CN102399725B - 一组卷烟赋香菌株及复配的微生物制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卷烟叶组赋香复配微生物制剂及其复配方法,该卷烟叶组赋香微生物制剂组成为芽孢杆菌(Bacillus sp..)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillus sp..)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces.sp.)LBT1.0038,在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号分别为CGMCC No.5332、CGMCC No.5333和CGMCC No.5334。该复配菌株均由醇化烟叶表面分离筛选获得,是一种新的卷烟叶组赋香微生物制剂,经该微生物处理后,卷烟叶组的吸食品质改善明显,达到商品化卷烟相关技术要求。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,具体涉及3种卷烟赋香菌株及复配的卷烟赋香微生物制剂,其中包括2株芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)和1株酵母菌(Saccharomyces sp.),该卷烟赋香微生物制剂能够用于卷烟发酵,替代传统的加香,经发酵处理的卷烟理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。
背景技术
卷烟工业中,根据不同卷烟叶组中的烟叶品种、烟叶产地、烟叶等级、烟叶年份和烟叶配比等,通过加料加香,赋予卷烟产品特定产品风格,提供给消费者特定的感官体验。通过加料,可以改善卷烟的吸食品质、改善烟丝的物理性状、改善烟丝的燃烧性和防止烟丝霉变等;通过加香,在不损害烟叶原有香气的情况下,衬托烟香,同时掩盖杂气,达到增香赋香、改善吃味和协调香味的作用,进而最终形成卷烟产品风格。按照来源不同,烟草香料包括天然香料和合成香料2大类。然而,世界卫生组织(WHO)在《烟草控制框架公约》中建议各国限制或禁止在烟草中使用香料等添加剂,包括葡萄糖、蜂蜜、香草醛和中草药等天然或合成烟香香料都在范围内。我国已于2005年正式批准《烟草控制框架公约》,减少和限制天然和合成香料的使用是大势所趋。
采用烟叶表面微生物来达到替代传统加料加香的目的,以期形成新的卷烟的卷烟产品。本领域技术人员也做了大量的工作,实际上,微生物发酵已被证明可改善烟叶可用性,是烟叶吸食品质形成的重要环节,根据发酵方式的不同,可分为人工发酵和自然发酵,国内外学者针对烟叶的人工发酵进行了大量的研究和实践。然而,但还未有仅使用复配微生物制剂用于卷烟产品风格形成的报道。
发明内容
针对卷烟工业发展的需求,本发明目的在于,通过分离、筛选、培养得到了3株卷烟赋香菌株,经复配可以用于卷烟叶组的赋香,替代传统加料加香工艺。经实验证明,采用该复配菌株制剂用于卷烟发酵后,卷烟的理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。
为了实现上述任务,本发明的方法通过以下技术方案得以实现:
一种卷烟赋香菌株,其特征在于,该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007,保藏号为CGMCC No.5332。
一种卷烟赋香菌株,其特征在于,该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013,保藏号为CGMCC No.5333。
一种卷烟赋香菌株,其特征在于,该卷烟赋香菌株命名为酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038,保藏号为CGMCC No.5334。
一种卷烟赋香微生物复配制剂,其特征在于,该卷烟赋香微生物复配制剂含有芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomycessp.)LBT1.0038,且芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007∶芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013∶酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038=(0.001~1)∶(0.001~1.5)∶(0.005~15)。
上述芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013的分离筛选方法,其特征在于,该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后,用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10-1菌悬液,然后逐级稀释,取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上,37℃恒温培养24h,挑取长势良好,菌落饱满均匀,且稀释度适宜的平板的单菌落,镜检;
LB培养基主要成分为:胰化蛋白胨:1%,酵母提取物:0.5%,NaCl:1%;酵母提取物(yeast extract),也称酵母膏,市售。
镜检若为纯培养单一菌株,则接种于LB斜面固体培养基,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
LB斜面固体培养基主要成分为:胰化蛋白胨:1%,酵母提取物:0.5%,NaCl:1%;琼脂:2%;
镜检若为混合菌株,则再次在LB培养基平板上进行划线分离,直至镜检为菌株纯培养物后,接种斜面试管,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵,并根据烟叶理化性质和评吸结果,最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
上述酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的分离筛选方法,其特征在于,该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后,用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10-1菌悬液,然后逐级稀释,取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到YPD培养基上,32℃恒温培养24h,挑取长势良好,菌落饱满均匀,且稀释度适宜的平板的单菌落,镜检;
YPD培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%;
镜检若为纯培养单一菌株,则接种于YPD斜面固体培养基,32℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
YPD斜面固体培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%;琼脂:2%;
镜检若为混合菌株,则再次在YPD培养基平板上进行划线分离,直至镜检为菌株纯培养物后,接种斜面试管,32℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵,并根据烟叶理化性质和评吸结果,最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
上述芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013的培养方法,其特征在于,将保藏的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液;其中,LB液体培养基主要成分为:胰化蛋白胨:1%,酵母提取物:0.5%,NaCl:1%;琼脂:2%,pH自然;
所得到的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用。
上述酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的培养方法,其特征在于,将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038从斜面接种2环至100mL的YPD液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液;其中,YPD液体培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%,琼脂:2%,pH自然;
所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用。
上述卷烟赋香微生物复配制剂的配制方法,其特征在于,将各菌株发酵液、粉剂或冻干粉在4℃条件下,于8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,称量,然后以芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007∶芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013∶酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038=(0.001~1)∶(0.001~1.5)∶(0.005~15)的比例复配。
将上述烟赋香微生物复配制剂用于卷烟叶组发酵的应用,将卷烟赋香复配菌株制剂按照0.0001wt%~10wt%质量比例喷施于切后烟丝/叶组或烘后烟丝/叶组的表面进行发酵。
本发明得到的3株卷烟赋香菌株,并配制成卷烟叶组赋香复配微生物制剂,具有易培养、增香效果好、发酵速度快、降害效果明显等,是一种新的卷烟赋香复配微生物制剂。
具体实施方式
为了获得卷烟叶组赋香菌株,申请人从烟叶表面分离、筛选可使卷烟叶组赋香的一组微生物菌株,即芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038,于2011年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,并配制成卷烟叶组复配赋香微生物,该复配微生物制剂其可实现卷烟叶组的增香和降害。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为CGMCC No.5332、CGMCC No.5333和CGMCC No.5334。
以下给出具体的分离、筛选的实施例。
1)芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013的分离与筛选:
从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株,其分离方法是:先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后,用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10-1菌悬液,然后逐级稀释,取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上,37℃恒温培养24h,挑取长势良好,菌落饱满均匀,且稀释度适宜的平板的单菌落,镜检。
镜检若为纯培养单一菌株,则接种于LB斜面固体培养基,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
镜检若为混合菌株,则再次在LB培养基平板上进行划线分离,直至镜检为菌株纯培养物后,接种斜面试管,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
LB培养基主要成分为:胰化蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%;pH自然,
LB斜面固体培养基是在LB培养基的基础上加入2%琼脂成为LB斜面固体培养基;pH自然。
镜检若为纯培养单一菌株,则接种于LB斜面固体培养基,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
镜检若为混合菌株,则再次在LB培养基平板上进行划线分离,直至镜检为菌株纯培养物后,接种斜面试管,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵,并根据烟叶理化性质和评吸结果,最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
2)酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的分离与筛选:
从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株,其分离方法是:
该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后,用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10-1菌悬液,然后逐级稀释,取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10- 7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到YPD培养基上,32℃恒温培养24h,挑取长势良好,菌落饱满均匀,且稀释度适宜的平板的单菌落,镜检;
YPD培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%;
YPD斜面固体培养基是在YPD培养基加入2%琼脂成为YPD斜面固体培养基;pH自然。
镜检若为纯培养单一菌株,则接种于YPD斜面固体培养基,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
镜检若为混合菌株,则再次在YPD培养基平板上进行划线分离,直至镜检为菌株纯培养物后,接种斜面试管,37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱;
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵,并根据烟叶理化性质和评吸结果,最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
将所得的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013进行培养,其方法是,将保藏的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007新鲜发酵液;其中,LB液体培养基主要成分为:胰化蛋白胨:1%,酵母提取物:0.5%,NaCl:1%;琼脂:2%,pH自然;
所得到的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用。
将所得的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038进行培养,其方法是,将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038从斜面接种2环至100mL的YPD液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038新鲜发酵液;其中,YPD液体培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%,琼脂:2%,pH自然;
所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用。
3)将得到的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的发酵液在4℃条件下,按照芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007∶芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013∶酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038=(0.001~1)∶(0.001~1.5)∶(0.005~15)的比例复配,得到卷烟赋香微生物复配制剂。如果采用粉剂或冻干粉可直接进行复配。
4)用于卷烟叶组发酵
将得到卷烟赋香微生物复配制剂,按照0.0001wt%~10wt%质量比例均匀喷洒到卷烟叶组上进行恒温恒湿发酵。发酵后的卷烟叶组经烘丝、卷接和包装,获得卷烟成品
经实验证明,采用该复配菌株制剂用于卷烟发酵后,卷烟的理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准(表1,表2)。
表1赋香复合微生物制剂的卷烟理化指标
总氮(%) | 氯(%) | 钾(%) | 烟碱(%) | |
赋香复合微生物制剂卷烟 | 2.04 | 0.32 | 1.537 | 2.04 |
对照组(喷施等量去离子水) | 2.01 | 0.32 | 2.31 | 2.12 |
表2赋香复合微生物制剂的卷烟评吸结果
评吸人 | 样品编号 | 光泽 | 香气 | 协调 | 杂气 | 刺激性 | 余味 | 合计 |
空白样 | 5 | 29 | 5 | 10 | 17 | 22 | 88 | |
1 | 赋香复合微生物制剂卷烟 | 5 | 30 | 6 | 10.5 | 18 | 23 | 92.5 |
2 | 赋香复合微生物制剂卷烟 | 5 | 29.5 | 5 | 10.5 | 17.5 | 22 | 89.5 |
3 | 赋香复合微生物制剂卷烟 | 5 | 29.5 | 5.5 | 10 | 18 | 22.5 | 90.5 |
4 | 赋香复合微生物制剂卷烟 | 5 | 29.5 | 5.5 | 10 | 17.5 | 23.0 | 90.5 |
5 | 赋香复合微生物制剂卷烟 | 5 | 29.5 | 6.0 | 10 | 17.5 | 22.5 | 90.5 |
均值 | 5 | 90.7 |
Claims (3)
1.一种卷烟赋香微生物复配制剂,其特征在于,制得的该卷烟赋香微生物复配制剂含有芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038,且芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0007:芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1.0013:酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038=(0.001~1):(0.001~1.5):(0.005~15);
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0007,保藏号为CGMCC No.5332;
所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013,保藏号为CGMCC No.5333;
所述的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038,保藏号为CGMCCNo.5334。
2.权利要求1所述的卷烟赋香微生物复配制剂的配制方法,其特征在于,将保藏的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1.0007从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillussp.)LBT 1.0007发酵液;其中,LB液体培养基主要成分为:胰化蛋白胨:1%,酵母提取物:0.5%,NaCl:1%;pH自然;
所得到的芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT 1.0007发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用;
将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038从斜面接种2环至100mL的YPD液体培养基中,于27℃~37℃,100rpm~180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h,得到酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液;其中,YPD液体培养基主要成分为:酵母膏:1%,蛋白胨:2%,葡萄糖:2%,pH自然;
所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液在4℃条件下,以8500r/min~11000r/min离心5min~15min,弃上清液得到湿菌体,进一步得到粉剂或冻干粉,保藏于4℃冰箱备用;
以芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0007:芽孢杆菌(Bacillus sp.)LBT1.0013:酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038=(0.001~1):(0.001~1.5):(0.005~15)的比例复配。
3.权利要求1所述的卷烟赋香微生物复配制剂用于卷烟叶组发酵的应用,将卷烟赋香复配菌株制剂按照0.0001wt%~10wt%质量比例喷施于切后烟丝/叶组或烘后烟丝/叶组的表面进行发酵。
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几株食用菌对初烤烟品质的影响;邹晓等;《中国食用菌》;20110630(第3期);表4 * |
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邹晓等.几株食用菌对初烤烟品质的影响.《中国食用菌》.2011,(第3期),表4. |
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