-10d后获得斜面种子，适宜的培养条件是28℃下培养7d；OF-01菌株液体种子培养是将斜面种子接种到三角瓶中的MYP的液体培养基中，15-30℃，50-300rpm条件下摇床培养3-7d获得。最适培养条件为28℃，200rpm条件下培养4d；OF-01菌株发酵罐大量培养是将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000L发酵罐中的培养条件为：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间4-6d。 

所述的制备方法中，烟叶碎片发酵是取1kg烟叶碎片，加入100g糖蜜，用清水将湿度调节到30-50%，混合均匀后于蒸汽湿热高压灭菌锅中121℃灭菌1h，冷却后接种OF-01菌株液体种子100mL，混合均匀后在25-35℃下温箱中培养7-15d。 

所述的制备方法中，烟叶内源性衍生香料的制备是将2kg水加入烟叶发酵产物中，混合均匀后转入烧瓶中，在100℃下回流提取2h，用纱布过滤去除残渣后得到的滤液在60℃下减压浓缩到一半体积；加入3-5倍体积的95%的乙醇，静置10-24h，取上清液并在60℃下减压浓缩到五分之一体积，得到的烟膏即为烟叶内源性衍生香料，利用GC/MS测定香料的香气成分。 

本发明与传统的方法相比较，具有以下明显优点： 

（1）本发明首次将出芽短梗霉OF-01菌株用于发酵烟叶碎片，并制备烟草内源性衍生香料。 

（2）所制成的烟草内源性香料应用到卷烟中效果非常明显，能起到提调烟香、醇和烟气、降低刺激性、改善口感的作用。 

（3）以烟叶碎片为原料，大大节约了成本，使得烟叶的利用率 进一步提高。 

（4）所制成的烟草内源性香料应用到卷烟增香，操作简便、成本低廉、具有操作性、规范性和可控性强的特点，便于实现大规模工业化生产。 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

保藏生物材料的说明 

本发明涉及的短梗霉菌OF‐01的菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年5月13日；保藏号为CGMCCNo.7609；分类命名：出芽短梗霉Aureobasidium pullulans。 

实施例1： 

1、本发明微生物OF-01菌株来源： 

将仓储陈化3年的红花大金元烟叶样品粉碎，取5克粉碎后的烟末放入装有100ml无菌水的三角瓶中，在100-250rpm摇床上震荡30分钟后过滤去除烟末，用悬液涂布MYP培养基（麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0）平板，200微升/皿，共50皿，在28℃温箱中培养5-7天后用MYP培养基纯化出单一的微生物，从纯化的烟叶表面微生物中筛选得到具有产香特性的OF-01菌株，经鉴定该为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）。 

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）是一种类酵母真菌，具有酵母型和真菌型两种菌丝体形态，据其生理特征和孢子产生的特征将其归属于半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属。OF-01菌株在YPD 培养基（2%蛋白胨、1%酵母抽提物、2%葡萄糖，自然pH）上，25℃下7天，菌落初期为典型的酵母状：粘稠、污白色，显微镜下菌体为单细胞个体、椭圆形；菌落后期为典型的真菌状：转暗为黑色，边缘呈根状，显微镜下菌体呈丝状体。利用引物5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'和5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAG-3'经PCR扩增，获得OF-01菌株获得的ITS区基因序列，提交到GeneBank公共数据库，其序列号为JQ916049，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。鉴于该菌株由于（自发的、物理的或化学的）突变、原生质体融合，转化或其他通过生物技术会发生变化或被改造，因此，本菌株的任何突变株、变种和衍生物均应视为本专利申请所能预见和能得到的技术方案。 

2、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）OF-01菌株的培养基和培养条件： 

1.1、OF-01菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到MYP培养基（麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0）斜面上，20-30℃下培养4-10d后获得斜面种子，适宜的培养条件是28℃下培养7d； 

1.2、OF-01菌株液体种子的培养：将斜面种子接种到三角瓶中的MYP的液体培养基中，15-30℃，50-300rpm条件下摇床培养3-7d获得。最适培养条件为28℃，200rpm条件下培养4d； 

1.3、OF-01菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000L发酵罐中的培养条件为：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间4-6d。 

3、烟叶碎片发酵处理 

取1kg烟叶碎片，加入100g糖蜜，用清水将湿度调节到30-50%， 混合均匀后于蒸汽湿热高压灭菌锅中121℃灭菌1h，冷却后接种步骤1所得OF-01菌株液体种子100mL，混合均匀后在25-35℃下温箱中培养7-15d，用于下一步实验。 

4、烟叶内源性衍生香料的制备 

方法：将2kg水加入步骤2所得烟叶发酵产物中，混合均匀后转入烧瓶中，在100℃下回流提取2h，用纱布过滤去除残渣后得到的滤液在60℃下减压浓缩到一半体积。加入3-5倍体积的95%的乙醇，静置10-24h，取上清液并在60℃下减压浓缩到五分之一体积，得到的烟膏即为烟叶内源性衍生香料，利用GC/MS测定香料的香气成分。 

本发明将OF-01菌株通过液体培养，获得的菌体用于发酵烟叶碎片，发酵结束以后，通过提取、浓缩获得的香料可用于卷烟加工。 

本发明利用OF-01菌株制备的香料具有无毒、对人畜安全的优点。 

本发明获得的香料含多种烟草香气成分和其他衍生香气成分，含量较高的香气物质主要有尼古丁，乙酸苯乙酯，新植二烯，二羟基紫罗兰酮，十八二烯酸甲酯，十六烯酸乙酯，正三十七醇等。加香评吸实验结果表明，该香料具有明显提调烟香、醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。 

5、产品特征及理化性质 

本产品是红棕色流状膏体，不澄清。产品的理化性质见表1。 

表1.生化添加剂的理化性质 

6、卷烟加香及评吸实验 

取新制备的烟叶内源性衍生香料0.1g，用无菌水稀释40倍，均匀喷洒在40g烟丝上，用密封袋密封后在80℃烘箱中放置30min，并以不加香料的烟丝作为对照，将处理组和对照组的烟丝放入恒温恒湿箱内平衡24h后，按常规方法卷成烟支并随机编号后，由专业评吸人员进行感官评吸。 

7、香料浸膏致香成分检测和应用效果评价 

致香成分检测结果表明：利用OF-01菌株发酵烟叶碎片制备的内源性衍生香料含有丰富的烟草香气成分和其他衍生香气成分，按含量高达排列分别包括：尼古丁（35.47%），乙酸苯乙酯（17.25%），新植二烯（7.51%），二羟基紫罗兰酮（1.78%），十八二烯酸甲酯（1.53%），十六烯酸乙酯（1.26%），正三十七醇（1.17%），此外，还含有含量在1%以下的异戊酸、丙酸、2-甲基丙酸、丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸、4-氧代戊酸、壬酸、十八碳烯酸、巨豆三烯酮。 

加香评吸实验结果表明，该香料浸膏具有明显提调烟香、醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。同时，该香料的应用减少了非烟草来源的香精香料在卷烟配方中的用量，提高了烟叶碎片的利用率。 

评吸结果如表2所示 

表2  OF-01菌株烟叶内源性衍生香料的感官评吸结果 

本发明实验证明：从烟叶表面筛选得到一批与酵母有密切关系的真菌出芽短梗霉，通过将这些真菌作用于烟叶碎片，这些真菌能够利用烟草自身糖分物质进行发酵，促进多糖合成，并提高氮产量，产生胞外多聚糖短梗霉多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白、挥发性香气成分等多种产物,通过对发酵后烟叶碎片进行提取、浓缩，可获得烟草内源性衍生香料，从而减少非烟草来源的香精香料产品在卷烟中的应用，实现烟叶碎片的再利用。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做出的进一步详细说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出的明显变型，性能或者用途相同，都应视为本发明的保护范围。 

Claims (8)

1.一种出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609），其具有产生短梗霉多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白、挥发性香气的能力。

2.权利要求1所述的出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）的ITS基因序列在GeneBank数据库中的序列号为JQ916049，该基因序列用于鉴别OF-01菌株。

3.权利要求1所述的出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）作为烟用添加剂。

4.权利要求1所述的出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）在制备烟叶内源性衍生香料中的应用。

5.用权利要求1所述的出芽短梗霉菌株OF-01（CGMCC No.7609）制备烟草内源性衍生香料的方法，将OF-01菌株通过试管斜面种子培养、液体种子培养、菌株发酵罐大量培养获得的菌体用于烟叶碎片发酵，发酵结束后，通过提取、浓缩得烟草内源性衍生香料。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于OF-01（CGMCCNo.7609）菌株试管斜面种子培养是将该菌株的菌体接种到MYP培养基即麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0斜面上，20-30℃下培养4-10d后获得斜面种子，适宜的培养条件是28℃下培养7d；OF-01菌株液体种子培养是将斜面种子接种到三角瓶中的MYP的液体培养基中，15-30℃，50-300rpm条件下摇床培养3-7d，最适培养条件为28℃，200rpm条件下培养4d；OF-01菌株发酵罐大量培养是将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000L发酵罐中的培养条件为：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间4-6d。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于烟叶碎片发酵是取1kg烟叶碎片，加入100g糖蜜，用清水将湿度调节到30-50%，混合均匀后于蒸汽湿热高压灭菌锅中121℃灭菌1h，冷却后接种OF-01菌株液体种子100mL，混合均匀后在25-35℃下温箱中培养7-15d。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于烟叶内源性衍生香料的制备是将2kg水加入烟叶发酵产物中，混合均匀后转入烧瓶中，在100℃下回流提取2h，用纱布过滤去除残渣后得到的滤液在60℃下减压浓缩到一半体积；加入3-5倍体积的95%的乙醇，静置10-24h，取上清液并在60℃下减压浓缩到五分之一体积，得到的烟膏即为烟叶内源性衍生香料，利用GC/MS测定香料的香气成分。