CN105950520A - 一种高效解磷的根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效解磷的根瘤菌及其应用，该解磷根瘤菌被命名为根瘤菌Rhizobium sp.P‑1，已经于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2016333。所述根瘤菌能将难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物。在生菜盆栽试验中，使用本发明筛选到的根瘤菌能明显的提高土壤中有效磷的含量，在降低磷肥施入量50%的情况下，保证生菜产量不减少，还提高了生菜的营养品质。所述根瘤菌可用于制备解磷菌剂，广泛用于农业生产中，提高土壤中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用效率，节肥增产，在保持农业生态平衡方面具有重要意义和应用价值。

Description

一种高效解磷的根瘤菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高效解磷的根瘤菌及其应用。

背景技术

磷是植物生长必需的三大营养元素之一，我国土壤全磷含量较高，耕地土壤全磷含量一般为0.02％-0.11％，但能被植物直接吸收利用的有效磷含量一般不超过全磷量的5％。大部分磷肥与土壤中的Ca²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Al³⁺等结合，形成难溶性磷酸盐，我国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％以上的磷为无效形式，土壤有效磷的缺乏是限制植物生长的主要因素之一。为了获得高产，人们每年都向土壤反复施加大量磷肥，由于作物对施入的磷肥当季利用率只有5％-10％，大部分磷肥以难溶的无效态在土壤中积累起来。长期大量施用磷肥不仅降低土壤对磷的吸附量，加大各种形态磷素向土体较深层次土壤迁移的能力，使土壤中各种形态磷在土体中出现明显积累的土层逐渐加深，从而增加了土壤的渗漏率，加大其对水体富营养化的风险，同时增加了成本。因此，提高磷的利用率一直是土壤学、生态学和微生物学工作者关注的热点。

解磷微生物是土壤中能将难溶性磷转化为植物能够吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，包括解磷细菌、解磷真菌和解磷放线菌。解磷微生物不仅能改善植物磷素营养，还能促进土壤中有益微生物的代谢活动，显著改善植物根部营养，达到增产效果。我国对解磷微生物的研究已有多年，目前磷细菌肥料主要采用液体发酵固体吸附生产工艺，产品有液体菌剂、粉状及固体颗粒，在水稻、玉米、花生、油菜以及其他一些蔬菜上施用后，与同样条件下未施用解磷微生物肥料的对照相比，产量均有所增加。利用解磷微生物活化土壤难溶性磷因具有高效、环保，且与土壤亲和等特点越来越受到人们的重视。

传统上认为根瘤菌发挥肥效主要是在结瘤状态，处于根瘤共生体中的菌体难以接触外界土壤，难以发挥其解磷作用。因此，解磷根瘤菌的应用并未获得广泛关注。上世纪中叶，一些学者发现某些根瘤菌除结瘤固氮外也具有分解难溶性磷酸盐或难溶性有机磷的能力。Chabot等指出不同解磷根瘤菌的解磷能力差异可达数倍。张希涛等在海南、广州等地分离出的200余株相思根瘤菌中，40余株具有解磷能力，其中能力最强的菌株2d内的解磷量达9.94mg/L。随着国内外研究的深入，解磷根瘤菌逐渐由研究验证阶段走向实际应用，有着广阔的应用前景。但也始终存在一些问题，如菌种的解磷机理并不完全明确，需要深入探讨，更重要的是具有实际应用价值的高效解磷根瘤菌为数不多。因此，高效解磷根瘤菌菌种的选育和增效诱变是进一步开发和应用的重点。本发明筛选得到的解磷菌P1，其解磷能力达400-800mg/L，并且在与豆科植物形成根瘤固氮的同时依然具有高效解磷的能力，有望成为开发高效微生物氮、磷肥的优良微生物资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高效解磷的根瘤菌，其能将土壤中难溶性的无机磷转化成植物可吸收的可溶性磷，该菌株已于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，分类命名：根瘤菌Rhizobium sp.P-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016333，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了根瘤菌Rhizobium sp.P-1的发酵方法，方法简单，适用于工业生产。

本发明的最后一个目的在于提供了根瘤菌Rhizobium sp.P-1的应用，该根瘤菌可用于积累土壤中的有效磷，或作为肥料添加剂，或用于提高蔬菜品质。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

根瘤菌Rhizobium sp.P-1的获得：

本发明人以磷酸三钙做控制磷源，在难溶性磷源环境下，用平板筛选法从湖北省武汉市各城郊具有10年以上种植龄的蔬菜基地根际土壤中初筛得到28株具有溶磷圈的细菌，再通过摇瓶培养法复筛，并通过继代培养确定了菌株解磷能力的稳定性，最终得到了一株高效解磷菌株，其解磷能力达400-800mg/L，将该菌株命名为P1。该菌株已于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，分类命名：根瘤菌Rhizobium sp.P-1，保藏号为CCTCC NO：M 2016333，地址：中国武汉武汉大学。本发明中将该菌株称为根瘤菌P1或解磷菌P1。

根瘤菌Rhizobium sp.P-1具有下述性质：

1)菌落形态学特征：

在LB培养基上28-32℃培养2-3d后，根瘤菌Rhizobium sp.P-1菌株菌落呈圆形、点状、边缘整齐、表面湿润光滑、不透明、白色、中心隆起。

2)生理生化特性：

P1菌株为好养性，革兰氏阴性菌；不能利用柠檬酸盐和丙酸盐，在低于2％NaCl培养基下能正常生长，高于5％NaCl培养基上不能生长；接触酶反应、V-P反应、氧化酶反应、葡萄糖发酵产酸、产H2S、硝酸盐还原、运动鞋试验为阳性反应；甲基红试验、明胶液化和淀粉水解试验为阳性；能利用葡萄糖、阿拉伯糖和木糖生长茂盛，不能利用甘露糖。

根瘤菌Rhizobium sp.P-1的发酵方法，包括：

根瘤菌Rhizobium sp.P-1发酵种子液按1-5％(w/w)的比例接入已灭菌好的发酵培养基中，28-32℃，转速180-240r/m，通气量为1:0.5-1.5V/V/min，发酵30-72h后放罐。

所述的发酵培养基包括：碳源10-30g/L，氮源1-20g/L，无机盐0.01-20g/L，溶剂为水，pH6.0-9.0，121℃下灭菌20-40分钟，冷却置30-40℃备用。

所述的碳源为葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、乳酸、糖蜜和淀粉中任意一种或几种组合；所诉氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米粉、黄豆粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的任意一种或几种组合；所述的无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种的组合。

根瘤菌Rhizobium sp.P-1的应用，该根瘤菌可单独使用，或与其他有效物质，例如肥料、菌剂混合使用，用于：土壤解磷，改善植物磷素营养，提高作物产量，降低土壤磷素污染风险或增加豆科植物的固氮效率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明从具有10年以上种植龄的蔬菜基地根际土壤中筛选出具有高效降解难溶性无机磷的根瘤菌根瘤菌Rhizobium sp.P-1，并以根瘤菌Rhizobium sp.P-1为菌种发酵培养制备得到一种高效解磷菌剂，，其解磷能力达400-800mg/L，将该菌剂应用于蔬菜种植土壤解磷中，能更好的适应蔬菜种植土壤环境，提高该菌剂与蔬菜种植土壤本土微生物的亲和力，从而增强了解磷菌剂的解磷能力。

2.该菌剂能够将土壤中难溶性无机磷转化为可供植物直接吸收利用的优质磷素化合物，达到节肥增产的效果，并且减少土壤中全磷含量的积累，降低磷素被固定于土壤中的磷面源污染风险，对充分土壤生态肥力、保持农业生态环境的平衡等均具有极其重要意义和应用价值。

3.本发明提供的一种高效解磷根瘤菌及其菌剂，不仅能增加土壤中的有效磷含量，而且还具有固氮功能，能在豆科植物上形成能共生固氮的根瘤，为开发有固氮和解磷作用的多功能根瘤菌肥料提供优良菌株。

4.本发明提供的一种高效解磷根瘤菌将其制备出解磷菌剂，其生产工艺简单，能工业化大生产，并且该解磷菌剂能降解土壤中的难溶性无机磷，改善作物根际环境，提高作物根系周围锌、铜、钙、镁等营养元素的吸收，提高作物产量和品质，具有良好的经济效益、社会效益和环境效益。

附图说明

图1为温度对根瘤菌P1的生长影响示意图。

图2为pH对根瘤菌P1的生长影响示意图。

图3为NaCl浓度对根瘤菌P1的生长影响示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，对于实例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不限于本发明实例的具体记载。

本发明所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

解磷菌P1的获得：

本实施例所涉及的培养基配方如下：

平板筛选培养基为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.3g，七水硫酸亚铁0.03g，一水硫酸锰0.03g，琼脂粉18g，蒸馏水1L，pH7.0-7.2，121℃下灭菌20分钟，备用。

摇瓶复筛培养基为：葡萄糖10g，磷酸三钙5g，氯化镁5g，七水硫酸镁0.25g，氯化钾0.2g，硫酸铵0.1g，蒸馏水1L，pH7.0-7.2，121℃下灭菌20分钟，冷却置30-40℃备用。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH7.0-7.2，121℃下灭菌20分钟，冷却置30-40℃备用。

解磷菌初筛：称取10g根际土壤样品加入90ml无菌水中，25℃摇床振荡30min。取上清液逐级稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分别取各浓度样品0.2mL涂布于平板筛选培养基上，经28℃培养5天后，供有79株菌能够在平板筛选培养基上生长，其中有28个能产生明显的溶磷圈，将产生溶磷圈的菌株编号为P1-P28。其中P1、P2、P8、P13、P14、P17和P27共7株细菌的透明圈直径都超过了13mm，并且透明圈直径D与菌落直径d比都超过了2.0，其中P1菌株的溶磷圈最大，D/d比值为3.42，挑起这7株单菌落并转至斜面培养直至菌苔长起，置于4℃保存。

解磷菌的复筛：

活化上述初筛得到的7株菌，经斜面镜检后刮入LB培养基中，在28℃，180r·min^-1条件下，培养24h。取相同浓度的各菌株样品按2％比例接种到摇瓶复筛培养基中，同时以不加任何菌的摇瓶复筛培养基作为对照组，28℃，180r·min^-1进行培养7天，测定培养液中水溶性磷含量，具体结果见表1

表1不同菌株的解磷效果

从表1的结果可以看出，本发明筛选到的上述7株菌均具有一定的解磷效果，能将培养基中的难溶磷(磷酸三钙)分解成可溶性的有效磷，其中P1菌株的解磷能力最高，可溶性磷含量高达524.48mg/L。因此，该菌株可做成解磷菌剂，广泛应用于农业生产中。

实施例2：

解磷菌P1的鉴定

1)解磷菌P1的菌落形态特征：

在LB培养基上28-32℃培养2-3d后，P1菌株菌落呈圆形、点状、边缘整齐、表面湿润光滑、不透明、白色、中心隆起。

2)解磷菌P1的生理生化特性：

解磷菌P1为好养性，革兰氏阴性菌；不能利用柠檬酸盐和丙酸盐，在低于2％NaCl培养基下能正常生长，高于5％NaCl培养基上不能生长；接触酶反应、V-P反应、氧化酶反应、葡萄糖发酵产酸、产H2S、硝酸盐还原、运动性试验为阳性反应；甲基红试验、明胶液化和淀粉水解试验为阴性；能利用葡萄糖、阿拉伯糖和木糖生长茂盛，不能利用甘露糖。

3)解磷菌P1的分子生物学鉴定：

将解磷菌P1的16S rDNA序列与GenBank数据库中其它的16S rDNA序列进行同源性比较，采用MEGA6.0软件构建系统发育树。结果表明：解磷菌P1和Sinorhizobium meliloti(X67222.2)位于同一分支，同源性达到99％。所以认定本发明得到的菌株为根瘤菌(Rhizobium)，命名为根瘤菌Rhizobium sp.P-1。

该菌株已于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，分类命名：根瘤菌Rhizobium sp.P-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016333，地址：中国武汉武汉大学。

实施例3：

根瘤菌Rhizobium sp.P-1的发酵方法，包括：

1)种子培养基的制备

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1L，pH 7.2-7.5，121℃下灭菌20-40分钟，冷却置30-40℃备用；

2)发酵培养基的制备

发酵培养基组分为：葡萄糖1.5％，黄豆粉1％，玉米粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.03％，硫酸锰0.002％，硫酸亚铁0.002％，以上均为质量比，pH8.0，121℃下灭菌20分钟，冷却置30-40℃备用；

3)种子扩大培养

从斜面上取1-2环根瘤菌P1的菌苔，接种到50ml已灭菌的种子培养基中，置30℃，转速200r/min的摇床上培养22h，做为发酵种子液，备用；

4)根瘤菌P1的制备

将步骤3)制备的发酵种子液按2％(w/w)的比例接入已灭菌好的发酵培养基中，30℃，转速200r/min，通气量为1:0.8V/V/min，发酵32h后放罐，此时发酵液中的菌体数量可达2.32*10¹⁰cfu/mL。

得到发酵液用于土壤的解磷，或者将发酵液进行干燥处理得到干燥物用于土壤的解磷。

实施例4：

根瘤菌P1在促进土壤库中的有效磷素积累中的应用：

试验过程：以盆栽生菜为试验对象，试验设6个处理，分别为CK(不施磷对照+灭活菌剂)、T1(不施磷处理+解磷菌剂)、T2(施1/4磷+解磷菌剂)、T3(施1/2磷+解磷菌剂)、T4(施常规用量磷+解磷菌剂)和T5(施常规用量磷+灭活菌剂)6个处理，各处理在等氮、钾养分条件下施肥，每盆装土15kg，所用化肥为尿素(含N 46％)、过磷酸钙(含P₂O₅ 16％)、硫酸钾(含K₂O 51％)，各处理具体施肥量见表2。所有肥料在生菜移栽前一次性拌土施入，每处理10盆，每盆种生菜2棵，重复间随机排列，管理一致。解磷菌剂即为实施例3制备的根瘤菌P1发酵液，该发酵液菌体数量为2.32*10¹⁰cfu/mL，接种量为50mL/棵，其中灭活菌剂即为实施例3制备的根瘤菌P1发酵液121℃灭菌后所得，解磷菌剂于生菜移栽后浇灌于根部周围。

土壤库中有效磷素积累量是指作物整个生育期中磷吸收量和采收后土壤中速效磷含量的总和，在生菜收获的同时，分别采集每个处理的土样，采用鲍士旦(2000)的方法测定植株全磷含量和土壤速效磷含量，结果见表3。

表2各处理施肥量

表3根瘤菌P1对土壤库中有效磷素积累量的影响

由表3可以看出，CK与T1两个不施磷处理中，T1处理的土壤库中有效磷素积累量明显高于CK处理，而T4与T5两个施全量磷处理中，土壤库中有效磷素积累量无显著差异，说明根瘤菌P1在土壤缺磷的情况下能促进土壤有效磷的释放，在土壤磷素丰富的情况下无促进作用。T3与T4处理的土壤库中有效磷素积累量无显著差异，但T3处理的磷肥施入量仅为T4处理的一半，这说明根瘤菌P1在发挥作用，促进了土壤库中的有效磷素积累。

实施例5：

根瘤菌P1在提高蔬菜的营养品质中的应用：

实验分组及过程同实施例4。

在生菜采收时测定其营养品质。维生素C采用2,6-二氯靛酚滴定法测定；可溶性糖采用蒽酮比色法测定；硝酸盐采用紫外法测定，结果见表4。

表4根瘤菌P1对生菜营养品质的影响

由表4可以看出，各处理之间，随着磷肥施入量的增加，可溶性糖含量也随之增加，当施磷量相同时，T4处理显著高于T5处理，这说明根瘤菌P1能提高生菜的可溶性糖含量。

维生素C含量也是随着磷肥施入量的增加而增多，但在施一半磷时达到最高值，随后增施磷反而减低了维生素C含量；施磷量相同时，T1处理的维生素C含量显著高于CK处理，T4处理的维生素C也显著高于T5处理，这说明根瘤菌P1的施用也能提高生菜的维生素C含量。各处理的生菜叶片硝态氮含量均低于我国蔬菜硝酸盐标准允许量(432mg/kg)，磷肥的增施能增加生菜叶片硝酸盐含量的积累，但是在磷肥相同施用量下，T1处理的硝酸盐含量显著低于CK，T4处理的硝酸盐含量也显著低于T5，这说明，增施根瘤菌P1能降低生菜的硝酸盐含量。总之，根瘤菌P1能明显的增加了生菜的营养品质。

实施例6：

根瘤菌P1在制备成肥料添加剂中的应用：

实验分组及过程同实施例4。

表5根瘤菌P1对生菜产量的影响

从表5可知，在施用解磷菌剂情况下，随着磷肥用量的增加，生菜的产量也跟着增加，当磷肥施用量达常规用量一半时，生菜单株产量趋于稳定，与常规施磷肥处理无明显差别，与CK相比增产53.56％，与T4和T5处理相比，相当于磷肥减施一半能达到产量相同值，这说明施用解磷菌剂能有效的减少磷肥的施入量，可作为肥料添加剂。

实施例7：

根瘤菌P1在大豆中的应用效果：

以盆栽大豆为试验对象，试验设2个处理，分别为CK(不施氮磷对照+灭活菌剂)、T1(不施氮磷处理+解磷菌剂)，各处理在等钾养分条件下施肥，每盆装土15kg，硫酸钾(含K₂O 51％)用量为0.12g/kg，钾肥在大豆播种前一次性拌土施入，每处理10盆，将大豆消毒催芽后，选取芽长、粗细一致的发芽大豆播种，每盆均匀撒入10粒种子，重复间随机排列，管理一致。解磷菌剂即为实施例3制备的根瘤菌P1发酵液，该发酵液菌体数量为2.32*10¹⁰cfu/mL，其中灭活菌剂即实施例3制备的根瘤菌P1发酵液121℃灭菌后所得，解磷菌剂于大豆播种后均匀施入100mL/盆，待子叶展开后再一次施入100mL/盆。日常管理各处理相同。在大豆收获的同时，分别采集每个处理的土样，采用鲍士旦(2000)的方法测定植株全磷含量、植株全氮含量、土壤速效磷含量和土壤碱解氮含量，结果见表6。

表6根瘤菌P1对土壤、植株氮、磷含量的影响

从表6可以看出，T1处理的作物吸磷量和作物吸氮量都显著高于CK处理，T1处理的采收后突然速效磷含量和采收后土壤碱解氮含量也都显著高于CK处理，这说明在施用了解磷菌剂后，一方面提高了大豆的固氮能力，为大豆的生长提供了可利用的氮源；另一方面也促进了土壤库中的有效磷积累，将土壤将难溶性磷转化成了大豆植株可吸收利用的有效磷源。

实施例8：

根瘤菌P1的生长特性试验：

种子液的制备参照实例3.

本发明一共设计了3个试验：

生长温度试验：将实例3中步骤3)制备的根瘤菌P1发酵种子液按2％(w/w)的比例接种到温度分别为4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃的LB培养基中，200r/min摇床培养2d，以未接菌液的LB培养液位空白对照，比较吸光度值，结果见图1；

耐酸碱度试验：将实例3中步骤3)制备的根瘤菌P1发酵种子液按2％(w/w)的比例接种到pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的LB培养基中，200r/min摇床培养2d，以未接菌液的LB培养液位空白对照，比较吸光度值，结果见图2；

耐盐性试验：将实例3中步骤3)制备的根瘤菌P1发酵种子液按2％(w/w)的比例接种到NaCl浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、5％、7％的LB培养基中，200r/min摇床培养2d，以未接菌液的LB培养液位空白对照，比较吸光度值，结果见图3。

从图1可以看出，根瘤菌P1在20-50℃均能生长，最高生长温度为30℃左右；从图2可以看出，根瘤菌P1在pH值6-9的环境中都能生长，最佳生长pH为8.0左右，说明该菌株喜欢在碱性环境下生长；从图3可以看出，在盐浓度低于2％条件下都能正常生长。从这3个试验可以看出根瘤菌P1其耐热能力、耐酸碱能力和耐盐能力都比较强，说明该菌株能在自然环境下很好的生存和繁殖。

Claims (9)

1.一种高效解磷的根瘤菌，其特征在于：所述的根瘤菌为根瘤菌Rhizobium sp.P-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2016333。

2.权利要求1所述根瘤菌的发酵方法，包括：权利要求1所述根瘤菌的发酵种子液按1-5%w/w的比例接入已灭菌好的发酵培养基中，28-32℃，转速180-240r/m，通气量为1:0.5-1.5V/V/min，发酵30-72h后放罐；

所述的发酵培养基包括：碳源10-30g/L，氮源1-20g/L，无机盐0.01-20g/L，溶剂为水，pH6.0-9.0，121℃下灭菌20-40分钟，冷却置30-40℃备用；

所述的碳源为葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、乳酸、糖蜜和淀粉中任意一种或几种组合；所诉氮源为蛋白胨、酵母粉、玉米粉、黄豆粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的任意一种或几种组合；所述的无机盐为磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰和氯化钙中的一种或几种的组合。

3.权利要求1所述的根瘤菌在制备成肥料添加剂中的应用。

4.权利要求1所述的根瘤菌在制备成解磷菌剂中的应用。

5.权利要求1所述的根瘤菌在提高作物产量中的应用。

6.权利要求1所述的根瘤菌在提高豆科植物固氮效率中的应用。

7.权利要求1所述的根瘤菌在提高作物维生素C含量中的应用。

8.权利要求1所述的根瘤菌在降低作物硝酸盐含量中的应用。

9.权利要求1所述的根瘤菌在同时提高豆科植物固氮效率和磷吸收中的应用。