CN115181737B - 叶黄素裂解酶、制备及合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法 - Google Patents

叶黄素裂解酶、制备及合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶、其制备方法及其合成3‑羟基‑β‑紫罗兰酮的方法。所述霍氏肠杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608。所述叶黄素裂解酶，经菌种活化、发酵培养、菌体收集、细胞破碎、硫酸铵沉淀、过柱纯化等步骤制备而成。利用叶黄素裂解酶在标准反应体系中，在40℃‑55℃条件下水解反应降解叶黄素30min‑90min，获得3‑羟基‑β‑紫罗兰酮。本申请的方法使用霍氏肠杆菌制备叶黄素裂解酶，进而使用该酶合成3‑羟基‑β‑紫罗兰酮。本申请所用的叶黄素裂解酶制备、纯化步骤简单，产量高；转化反应中转化效率高，能够有效克服现有化学合成和生物工程法制备3‑羟基‑β‑紫罗兰酮的缺点。

Description

叶黄素裂解酶、制备及合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及一种霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶、制备及其合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法。
背景技术
3-羟基-β-紫罗兰酮是一种具有果香和紫罗兰香味的香精香料，广泛应用于糖果、乳制品、饮料、肉类和烘焙等食品工业；同时3-羟基-β-紫罗兰酮也是烟草行业重要的合成香料，具有提高卷烟烟气质量的作用，在降低烟气焦油和烟碱方面起到显著的加香效果。目前3-羟基-β-紫罗兰酮主要通过化学有机合成方法进行制备，化学方法合成该类物质主要存在合成步骤较多、产率较低、能耗高和副产物多等问题，并且化学合成的3-羟基-β-紫罗兰酮不是“绿色产品”，无法满足市场上对“绿色天然”香精香料的需求。
以类胡萝卜素物质(比如叶黄素)为底物，采用微生物发酵方法制备3-羟基-β-紫罗兰酮是一定程度解决化学合成方法存在问题。Sanchez-Contreras等人(AppliedMicrobiology and Biotechnology，2000,54,528–534)从万寿菊花中分离Geotrichum sp.和Bacillus sp.混合培养物，发现能够降解叶黄素产生挥发性香料物质，其中Geotrichumsp.将叶黄素氧化生成β-紫罗兰酮，芽孢杆菌Bacillus sp.进一步将β-紫罗兰酮还原生成3-羟基-β-紫罗兰酮。Rodríguez-Bustamante等人(Applied Microbiology andBiotechnology，2005,68,174–182)发现阿氏丝孢酵母Trichosporon asahii和解淀粉类芽孢杆菌Paenibacillus amylolyticus的混合菌种能够将叶黄素转化为β-紫罗兰酮和3-羟基-β-紫罗兰酮。杨雪鹏等人发现分散泛菌Pantoea dispersa Y08能够裂解叶黄素9'-10'的双键位置，产生芳香混合化合物β-紫罗兰酮和3-羟基-β-紫罗兰酮(中国专利，申请号201510466265.5)。目前微生物发酵方法制备3-羟基-β-紫罗兰酮主要存在副产物较多、转化率不高、分离目的产物较为困难等问题。微生物酶法制备3-羟基-β-紫罗兰酮是近年来发展起来的新方法，该方法具有转化率高、专一性强、低成本和环境友好等特点。同时采用微生物发酵和生物酶法制备3-羟基-β-紫罗兰酮，被认为是“绿色天然”香料，具有更为可靠的食品安全性，因此在工业上具有广阔的应用前景。
鉴于目前化学合成方法制备3-羟基-β-紫罗兰酮的不足，提出一种利用叶黄素裂解酶制备3-羟基-β-紫罗兰酮方法。
发明内容
针对上述问题，本申请提供了一种使用霍氏肠杆菌制备叶黄素裂解酶，进而使用该酶合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法。
本发明提供了一种霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶、制备及其合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法。
本发明提供的一种霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶的制备方法包括如下步骤：
(1)将保藏的菌株接种到活化培养基培养24h；
(2)将步骤(1)中活化后的菌种接种到发酵培养基中，震荡培养至OD600nm＝1.0；
(3)将步骤(2)中所制备的发酵液离心，弃上清，收集菌体；
(4)将步骤1(3)中收集到的细胞超声破壁；
(5)将破壁后的细胞离心，收集上清液；
(6)用硫酸铵分级沉淀法处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起，溶解在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中；
(7)用相同的缓冲液透析过夜；
(8)将样品过Q-琼脂糖柱，收集所有活性组分；
(9)将获得的样品用滤膜过滤，获得浓缩酶蛋白；
(10)浓缩酶蛋白过柱纯化，获得降解叶黄素活性酶蛋白；
(11)将获得的样品用滤膜过滤，获得浓缩酶蛋白；
(12)浓缩酶蛋白过凝胶柱，获得纯化活性酶蛋白；
(13)将纯化后的酶蛋白溶于保护液，置于-80℃保存。
步骤(1)所述菌株为：霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608。
步骤(1)中活化培养基为LB培养基：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物3-7g，氯化钠8-12g，琼脂粉13-17g，水1000mL。活化培养条件为：在28℃条件下培养12-48h；优选为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15，水1000mL；活化培养条件为：在28℃条件下培养24h。
步骤(2)中，发酵培养基为：叶黄素15-25g，0.8-1.2g K2HPO4，0.2-0.6g MgSO4·7H2O，2.0-4.0g NaNO3，0.3-0.6g KCl，0.01-0.02g FeSO4·7H2O，25g-30g蔗糖，2.0-3.0g酵母提取物，水1000mL；发酵培养条件为在25-28℃、100-200r/min条件下震荡培养36h-60h；优选为叶黄素20.0g，1.0g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，3.0g NaNO3，0.5g KCl，0.01gFeSO4·7H2O，30g蔗糖，3.0g酵母提取物，水1000mL；发酵培养条件为在28℃、150r/min条件下震荡培养36h-60h至OD600nm＝1.0。
步骤(3)所述离心条件为：在4-6℃下10000rpm离心10-20min；优选在4℃下10000rpm离心10min。
步骤(4)所述超声条件为：将细胞悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，进行超声破壁。
步骤(5)所述离心条件为：将破壁后的细胞与1％(v/v)的TritonX-100在4℃、80rpm下孵育4小时，离心15min。
步骤(6)所述，硫酸铵分级沉淀的条件为：分别用50％、60％、70％、80％的硫酸铵(w/v)依次步处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起，溶解在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中。
步骤(7)所述透析用的缓冲液为：pH7.2的20mM Tris-HCl缓冲液。
步骤(8)所述过柱的条件为：将样品装入Q-琼脂糖柱(1×20cm2)用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡，用100ml氯化钠从50mM到600mM的线性梯度洗脱柱，收集所有活性组分。
步骤(9)所述过滤使用的滤膜为：10-kDa分子量的滤膜。
步骤(10)所述过柱纯化的条件为：将浓缩蛋白装入苯基琼脂糖柱(1×20cm2)，用含有1.0M(NH4)2SO4的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)预平衡，并在(NH4)2SO4浓度为0.7M时洗脱，显示有叶黄素降解活性的部分合并。
步骤(11)所述过滤使用的滤膜为：10-kDa分子量的滤膜。
步骤(12)所述过柱纯化的条件为：将浓缩蛋白装载到Superdex 200凝胶过滤(16/60)柱上。该柱用含有100mM氯化钠的20mM Tris-HCl(pH7.2)平衡。馏分粒径为1ml，流量为1ml/min，收集具有叶黄素降解活性的组分。
步骤(13)所述保护液为：含有25％(v/v)甘油的20mM Tris-HCl(pH7.2)。
优选地，叶黄素裂解酶的制备步骤包括：
(一)、叶黄素裂解酶的制备
1、菌株的发酵培养和菌体的收集
(1)将保藏的菌株接种到活化培养基中，在28℃条件下培养24h；所述菌株为霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)由郑州轻工业大学赠送，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608。所述活化培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15，水1000mL。
(2)将步骤(1)中活化后的菌种接种到发酵培养基中，在28℃、150rpm条件下震荡培养36h-60h至OD600nm＝1.0。所述发酵培养基为：叶黄素20.0g，1.0g K2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，3.0g NaNO3，0.5g KCl，0.01g FeSO4·7H2O，30g蔗糖，3.0g酵母提取物，水1000mL。所述培养时间为36h-60h至OD600nm＝1.0。
(3)将步骤(2)中所制备的发酵液转至灭菌的50mL离心管，4℃下10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。
2、叶黄素裂解酶的纯化制备
(4)将步骤(3.1)中收集到的细胞悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，并超声破壁。
(5)将破壁后的细胞与1％(v/v)的TritonX-100在4℃、80rpm下孵育4小时，然后在12000g下离心15min，收集上清液。
(6)用硫酸铵分级沉淀法处理上清液。分别用50％、60％、70％、80％的硫酸铵(w/v)依次步处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起。将沉淀蛋白质溶解在20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)中，然后用相同的缓冲液透析过夜。
(7)将样品装入Q-琼脂糖柱(1×20cm2)用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡，用100ml氯化钠从50mM到600mM的线性梯度洗脱柱，收集所有活性组分，并使用10-kDa分子量的膜进行浓缩，将浓缩蛋白装入苯基琼脂糖柱(1×20cm2)，用含有1.0M(NH4)2SO4的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)预平衡，并在(NH4)2SO4浓度为0.7M时洗脱，显示有叶黄素降解活性的部分合并。
(8)使用10-kDa分子量的膜浓缩，将浓缩蛋白装载到Superdex 200凝胶过滤(16/60)柱上。该柱用含有100mM氯化钠的20mM Tris-HCl(pH7.2)平衡。馏分粒径为1ml，流量为1ml/min，收集具有叶黄素降解活性的组分，用SDS-PAGE进行分析。蛋白质浓度采用Braford法测定。
(9)将纯化后的蛋白溶于含有25％(v/v)甘油的20mM Tris-HCl(pH7.2)中，在-80℃保存。
本发明同时提供了用上述制备得到的叶黄素裂解酶合成3-羟基-β-紫罗兰酮的方法，包括如下步骤：
(1)配制好水解反应所需的缓冲液；
(2)将底物加入到缓冲液中，混匀，形成标准反应混合液；
(3)在标准反应混合液中加入叶黄素裂解酶，在一定条件下充分反应，获得3-羟基-β-紫罗兰酮。
所述缓冲液为：2.0％(w/v)Tween 40，200mM NaCl，15μM FeSO4，10mM三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，1％(w/v)1-s-辛基-β-D-硫代甘脲苷，50mM tricine/KOH缓冲液(pH8.0)。
所述底物为：叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质、β-胡萝卜素，优选底物为叶黄素，叶黄素使用浓度为10μM-150μM。
所述叶黄素裂解酶的浓度为：0.1U/ml-4.0U/ml；反应条件为：在40℃-55℃条件下水解反应30min-90min。
优选方案为：
(1)、配制好叶黄素水解反应所需的缓冲液；
(2)、在缓冲液中加入叶黄素；
(3)、加入叶黄素裂解酶1.5U/ml，混匀后置于45℃条件下水解反应60min，获得3-羟基-β-紫罗兰酮。
步骤(1)中所述缓冲液为：2.0％(w/v)Tween 40，200mM NaCl，15μM FeSO4，10mM三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，1％(w/v)1-s-辛基-β-D-硫代甘脲苷，50mM tricine/KOH缓冲液(pH8.0)。
步骤(2)中所述叶黄素浓度为10μM-150μM。
步骤(3)中所述叶黄素裂解酶0.1U/ml-4.0U/ml，混匀后置于40℃-55℃条件下水解反应30min-90min。
有益效果：
本申请的方法使用霍氏肠杆菌制备叶黄素裂解酶，进而使用该酶合成3-羟基-β-紫罗兰酮。本申请所用的叶黄素裂解酶制备、纯化步骤简单，产量高；转化反应中转化效率高，能够有效克服现有化学合成和生物工程法制备3-羟基-β-紫罗兰酮的缺点。
附图说明
图1纯化后的叶黄素裂解酶SDS-PAGE分析，1：蛋白Marker；2、3：纯化后叶黄素裂解酶。
图2叶黄素裂解酶最适反应温度。
图3叶黄素裂解酶最适反应pH。
图4酶浓度对3-羟基-β-紫罗兰酮产量的影响。
图5叶黄素浓度对3-羟基-β-紫罗兰酮产量的影响。
图6在最佳反应条件下3-羟基-β-紫罗兰酮产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。
实验物料：
微生物菌株：霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)由郑州轻工业大学赠送，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.10608。
试剂：叶黄素(纯度≥80％)：上海源叶生物技术有限公司；CH2Cl2(分析纯谱纯)：天津市凯通化学试剂有限公司；；K2HPO4(分析纯)：广东省汕头市西陇化工厂；NaNO3(分析纯)：天津市致远化学试剂有限公司；KCl(分析纯)：中国派尼化学试剂厂(郑州)；NaCl(分析纯)：生工生物工程(上海)有限公司；MgSO4·7H2O(分析纯)：广东省汕头市西陇化工厂；蔗糖(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；酵母粉(分析纯)：英国OXOID公司；吐温80(分析纯)，IPTG(分析纯)，Tris-base(分析纯)，Glycine(电泳级)：生工生物工程(上海)有限公司。
实验设备
冷冻离心机J6-MI：美国Beckman公司；立体压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS：上海申安医疗器械厂；单人双面净化工作台SW-CJ-IF：苏州净化设备有限公司；摇床QYC-211：上海福玛实验设备有限公司；LC-MS联用仪(APCI源)LTQ-XL：美国Thermo公司；超声波细胞粉粹机JY92-ⅡDN：宁波新芝生物科技股份有限公司；电泳仪DYY-6C：北京市六一仪器厂；全自动凝胶成像分析仪JB-680B：上海培清科技有限公司。
实验方法：
叶黄素裂解酶的纯化方法
2.0L霍氏肠杆菌在28℃培养2d，12000rpm离心15min收集细胞。将收集到的细胞悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，并超声破壁。将破壁后的细胞与1％(v/v)的TritonX-100在4℃、80rpm下孵育4小时，然后在12000g下离心15min，去除细胞碎片和变性蛋白，然后利用50％-80％(w/v)的硫酸铵沉淀法逐级沉淀蛋白质，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起。混合物放置过夜，沉淀在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中溶解，用相同的缓冲液透析过夜。将样品被装入Q-琼脂糖柱(1×20cm2)用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡，用100ml氯化钠从50mM到600mM的线性梯度洗脱柱，收集所有活性组分，并使用10-kDa分子量的膜进行浓缩，将浓缩蛋白应用于苯基琼脂糖柱(1×20cm2)，用含有1.0M(NH4)2SO4的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)预平衡，并在(NH4)2SO4浓度为0.7M时洗脱。显示有叶黄素降解活性的部分合并，使用10-kDa分子量的膜浓缩，将浓缩蛋白装载到Superdex 200凝胶过滤(16/60)柱上。该柱用含有100mM氯化钠的20mM Tris-HCl(pH7.2)平衡。馏分粒径为1ml，流量为1ml/min，收集具有叶黄素降解活性的组分，用SDS-PAGE进行分析。蛋白质浓度采用Braford法测定。纯化后的蛋白保存在20mM Tris-HCl(pH7.2)中，其中含有25％(v/v)甘油，温度为-80℃。
叶黄素裂解酶活性测定方法
标准反应体系含有60μM叶黄素，2.0％(w/v)Tween 40，200mM氯化钠，15μM FeSO4，10mM Tricine(2-羧乙基)磷盐酸盐，1％(w/v)1-s-辛基-β-D-硫代甘脲苷和50mM tricine/KOH缓冲液(pH8.0)预孵育2min，然后加入纯化酶(0.5U/ml)开始反应。在45℃下测定60min的降解活性，用液相色谱-质谱LC-MS分检测反应产物。利用安捷伦1100HPLC系统和BrukerEsquire 3000plus质谱仪在正离子模式下用电喷雾离子源(ESI)，对上述酶催化样品进行了表征。在色谱分离中，使用了150cm×2.1mm、1.8μm LUNA C18柱和由0.1％的甲酸在水中(A)和0.1％的甲酸在乙腈(B)组成的流动相。采用线性洗脱梯度如下：50％B 1min，梯度变化的50％到80％B 8min，梯度变化的80％B到100％B 5min，100％B 3min，重新平衡到60％B5min。检测波长为285nm，流量为0.5ml/min。质谱仪器参数包括：ESI毛细管电压4kV，源温和去溶剂化温度300℃。质谱测量的速率为0.85s-1测量范围为m/z50到500。一个酶活性单位定义：在标准条件下每分钟释放1μmol的3-羟基-β-紫罗兰酮所需的酶的量。
LC-MS检测方法
使用1290Infinity II UPLC(Agilent Corp.，DE，USA)与配备电喷雾离子(ESI)检测器的AB SCIEX Triple QuadTM 5500(AB SCIEX，USA)结合使用偶联的高效液相色谱仪进一步分析所得溶液。色谱分离使用BEH Amide XP色谱柱(内径2.5μm，3mm x 150mm，Waters，美国)与乙腈(溶剂A)和10mM乙酸铵pH 9.2(溶剂B)组成的流动相一起进行色谱分离。进样前，用95％A：5％B平衡色谱柱10分钟。15分钟后，使用逐步梯度从95％A：5％B到70％A：30％B的梯度进行分离，恒定流速为150μL·min-1。在ESI正离子模式下进行质谱分析，离子喷雾电压为3500V，温度为350℃。雾化器气体和加热器气体设置为40psi。分析数据由Analyst软件(1.6.3版)处理。
实施例1
菌株的发酵培养和菌体的收集
从-80℃冰箱中取出保存的霍氏肠杆菌，转接LB培养基，在28℃培养箱里培养24h。然后将活化后的菌种接种到2L发酵培养基中，在28℃、150r/min条件下震荡培养48h至OD600nm＝1.0。将培养好的发酵液在4℃下10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，备用。
实施例2
叶黄素裂解酶的纯化
取实施例1中集到的细胞悬浮在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，并超声破壁。将破壁后的细胞与1％(v/v)的TritonX-100在4℃、80rpm下孵育4小时，然后在12000rpm下离心15min，收集上清液。用硫酸铵分级沉淀法处理上清液。分别用50％、60％、70％、80％的硫酸铵(w/v)分步处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起。将沉淀蛋白质溶解在20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)中，然后用相同的缓冲液透析过夜。
将样品装入Q-琼脂糖柱(1×20cm2)用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡，用100ml氯化钠从50mM到600mM的线性梯度洗脱柱，收集所有活性组分，并使用10-kDa分子量的膜进行浓缩，将浓缩蛋白装入苯基琼脂糖柱(1×20cm2)，用含有1.0M(NH4)2SO4的20mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)预平衡，并在(NH4)2SO4浓度为0.7M时洗脱，显示有叶黄素降解活性的部分合并。使用10-kDa分子量的膜浓缩，将浓缩蛋白装载到Superdex 200凝胶过滤(16/60)柱上。该柱用含有100mM氯化钠的20mM Tris-HCl(pH7.2)平衡。馏分粒径为1ml，流量为1ml/min，收集具有叶黄素降解活性的组分，获得纯化后叶黄素裂解酶。如图1所示，叶黄素裂解酶，分子量大小为50KDa。酶的纯化效率如表1所示，该酶的纯化率为9.90倍，产率为5.5％，比活性为2.27U/mg。的蛋白溶于含有25％(v/v)甘油的20mM Tris-HCl(pH7.2)中，在-80℃保存。经研究，霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶最适反应温度为45℃，最适pH为8.0(如图2和3所示)。各纯化步骤的效果如表1所示。
表1纯化来自霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶
步骤 总蛋白(mg) 总酶活(U) 比活力(U/mg) 纯化倍数 产率(％)
细胞内粗酶 536.3 125.6 0.23 1 100
(NH4)2SO4沉淀 300.5 113.9 0.37 1.61 56.0
Q-Sepharose column 129.5 98.6 0.76 3.30 24.1
Phenyl Sepharose 80.6 87.7 1.09 4.73 15.0
Superdex 200 29.5 66.9 2.27 9.90 5.5
实施例3
叶黄素裂解酶对不同来源类胡萝卜素的降解能力研究
以不同的类胡萝卜素为底物，测定了纯化的叶黄素裂解酶的底物特异性和动力学参数，如表2所示。叶黄素裂解酶的Km和kcat值由Michaelis-Menten方程计算。叶黄素裂解酶对叶黄素、玉米黄质、β-隐黄质和β-胡萝卜素具有较高的酶活性。叶黄素裂解酶的Km和Vmax值分别为14μM和89.5pmol mg-1s-1对于叶黄素，20μM和61.8pmol mg-1s-1对于玉米黄质，以及52μM和24.4pmol mg-1s-1对于β-隐黄素。叶黄素裂解酶对不同类胡萝卜素底物kcat/Km值的比较如下：叶黄素(0.393×103s-1mM-1)>玉米黄质(0.190×103s-1mM-1)>β-隐黄质(0.028×103s-1mM-1)>β-胡萝卜素(0.005×103s-1mM-1)。结果表明，叶黄素是类胡萝卜素中叶黄素裂解酶的最佳底物。
表2各种类胡萝卜素基质水解的动力学参数
实施例4
叶黄素裂解酶转化叶黄素制备3-羟基-β-紫罗兰酮
在叶黄素裂解酶酶活检测标准体系中，优化催化合成3-羟基-β-紫罗兰酮的活性。酶的浓度(0.1U/ml-4.0U/ml)和底物浓度(10μM-150μM)对酶促反应的影响如图4和图5，结果表明，3-羟基-β-紫罗兰酮随着酶浓度从0.1U/ml－1.5U/ml的增加而增加。酶浓度进一步增加(从1.5U/ml到4.0U/ml)，3-羟基-β-紫罗兰酮的产量没有明显增加，因此，1.5U/ml被认为是催化合成3-羟基-β-紫罗兰酮的最佳酶浓度。图5中结果表明，随着叶黄素浓度在10-60μM范围内增加，3-羟基-β-紫罗兰酮的产量增加，其中3-羟基-β-紫罗兰酮的产量最大在60μM处。在以上实验结果的基础上，建立在叶黄素裂解酶制备3-羟基-β-紫罗兰酮的最佳反应条件，酶浓度1.5U/ml，底物叶黄素浓度60μM，反应温度45℃，反应pH 8.0，其它反应条件为标准反应体系。在上述最佳反应条件下，叶黄素裂解酶酶在60min中产生637.2mg/L的3-羟基-β-紫罗兰酮，转化率为87.0％(w/w)(图6)。以上实验结果表明霍氏肠杆菌叶黄素裂解酶可以高效催化合成3-羟基-β-紫罗兰酮。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (15)

1.一种霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)叶黄素裂解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将保藏的菌株接种到活化培养基培养24h；所述菌株为：霍氏肠杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1.10608；
(2)将步骤(1)中活化后的菌种接种到发酵培养基中，在25-28℃、100-200r/min条件下震荡培养36h-60h至OD600nm＝1.0；所述发酵培养基成分为：15-25g叶黄素，0.8-1.2gK2HPO4，0.2-0.6g MgSO4·7H2O，2.0-4.0g NaNO3，0.3-0.6g KCl，0.01-0.02g FeSO4·7H2O，25g-30g蔗糖，2.0-3.0g酵母提取物，水1000mL；
(3)将步骤(2)中所制备的发酵液离心，弃上清，收集菌体；
(4)将步骤(3)中收集到的菌体超声破壁；
(5)将破壁后的菌体离心，收集上清液；
(6)用硫酸铵分级沉淀法处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起，溶解在20mM、pH7.2的Tris-HCl缓冲液中；
(7)用20mM、pH7.2的Tris-HCl缓冲液透析过夜；
(8)将透析过夜后的样品过Q-琼脂糖柱，收集所有活性组分；
(9)将步骤(8)获得的活性组分用滤膜过滤，获得浓缩酶蛋白；
(10)将步骤(9)获得的浓缩酶蛋白过柱纯化，获得具有降解叶黄素活性的酶蛋白；
(11)将步骤(10)获得的酶蛋白用滤膜过滤，获得浓缩酶蛋白；
(12)浓步骤(11)获得的浓缩酶蛋白过凝胶柱，获得纯化的活性酶蛋白；
(13)将步骤(12)获得的纯化的活性酶蛋白溶于保护液，置于-80℃保存。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中活化培养基为LB培养基，其成分为：胰蛋白胨8-12g，酵母提取物3-7g，氯化钠8-12g，琼脂粉13-17g，水1000mL；活化培养条件为：在28℃条件下培养12-48h。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中活化培养基为LB培养基，其成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，水1000mL；活化培养条件为：在28℃条件下培养24h。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养基成分为：20.0g叶黄素，1.0g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，3.0g NaNO3，0.5g KCl，0.01g FeSO4·7H2O，30g蔗糖，3.0g酵母提取物，水1000mL；在28℃、150r/min条件下震荡培养36h-60h至OD600nm＝1.0。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心条件为：在4-6℃下10000rpm离心10-20min。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心条件为：在4℃下10000rpm离心10min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述超声条件为：将菌体悬浮在pH7.2的20mM Tris-HCl缓冲液中，进行超声破壁。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述离心条件为：将破壁后的菌体与1％v/v的TritonX-100在4℃、80rpm下孵育4小时，离心15min。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述硫酸铵分级沉淀的条件为：分别用50％、60％、70％、80％w/v的硫酸铵依次处理上清液，收集每一步的沉淀蛋白质，混合在一起，溶解在20mM pH 7.2的Tris-HCl缓冲液中。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中过Q-琼脂糖柱的条件为：将样品装入1×20cm2的Q-琼脂糖柱，用pH 7.2的20mM Tris-HCl缓冲液平衡，用100ml氯化钠从50mM到600mM的线性梯度洗脱柱，收集所有活性组分。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(9)过滤使用的滤膜为：10kDa分子量的滤膜。
12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(10)过柱纯化的条件为：将浓缩酶蛋白装入1×20cm2的苯基琼脂糖柱，用含有1.0M(NH4)2SO4的，pH 7.2的，20mMTris-HCl缓冲液预平衡，并在(NH4)2SO4浓度为0.7M时洗脱，显示有叶黄素降解活性的部分合并。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(11)中过滤使用的滤膜为：10kDa分子量的滤膜。
14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(12)中过柱纯化的条件为：将浓缩酶蛋白装载到16/60的Superdex 200凝胶过滤柱上；该柱用含有100mM氯化钠的，pH 7.2的，20mM Tris-HCl平衡；馏分粒径为1ml，流量为1ml/min，收集具有叶黄素降解活性的组分。
15.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(13)中保护液为：含有25％v/v甘油的，pH7.2的，20mM Tris-HCl。
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