CN108034604A

CN108034604A - 根瘤菌jsp2-5及其在改善烟地轮作土壤上的应用

Info

Publication number: CN108034604A
Application number: CN201711433694.8A
Authority: CN
Inventors: 徐开未; 陈远学; 刘明; 龙玲; 陈强; 邹文豪; 余秀梅; 刘汉军
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: CN108034604B

Abstract

本发明公开了根瘤菌JSP2‑5及其在改善烟地轮作土壤上的应用，根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2‑5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017618。本发明得到了一株适应四川地区紫花苕子种植的根瘤菌JSP2‑5，根瘤菌JSP2‑5能显著的提高紫花苕子的产量及氮磷钾含量，通过翻压紫花苕子试验表明，植烟土壤轮作接种根瘤菌的紫花苕子，能有效地增加土壤有机质、速效磷、碱解氮、速效钾含量，并且可以增加土壤中三大类群微生物的数量，改善土壤微生物群落结构，达到培肥土壤的效果。

Description

根瘤菌JSP2-5及其在改善烟地轮作土壤上的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及根瘤菌JSP2-5及其在改善烟地轮作土壤上的应用。

背景技术

烟草作为一种特殊的经济作物，要实现烟草的优质适产，就必须为烟草生长创造一个良好土壤环境。随着中国烤烟生产的迅速发展，长期大量施用化肥、不合理的轮作等导致烟叶产量和质量下降、土壤板结、地力衰退以及有机质含量降低等问题，成为烟叶生产可持续发展的瓶颈。在这种背景下，探寻一种能提高烟叶产量和质量、改良土壤、实现烟叶生产可持续发展的栽培措施，成为烤烟种植亟需解决的问题之一。

面临以上问题，研究者尝试通过改良土壤来改善烟株大田生长状况和提升烤烟产量和品质，尤其对不同有机肥的研究成为了土壤—烤烟系统的研究热点(彭华伟等，2008)，施用有机肥不仅能提高土壤养分水平，促进烤烟生长发育，改善烟叶品质，而且能够达到土地用养结合的效果。绿肥作为一种重要的有机肥料，其在减少化肥用量、提高作物产量、培肥土壤地力等方面起到了积极的作用，且种植绿肥已成为目前土壤改良的重要手段(王瑞宝等，2010)。绿肥品种繁多，譬如黑麦草、满园花、箭筈豌豆、紫花苕子等，其中豆科绿肥箭筈豌豆和紫花苕子是最常见的旱地绿肥作物。豆科绿肥通过根瘤菌的固氮作用，能固定空气中的氮素，把不能直接利用的氮气固定转化为可被作物利用的氮，增加土壤氮素营养。通过发达的根系吸收深层土壤中的养分，尤其对土壤难溶性磷酸盐有较强的吸收能力，从而能提高土壤中的磷含量(王秀芝等，2005)。利用烟田冬闲时间种植绿肥，翻压后可以增加土壤有机质含量(石屹等，2009)，增加土壤中氮、磷、钾含量(王岩等，2006；潘福霞等，2011)。大量的试验研究表明，翻压绿肥后产生的腐熟物质有利于植烟土壤微生物活性的增强(程森等，2008)。绿肥翻压后对土壤微生物量的影响也存在差异，进而对烤烟生长发育和烤后烟叶品质影响也不相同(田峰等，2015)。

为响应《到2020年化肥使用量零增长行动方案》，在烟草生产中，可充分利用冬闲地以及光热资源，不用化肥，仅用高效根瘤菌接种生产优质豆科绿肥，翻压后改土培肥植烟土壤，进而为后期的烤烟生产达到化肥使用量零增长或减施化肥，并能提质增效作好科学的准备。早先有针对烟区轮作紫花苕子的发明专利(申请号为201210459188.7)，但是在绿肥生长过程中不是接种根瘤菌，而是用过磷酸钙、尿素，以促进绿肥生长，增大了生产成本，增加了环境压力。施用根瘤菌菌剂能促进豆科植物结瘤，有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力。豆科绿肥生产环节中仅接种根瘤菌，可以不施用任何肥料。但是，豆科绿肥接种根瘤菌的报道少，要提高根瘤菌的共生固氮作用，菌株和豆科植物品种是两个根本因素。根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在根瘤菌的筛选中，需要注意对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(Jia et al，2008；陈文新等，2011)。因此在根瘤菌选种时，不仅要考虑根瘤菌与豆科植物品种的匹配性，还必须重视菌剂应用的地域性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适应四川地区紫花苕子种植的根瘤菌。

本发明的技术方案为：根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017618。

根瘤菌JSP2-5在四川地区紫花苕子种植上的应用。

菌肥，由培养至对数生长期的根瘤菌JSP2-5菌液和灭菌的载体构成。

进一步地，菌肥由根瘤菌JSP2-5菌液和泥炭载体构成。

紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5在改善四川地区烟地轮作土壤上的应用。

进一步地，紫花苕子接种的根瘤菌JSP2-5采用前述的菌肥。

本发明在野生紫花苕子上分离得到根瘤菌JSP2-5，经16S rRNA基因及其他持家基因glnII、atpD、recA的扩增及系统发育分析鉴定，根瘤菌JSP2-5属Rhizobium anhuiense。

通过接种紫花苕子发现，根瘤菌JSP2-5能使紫花苕子鲜草产量增加19.1％，根产量增加37.5％，根瘤数增加51.2％，株高增加13.3％。说明接种根瘤菌，能提高紫花苕子根部结瘤率，直接或间接影响紫花苕子生物量的增长。而且全氮、全磷、全钾积累量分别增加18.2％、34.3％、36.4％。说明接种根瘤菌后，能明显增加紫花苕子氮磷钾积累量。

紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5在改善四川地区烟地轮作土壤的作用明显，相比空地，紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5的全氮含量均上升了17.5％，只种植紫花苕子、紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5的植株翻压后，在烤烟种植前土壤有机质含量相比空地对照分别上涨43.4％、104.8％，只种植紫花苕子处理的速效磷、速效钾、碱解氮含量比空地对照分别增加为21.4％、35.3％、7.8％，紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5的速效磷、速效钾、碱解氮含量分别比空地对照增加48.5％、63.4％、16.9％。可见翻压紫花苕子能使土壤养分含量提升，但是翻压接种根瘤菌的紫花苕子的优势更明显。紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5的三大类群微生物的数量比只种植紫花苕子及空地对照的高。相较于空地对照，紫花苕子接种根瘤菌JSP2-5的细菌、放线菌、真菌的数量分别增长了111.0％、85.2％、83.5％。可以看出，翻压接种根瘤菌的紫花苕子能成倍增加三大类群微生物的数量。

现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明得到了一株适应四川地区紫花苕子种植的根瘤菌JSP2-5，根瘤菌JSP2-5能显著的提高紫花苕子的产量及氮磷钾含量，通过翻压紫花苕子试验表明，植烟土壤轮作接种根瘤菌的紫花苕子，能有效地增加土壤有机质、速效磷、碱解氮、速效钾含量，并且可以增加土壤中三大类群微生物的数量，改善土壤微生物群落结构，达到培肥土壤的效果。

保藏说明：

根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017618。

附图说明

图1为根瘤菌JSP2-5在YMA培养基上的菌落形态；

图2为根瘤菌JSP2-5的16rRNA基因序列的系统发育图；

图3为根瘤菌JSP2-5的recA、atpD、glnII三个持家基因联合构建的系统发育图。

具体实施方式

实施例1 根瘤菌JSP2-5的分离、纯化和保存

在四川省泸州古蔺箭竹乡采集野生的健壮红色紫花苕子根瘤，清洗干净，带部分根皮取下，用吸水纸吸干外表水分，装在放有无水氯化钙的并覆有脱脂棉的小管中。在实验室进行以下操作：将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀，用95％的乙醇浸泡30s以消除表面张力，接着用0.1％(质量体积比)的升汞表面消毒5min，再用无菌水冲洗6～8次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YMA培养基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，1％(质量体积比)钼酸钠2mL，1％(质量体积比)硼酸2mL，1％(质量体积比)刚果红2.5mL，pH6.8～7.0，琼脂18～20g，水1000mL)上划线，在28℃的恒温箱中培养。

待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到10d左右，因慢生根瘤菌需6～10d出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌：(1)加刚果红的YMA培养基上的菌落形态：不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3～5d就长出菌落的为快生根瘤菌，培养6～10d长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G^-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例的分离纯化得到的菌株JSP2-5为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度较高、稍透明，2～3d长出菌落。经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

实施例2 紫花苕子根瘤菌JSP2-5的16S rRNA基因及其他持家基因glnII、atpD、recA的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，用表1所示引物分别对上述4个基因进行PCR扩增，PCR反应用Bio-RAD MyCycler^TM仪器，PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到成都擎科梓熙生物技术有限公司进行序列的测定。本研究的基因扩增引物列于表1。用软件DNAman 6.0进行基因序列相似度的计算。

表1 本试验中所用PCR引物

注：Y＝C or T,H＝A,C or T,R＝A or G,S＝C or G,K＝G or T,N＝A,C,G or T,I＝inosine,M＝Aor C,N＝any base.

(1)16S rRNA基因的扩增及系统发育树的构建

以总DNA为模板，用表2通用引物P1和P6扩增16S rRNA。PCR反应体系(50μL)：2×PCR Mix 25μL，引物P1和P6(20μM)各1μL，DNA模板1μL，加超纯水补足至50μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后成都擎科梓熙生物技术有限公司测序的结果如SEQIDNo.1。

将所得的序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对，发现与根瘤菌JSP2-5的16SrDNA序列相似度最高的模式菌株是Rhizobium anhuiense CCBAU23252^T，相似度为98.77％。应用序列在EzTaxon上比对的结果，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，构建系统发育树。用Mega5软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16S rRNA基因系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，其系统发育树见图2。

(2)多位点基因序列的联合系统发育树的构建

为进一步更准确地确定所述豌豆根瘤菌JSP2-5的分类地位，另选择3个位点的持家基因atpD、recA和glnII序列进行联合系统发育树的构建。

扩增recA用引物recAF2、recAR2，atpD用引物atpDF1和atpDR，glnII用引物glnII-5和glnII-6，引物序列如表1所示。反应体系为50μl，反应液组成如下：反应体系(50μL)为：2×PCR Mix 25μL；10mM的正向引物和反向引物各0.5μL；DNA模板1μL；ddH₂O 23μL。(1)recA和atpD的PCR扩增反应程序相同：95℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火1min，74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸6min。(2)glnII扩增条件：92℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，对每个基因进行两向测序(正、反引物的序列)，然后将正、反引物序列用DNAman 6.0软件拼接，去掉正、反引物的序列后分别获得atpD、glnII、recA序列大小为496nt、637nt、493nt，序列结果分别如SEQID No.2、SEQIDNo.3、SEQID No.4。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现与紫花苕子根瘤菌JSP2-5的atpD和recA、glnII3个位点持家基因的序列相似度最高的模式菌株均是Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T，与该模式菌株的相似度分别为100％、100％、99.15％，应用每个基因序列在NCBI上比对结果，选择与3个基因相似度高的模式菌株作为建树的参比菌株。

3个基因(atpD、glnII和recA)联合系统发育树的构建：先将atpD、glnII、recA 3个持家基因的序列分别与参比菌株的相应基因序列，用MEGA5比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的序列保存为FASTA格式，剪齐后3个基因序列长度分别为350nt、468nt、342nt。以记事本格式打开将3个序列拼接在一起，用MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行联合系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，atpD、glnII、recA联合系统发育树如图3所示。

图2和图3显示，JSP2-5的16S rRNA基因，以及atpD、glnII、recA 3个持家基因联合序列与Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T在同一分支节点上。又如前分析，所述菌株与该模式菌株Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T的这4个基因的相似度很高，其中2个基因序列的相似度还达100％，表明菌株JSP2-5属Rhizobium anhuiense。

实施例3 根瘤菌菌剂的制作

菌株JSP2-5分离自泸州古蔺箭竹乡野生紫花苕子根瘤，因其有较强的固氮能力，将其应用于紫花苕子的生长。经鉴定，该菌株为Rhizobium anhuiense，于2017年10月23日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017618。

将该根瘤菌株接种到液体YMA培养基中(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，钼酸铵(1％)2mL，硼酸(1％)2mL，水1000mL)，在28℃摇床中摇培养2d即得。选用过100目筛的泥炭作为菌株载体，配方：泥炭488.5g，蔗糖1g，过磷酸钙(过100目筛)0.5g，钼酸钠0.005g，硼酸0.005g。用石灰将pH调至中性。将培养到对数生长期的菌悬液与灭菌的载体充分混匀即制成菌肥。经检测，根瘤菌JSP2-5菌剂中根瘤菌JSP2-5含量为2.9×10⁸CFU/g。

实施例4 绿肥试验

大田试验在攀枝花市仁和区平地镇烤烟基地进行。试验设计3个处理，V(不接种根瘤菌的紫花苕子处理)，V+R(接种根瘤菌的紫花苕子处理，R为实施例1中制备的根瘤菌JSP2-5菌剂)，CK(冬闲空地，不种绿肥)。选用饱满的光叶紫花苕子种子，将紫花苕子与菌剂拌种，紫花苕子的播种量为9.2kg/亩，菌剂用量为1kg/亩。播种时间为2015年10月7日。播种前利用旋耕机翻耕试验地，然后再利用旋耕机将土壤表面的种子翻入土。在紫花苕子生长过程中不用施用任何化肥。适当挖排水沟，确保能排能灌。于2016年2月28日，采用旋耕机将紫花苕子全量翻入10～20cm深的土壤中，以没有紫花苕子裸露在土壤表面为准。

表2 接种根瘤菌对紫花苕子生物量的影响

测定紫花苕子盛花期(翻压期)的生物量，V+R比V的鲜草产量增加19.1％，根产量增加37.5％，根瘤数增加51.2％，株高增加13.3％。说明接种根瘤菌，能提高紫花苕子根部结瘤率，直接或间接影响紫花苕子生物量的增长。

表3 接种根瘤菌对紫花苕子植株养分积累量的影响(kg/hm²)

盛花期的紫花苕子养分含量如表3，V+R相比V的全氮、全磷、全钾积累量，分别增18.2％、34.3％、36.4％。说明接种根瘤菌后，能明显增加紫花苕子氮磷钾积累量。

表4 翻压接种根瘤菌的紫花苕子对植烟土壤养分含量的影响

加烤烟种植前(2016年5月7日)采集0～20cm土壤，测定土壤基础理化指标。由表4可知，V和V+R处理相比较于CK土壤养分含量有不同程度的变化。相比CK，V、V+R的全氮含量分别上升了5.2％、17.5％，V、V+R的有机质含量分别上涨43.4％、104.8％，V处理的速效磷、速效钾、碱解氮含量分别增加为21.4％、35.3％、7.8％，V+R处理的速效磷、速效钾、碱解氮含量分别增加48.5％、63.4％、16.9％。可见翻压紫花苕子能使土壤养分含量提升，但是翻压接种根瘤菌的紫花苕子的优势更明显。

表5 翻压接种根瘤菌的紫花苕子对植烟土壤可培养微生物数量的影响(CFU/g)

烤烟种植前(2016年5月7日)采集0～20cm土壤，测定土壤微生物数量。对植烟土壤中可培养微生物细菌、放线菌、真菌的测定结果见表5。V+R处理的三大类群微生物的数量比V及CK处理的高。相较于CK，V+R处理的细菌、放线菌、真菌的数量分别增长了111.0％、85.2％、83.5％。可以看出，翻压接种根瘤菌的紫花苕子能成倍增加了三大类群微生物的数量。

全氮测定方法H₂SO₄-H₂O₂消煮-蒸馏法，全磷测定方法H₂SO₄-H₂O₂消煮-钒钼黄比色法，全钾测定H₂SO₄-H₂O₂消煮-火焰光度计法。土壤微生物数量采用平板计数法，参照《土壤微生物研究原理与方法》。有机质采用重铬酸钾容量法，全氮采用凯氏法，碱解氮采用碱解扩散法，有效磷采用碳酸氢钠浸提－钼锑抗显色分光光度法，速效钾采用醋酸铵提取火焰光度法。

在烟地轮作紫花苕子，解决了烟区冬地闲置，充分利用光热资源。紫花苕子应用根瘤菌肥，不施用任何其他肥料，对环境友好。植烟土壤轮作接种根瘤菌的紫花苕子，能有效地增加土壤有机质、速效磷、碱解氮、速效钾含量，并且可以增加土壤中三大菌类数量，改善土壤微生物群落结构，达到培肥土壤的效果。本发明为攀枝花乃至四川提供了一种烟地轮作“紫花苕子+根瘤菌”培肥土壤的方法，为四川烤烟的生产作出了贡献。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017618。

2.根据权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5在四川地区紫花苕子种植上的应用。

3.菌肥，由权利要求1所述的根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5的菌液和载体构成。

4.根据权利要求3所述的菌肥，其特征在于，菌肥由根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5菌液和泥炭载体构成。

5.紫花苕子接种根瘤菌(Rhizobium anhuiense)JSP2-5在改善四川地区烟地轮作土壤上的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，紫花苕子接种的根瘤菌(Rhizobiumanhuiense)JSP2-5采用权利要求3或4所述的菌肥。