CN109880751A - 产香酵母yg-4、其筛选方法及用其制备烟用香料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种产香酵母YG‑4、其筛选方法及用其制备烟用香料的方法，其保藏编号为CGMCC NO.17223。产香酵母YG‑4用于烟草增香。产香酵母YG‑4的筛选方法为：通过对水果表皮菌种进行富集、分离，得到若干单菌落，将得到的单菌落分别进行活化培养，然后将其接入种子培养基中进行发酵，通过感官嗅辩对比的方法，筛选得到一株能够赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG‑4。相对于现有技术，本发明提供一种产香酵母YG‑4，其可以发酵含有烟末的种子培养基，能产生酯类、羰基类、酸类、烃类、醇类等32种对香气有贡献的物质，其中苯乙醇的含量较大，香味贡献较多，且利用了烟末本身作为香原料的特征，其运用到卷烟中易与烟草制品协调一致，提高了卷烟的抽吸品质。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术发酵领域，特别涉及一种产香酵母YG-4、其筛选方法及用其制备烟用香料的方法。
背景技术
随着卷烟加工工艺的提高以及“降焦减害”的推广，各大烟草企业开始探寻降焦途径，使得焦油等物质含量减少，然而香味成分也随之减少，烟气中香气不足故而无法满足消费者的需求。所以，目前急需解决的一个问题是如何弥补经过陈化等步骤后损失的香气。因此，使用香精香料来弥补烟气的不足成为主要研究方向，但是合成香料香味单一，天然香料植物资源有限，成本高，使得无法广泛使用。随着微生物技术的发展，并在烟草中的使用越来越广泛，尤其是在香料的制备以及品质改善方面越来越重要。
利用微生物来发酵烟叶产香的研究多是通过固态发酵，改善其烟叶品质。而利用微生物进行烟草的液态发酵，制备天然烟用香料的相关研究较少，因此，通过筛选新菌株进行液态发酵制备烟用香料对提高卷烟的抽吸品质具有重要作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223，此菌株的筛选方法及用此菌株制备的烟用香料的制备方法。
本发明的目的是以下述方式实现的：
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4用于烟草增香。
所述的产香酵母YG-4的筛选方法，通过对水果表皮菌种进行富集、分离，得到若干单菌落，对这些得到的单菌落分别进行活化培养，然后将其接入种子培养基中进行发酵，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照组的产香酵母YG-4。
所述的产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取水果表皮于锥形瓶中，加入无菌水，在恒温摇床中培养20 min~30 min，使水果表皮的微生物移至无菌水中，取出静置，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，取同等量的不同浓度菌液，分别涂布于固体培养基中，培养24-48h，观察其形态，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，分别进行活化培养，并置于恒温摇床培养12-24 h，得到菌液；
（4）发酵筛选：将菌液分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，然后将其在恒温摇床培养48-72 h，进行发酵培养，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照组的产香酵母菌株YG-4。
优选地，所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。
优选地，所述步骤（4）中，菌液接种量为3%-15%。
优选地，所述步骤（4）中发酵培养过程中，温度为25-42℃，时间为18-120h。
优选地，所述水果为葡萄。
一种用产香酵母YG-4制备烟用香料的方法，由所述的产香酵母YG-4对含有烟末的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行过滤浓缩，得到烟用香料。
优选地，所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。
相对于现有技术，本发明提供一种产香酵母YG-4、其筛选方法及用其制备烟用香料的方法，保藏编号为CGMCC NO.17223，其可以发酵含有烟末的种子培养基，能产生至少酯类、羰基类、酸类、烃类、醇类等32种对香气有贡献的物质，其中产生苯乙醇的含量较大，香味贡献较多，且利用了烟末本身作为香原料的特征，其运用到卷烟中易与烟草制品协调一致，提高了卷烟的抽吸品质。
生物保藏说明
产香酵母YG-4：
分类命名：汉逊酵母，拉丁文名称：Hansenula sp.；
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
保藏日期：2019年01月23日；
保藏编号：CGMCC No.17223。
具体实施方式
实施例1
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
具体地，所述产香酵母YG-4，分类命名为汉逊酵母Hanseniaspora.sp.，于2019年1月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保 藏编号为CGMCC NO.17223。
进一步地，所述产香酵母YG-4用于烟草增香。
本发明还提供了一种产香酵母YG-4的筛选方法，通过对水果表皮菌种进行富集、分离，得到若干单菌落，对这些得到的单菌落分别进行活化培养，然后将其接入种子培养基中进行发酵，得到发酵液，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照组的产香酵母菌株YG-4。对照组也称为空白对照组，筛选时，设置空白对照组，对照空白组是由不接菌的活化培养基以10%的接种量接入种子培养基中构成，将发酵好的样品液与空白对照组进行对比，将不同于空白对照组香味的发酵液取出进行嗅辩，筛选出能够赋予发酵液明显花香韵和甜香韵的一株菌株。
具体包括以下步骤：
（1）富集：取水果表皮于锥形瓶中，加入无菌水，在恒温摇床中培养20 min~30 min，使水果表皮的微生物移至无菌水中，取出静置，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，取同等量的不同浓度菌液，分别涂布于固体培养基中，培养24-48h，观察其形态，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；所述分离纯化的过程为：分别挑去固体培养基中的酵母菌，采用平板划线法分离到重新配制灭菌后的固体培养基中，进行培养，一直重复此步骤，直至培养基中出现纯酵母单菌落为止；所述固体培养基为YPD培养基，其组成为: 酵母粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、蒸馏水1L、琼脂20g；
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，分别进行活化培养，并置于恒温摇床培养12-24 h，得到菌液；上述活化培养基可以是YPD液体培养基，其组成可以为: 酵母粉10g、葡萄糖20g、蛋白胨20g、蒸馏水1L。
（4）发酵筛选：将菌液分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，然后将其在恒温摇床培养48-72 h，进行发酵培养，培养过程中观察发酵液香味变化，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照组的产香酵母菌株YG-4。
利用常规的WL表型鉴定、形态学鉴定以及分子鉴定对产香酵母YG-4进行种属的鉴定，其鉴定方法为现有技术，在此不再赘述。通过WL表型鉴定，可知产香酵母YG-4的菌落颜色为黄色边、深绿色顶，表面光滑圆润且不透明，中部突起，干燥、菌落较大。通过形态学鉴定，可知显微形态下产香酵母YG-4呈现梭形、且为单生菌。同时对产香酵母YG-4进行16SrRNA 检测，可知，其菌株的基因测序结果与汉逊酵母Hanseniaspora.sp具有高度的同源性，因此本发明得到的产香菌 YG-4的种属为汉逊酵母Hanseniaspora.sp。
优选地，所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。所述烟末包括烤烟烟叶等碎末。
优选地，所述步骤（4）中，菌液接种量为3%-15%。
优选地，所述步骤（4）中发酵培养过程中，温度为25-42℃，时间为18-120h。
优选地，所述水果为葡萄，例如巨峰葡萄，也可以是其他品种的葡萄或其他水果。
本发明还提供了一种用产香酵母YG-4制备烟用香料的方法，由所述的产香酵母YG-4对含有烟末的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行过滤浓缩，得到烟用香料。对该发酵液利用气相色谱进行香气成分分析。上述过滤浓缩为烟用香料制备中常规的方法，在此不再赘述。
优选地，所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。
实施例2
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在28 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养20 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养24h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量10%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，然后将其在28 ℃、170 rpm下恒温摇床培养72 h，培养过程中观察发酵液香味变化，选出能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。其中，种子培养基的组成为：烟末10g，水100mL。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例3
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养30 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养48h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量15%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末20g，水200mL；然后将其在42℃下恒温摇床培养120h，培养过程中观察发酵液香味变化，经嗅辩对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例4
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养25min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养30h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养12h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量13%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末15g，水80mL；然后将其在30℃下恒温摇床培养100 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例5
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在28 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养20min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养24h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养20h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量3%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末5g，水40mL；然后将其在25℃下恒温摇床培养18h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例6
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在28℃、170 rpm条件下恒温摇床培养20 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养40h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量5%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末18g，水162mL；然后将其在26℃下恒温摇床培养50h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例7
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在28 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养28 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养26h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养15 h，得到菌液；活化培养基和基础培养基的组成均与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量3%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末5g，水75mL；然后将其在35℃下恒温摇床培养110h，培养过程中观察并记录发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例8
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在28 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养23 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养24h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基和基础培养基的组成均与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量10%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末10g，水120mL；然后将其在25℃下恒温摇床培养120 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例9
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养30 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养30h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养12 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量3%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末20g，水100mL；然后将其在25 ℃下恒温摇床培养30 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例10
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养28 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养35h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养20 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量13%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末15g，水150mL；然后将其在42 ℃下恒温摇床培养40 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例11
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养30 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养24h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量15%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末20g，水100mL；然后将其在30 ℃下恒温摇床培养80 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
实施例12
一种产香酵母YG-4，其保藏编号为CGMCC NO.17223。
所述产香酵母YG-4的筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）富集：取5g巨峰葡萄表皮于250 mL洁净的锥形瓶中，加入100 mL无菌水，在30 ℃、170 rpm条件下恒温摇床培养20 min，使水果表皮微生物移至无菌水中，取出带有菌种液的锥形瓶，静置5 min，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，将稀释后不同浓度的菌液各取1 mL分别接入固体培养基，培养48h，按照酵母在培养基中的常规形态进行初步筛选，选出酵母菌类的若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；分离纯化的过程与实施例1相同。
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，并置于恒温摇床培养24 h，得到菌液；活化培养基组成与实施例1相同。
（4）发酵筛选：将菌液以菌液接种量8%分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，种子培养基的组成为：烟末18g，水180mL；然后将其在25 ℃下恒温摇床培养120 h，培养过程中观察发酵液香味变化，经对比筛选得到能够赋予发酵液明显花香韵与甜香韵，且区别于对照的产香酵母YG-4。
将所得到的产香酵母YG-4对上述组分的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行常规过滤浓缩，得到烟用香料。
以实施例2为例，利用GC-MS对产香酵母YG-4发酵液进行香气成分分析，并与空白对照组对比，具体如下：
首先将发酵好的发酵液样品及对照空白组进行同时蒸馏萃取，然后加入内标进行水浴浓缩，浓缩至1mL，通过0.22μm滤膜过滤至样品瓶中，利用气相色谱对其进行分析，并计算各香味成分的含量，计算方法为香味成分含量=（组分峰面积*内标物含量）/内标物峰面积，其得到的发酵液香气成分分析结果如下表1所示。
其GC-MS的分析条件为：气相条件：色谱柱：HP-5，进样口：260 ℃，进样量：1 μL，分流比：10:1，延迟5 min，升温程序：50 ℃保持2分钟，然后以6 ℃/分的速度，升到280 ℃保持10分钟。质谱条件：Aux：260 ℃，四级杆温度：150 ℃，离子源温度：230 ℃，质量扫描范围：30～550 amu。
表1：产香酵母YG-4发酵液与空白对照组的香味成分分析对比表
注：表中物质含量（μg/g）是指每克发酵液样品中所测的挥发性化学物质的质量。“-”表示挥发性成分含量极低或没有。
由表1可知，经过GC-MS分析得到，产香酵母YG-4的发酵液主要有32种对香气有贡献的物质，和空白对照组相比，酯类挥发性香气成分含量在YG-4发酵液中相对降低，但生成的苯甲酸苯乙酯含量较大，本身具有蜜样香气；醇类挥发性香气成分含量明显增加，增加了约7.03μg/g，生成的苯乙醇含量增加相当明显，且区别于空白对照组，该物质本身具有花香、平和的香气特征；羰基类、酸类、烃类物质降低，羰基类化合物中巨豆三烯酮降低最多，酸类中2-戊烯酸含量增加、1-烯丙基环丙烷羧酸含量减少；其他类物质中，1-苯基-3-氨基吡唑含量增加，且区别于空白对照，但是具体的香气特征未被现有技术披露。
因此可知，产香酵母YG-4的发酵液能产生花香韵和甜香韵等令人愉悦的香气，能够用于烟用香料，且与空白对照组相比，酯类、羰基类、酸类、烃类含量有所降低，醇类物质明显增加，尤其是苯乙醇的增加。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (10)
1.一种产香酵母YG-4，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO.17223。
2.如权利要求1所述的产香酵母YG-4，其特征在于：所述产香酵母YG-4用于烟草增香。
3.如权利要求1所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：通过对水果表皮菌种进行富集、分离，得到若干单菌落，对这些得到的单菌落分别进行活化培养，然后将其接入种子培养基中进行发酵，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照组的产香酵母菌株YG-4。
4.如权利要求3所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）富集：取水果表皮于锥形瓶中，加入无菌水，在恒温摇床中培养20 min~30 min，使水果表皮的微生物移至无菌水中，取出静置，得到富集液；
（2）分离：将富集液进行梯度稀释，得到不同浓度的菌液，取同等量的不同浓度菌液，分别涂布于固体培养基中，培养24-48h，观察其形态，选出酵母菌类若干单菌落，对若干单菌落进行分离纯化；
（3）活化培养：将分离纯化后的单菌落分别接入活化培养基中，分别进行活化培养，并置于恒温摇床培养12-24h，得到菌液；
（4）发酵筛选：将菌液分别接入预先配制好灭菌过的种子培养基中，然后将其在恒温摇床培养48-72 h，进行发酵培养，通过嗅辩对比来分析发酵液的香气，最终筛选出一种赋予发酵液花香韵和甜香韵，且区别于对照组的产香酵母菌株YG-4。
5.如权利要求4所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。
6.如权利要求5所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：所述步骤（4）中，菌液接种量为3%-15%。
7.如权利要求5所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：所述步骤（4）中发酵培养过程中，温度为25-42℃，时间为18-120h。
8.如权利要求3所述的产香酵母YG-4的筛选方法，其特征在于：所述水果为葡萄。
9.一种用产香酵母YG-4制备烟用香料的方法，其特征在于：由权利要求1所述的产香酵母YG-4对含有烟末的种子培养基进行发酵，得到发酵液，将发酵液进行过滤浓缩，得到烟用香料。
10.如权利要求9所述的用产香酵母YG-4制备烟用香料的方法，其特征在于：所述种子培养基的组成为：烟末5-20g，水40-200mL，烟末和水的质量比为1：（2-15）。
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