CN103952344B - 一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。该菌株是从新鲜的大豆根瘤中分离纯化得到，已于2014年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2014083，分类命名为高效固氮大豆根瘤菌（Bradyrhizobium diazoefficiens）。该菌株应用于四川大豆的生产。本发明的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是一株共生固氮能力强，对四川大豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性较强的优良广谱大豆根瘤菌菌株。并且与四川的主栽豆品种匹配亲和性好，在不同生态区不施氮肥、接种SCAUs46使大豆增产22%以上，与不接种对照的差异达显著水平。

Description

一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。

背景技术

化学氮肥为提高农作物产量作出了巨大贡献，但生产成本高、利用率低、污染生态环境。生物固氮则成本低、固氮量大、固氮过程持续、无污染，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展，是农业生产节本增效的有效手段。在粮食生产中需要下大力气开发对环境有益的生物固氮技术。根瘤菌-豆科植物固氮体系是生物固氮中效率最高的。豆科植物人工接种根瘤菌是提高作物产量与品质，改善生态环境的一项重要农业措施。接种根瘤菌是国际上公认的生物固氮技术。大豆与大豆根瘤菌的共生体系是生物固氮中的典型代表。大豆与大豆根瘤菌之间的共生作用，是在长期进化中相互作用、互相选择的结果，也是与环境相适应的结果。世界其他种植大豆的国家在应用大豆根瘤菌的技术上有很大的优势。然而，我国是大豆的起源地，种植大豆的历史悠久，根瘤菌与大豆协同进化，使土壤中固氮效率低的土著根瘤菌与大豆品种具有较强的匹配亲和性，从而大大降低了高效固氮根瘤菌接种剂的作用效果。因此研究和掌握根瘤菌和大豆品种匹配性具有重要的实践价值。

要提高共生固氮作用，可见菌株和大豆品种应是两个根本因素。而根瘤菌的群体分布具有地理局限性，在根瘤菌的筛选中，需要注意其对应用地区环境的适应能力。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株。因此在根瘤菌选种时，不仅要开展根瘤菌与大豆品种的匹配性组合研究，还必须重视菌剂应用的地域性。

大豆是中国第四大农作物，深受中国人民的喜爱，食用方式多种多样，用途广泛，是我国重要的粮食作物和油料作物。因此在我国开展优良大豆根瘤菌株筛选和应用技术研究工作非常有意义。东北大豆产区为我国最大大豆产区，黄淮海地区是我国大豆第二大产区，与这最大的两大产区的主栽大豆品种和生态环境匹配的优良菌株的研究相对较多。针对干旱的西北大豆产区，优良大豆根瘤菌的筛选也有报道。针对我国大豆的第一产区：东北产区，杜迎辉等人从黑龙江分离获得一株与东北大豆品种匹配性好且适合东北地区的优良菌株，于2012年6月获准发明专利。针对我国华南酸性土壤，曹桂芹等人为华南缺磷酸性红壤选育了耐酸、耐铝的3个根瘤菌株系，于2007年12月申请了3个发明专利。但针对南方大豆产区的四川大豆产区的大豆品种和生态环境相匹配的优良根瘤菌研究鲜见报道。

四川大豆以前一直属小宗作物，种植零散，产量较低，种植面积较小。近年来，四川大豆生产发展迅猛，出现规模化、大面积连片种植，产量水平大幅度提高，已经成为四川省主要粮食作物之一，播种面积在全国排名第6位。农业部在《种植业发展第十二五规划》（2011—2015）中将四川及西南间套食用大豆列入全国三大优势产区之一，国家发改委又将川渝大豆纳入国家十二五主要粮食作物，四川大豆引起了国家及四川省各级政府的重视。四川大豆栽培方式主要是与玉米间、套作种植，占全省大豆种植面积的90%以上。因此，在四川大豆生产中接种匹配的优良根瘤菌，四川大豆的间套作体系对根瘤菌固氮酶活性的“氨阻遏”还能起缓解作用。四川套作大豆主导品种是“南豆12”和“贡选1号”。又四川间套作的大豆主要种植在四川丘陵区，光热资源丰富的攀西地区主要以春大豆或鲜食大豆为主。目前还没有筛选出与四川主栽大豆品种匹配，适合四川不同生态环境的优良大豆根瘤菌。为此，针对四川的主栽品种和种植大豆的主要生态环境进行大豆优良菌株的筛选，充分发挥生物固氮作用，提高生物固氮在生产实践中的应用效果，从而减少化肥的施用，这对于保护生态环境，节约能源资源，推动农业可持续发展具有重要实践价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46及其应用。

本发明的技术方案如下：

一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46，其分类命名为高效固氮大豆慢生根瘤菌SCAUs46BradyrhizobiumdiazoefficiensSCAUs46，已于2014年3月14日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2014083。

所述的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46应用于四川大豆的生产。

本发明的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是一株共生固氮能力强，对四川大豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA能力、具有溶无机磷、有机磷和溶钾能力、抗逆性较强的优良广谱大豆根瘤菌菌株。并且与四川的主栽大豆品种匹配亲和性好，在不同生态区不施氮肥、接种SCAUs46使大豆增产22%以上，与不接种对照的差异达显著水平。

附图说明

图1为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46在YMA培养基上的菌落形态。

图2为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的16rRNA基因序列的系统发育图。

图3为高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的glnII、atpD、recA三个持家基因联合构建的系统发育图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的分离、纯化和保存

从四川省攀枝花市盐边县种植的大豆中，选择健壮植株主根上大且饱满红色的根瘤，将根瘤擦洗干净，带部分根皮采下，用纸吸干并将其放在装有无水氯化钙并覆有脱脂棉的小管中。在实验室将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀后，用95%的乙醇浸泡30s以消除表面张力，接着用0.1%（m/v）的升汞表面消毒5min，再用无菌水冲洗6次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YAM培养基（甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄0.25g，MgSO₄.7H₂O0.2g，CaCl₂.6H₂O0.1g，NaCl0.1g，1%（m/v）钼酸钠2ml，1%（m/v）硼酸2ml，1%（m/v）刚果红2.5ml，pH6.8-7.0，琼脂18～20g，水1000ml）上划线，在28℃的恒温箱中培养。

待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到15d左右，因慢生根瘤菌需6～15d出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌：（1）加刚果红的YMA培养基上的菌落形态：不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3～5d就长出菌落的为快生根瘤菌，培养6～10d长出菌落的为慢生根瘤菌。（2）细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性（G-）。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例的分离纯化得到的菌株SCAUs46为慢生根瘤菌，在加刚果红的YMA培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度高、稍透明，7d左右长出菌落。经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

实施例2高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的回接及匹配性试验

高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的回接试验用水培法，试验中用的大豆品种是四川的主导品种“南豆12”，在光照室（控温22～24℃，光照强度2700～3000勒克斯，日照时间14h）进行，种植46d收获。与“南豆12”回接成功后再与其他的主栽大豆品种进行匹配性试验，也用水培法进行，试验中用的大豆品种：间套作的另一主栽大豆品种“贡选1号”、春大豆主栽品种“南豆8号”、主栽的鲜食大豆品种“春丰早”。在上述光照室培养1周后，放置在正常光照及温度条件下培养，种植41d收获。定期补充无菌微氮营养液，微氮营养液配方：0.46g硫酸钙，0.075g氯化钾，0.06g硫酸镁，0.03g硝酸钙，0.075g柠檬酸铁，0.136g磷酸氢二钾，1000ml蒸馏水，1ml微量元素（2.86g硼酸，0.02g钼酸，0.8g硫酸铜，0.22gZnSO₄硫酸锌，1.81g硫酸锰，加蒸馏水至1000ml）。将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46与上述大豆品种形成不同组合，水培器采用250ml的细颈瓶（医院用的玻璃输液瓶），以不接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的同品种植株为对照。收获后用大豆植株的根瘤数及植株干重来评价高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的接种效果。回接试验与匹配性试验的菌液培养、种子的催芽、水培器的制作及种植方法是一致的。

（1）菌液培养：将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28℃培养至对数生长期（约4d左右）。

（2）种子的催芽：选择粒大、饱满的无损伤的大豆种子，用95%酒精浸5min，倒去酒精，加入0.1%（m/v）的升汞溶液表面消毒5min。最后用无菌水清洗4～6次，每次5min。28℃催芽，待主根长到2～3cm左右，须根未长出时播种。

（3）水培器的制作：用250ml的细颈瓶（医院用的玻璃输液瓶）作水培器。先制作无菌微氮营养液，将配制好的无菌微氮营养液注入清洗后的瓶内，瓶口覆盖一层牛皮纸，在瓶口正中央开一小孔（直径约0.6cm），小孔塞上棉花，外罩一层耐高温的塑料薄膜，在121℃温度下灭菌备用。

（4）种植及测定指标：将催芽种子置于无菌培养皿中用菌液浸泡15min，用无菌镊子将种苗的根插入水培器小孔内，每瓶1株，然后每棵种苗再加入菌液1ml，种子周围用原来孔内的棉花塞好，防止尘埃落入瓶内，造成污染。另设不接种处理的同品种植株为对照（CK）。种植时先种CK。各处理重复3次。水培试验结果列于表1。

表1结果表明，所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46与4个供试大豆品种的匹配亲和性均好，均表现出较好的结瘤能力和共生固氮能力；与不接种根瘤菌的对照相比，高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46能显著提高每个品种大豆的植株干重，比不接种根瘤菌的对照提高22%～40%。可见，所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是与四川大豆品种匹配性好的优良广谱菌株。

表1高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的水培试验结果

注：数据为三次重复的平均值；**和*分别表示接种处理与相应对照之间的干重达1%、5%的显著水平。

实施例3高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的抗逆能力

对高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的抗逆能力主要进行了耐酸碱、耐盐及生长温室范围测定。以YMA培养基为基础培养基，均以pH7、28℃培养7d的YMA平板为阳性对照。将上述的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的YMA斜面培养物用无菌水刮洗待用。采用点接种方法，3次重复。以YMA培养基为耐酸碱性测定的基础培养基，用HC1和NaOH调节pH值，pH值依次为4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。耐盐性测定同样以YMA培养基为基础培养基，将所述菌株点接种在含有NaC1的平板上，NaC1的质量体积分数为1％、2％、3％、4％和5％。耐酸碱、耐盐试验的平板均28℃培养7d后观察记载结果。生长温度范围测定，将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌株接种于YMA培养基上，共设5个温度处理，分别在4℃、10℃、37℃、40℃生化培养箱中培养30d、10d、7d、7d，另一处理60℃下热激处理30min后转到28℃下培养7d。试验结果表明高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46抗逆能力较强，能在pH5～12的平板上生长，但过酸或过碱的平板上菌落小于pH7的阳性对照，说明过酸过碱对其生长有一定的抑制作用；具有一定的耐盐能力，能在0.5%NaCl的YMA平板上生长；生长温度范围较广，能在10～37℃温度范围内生长，并且该菌株在60℃热激处理30min后仍能存活，说明该菌株能忍受短时间的高温。

实施例4高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的促生能力

中国74%的土壤耕地缺磷，且土壤中95%以上的磷难被植物直接吸收利用。而人工施入的磷肥当季作物利用率为仅有5%～25%，大部分很快被土壤化学固定而形成闭蓄态难溶性磷酸盐。这种“高投入、低产出”的生态链，不仅造成大量磷素资源的浪费，且消耗资源造成的环境污染也日益加重。虽然中国的可溶性钾资源匮乏，但含钾岩石以及土壤中的含钾矿物颗粒却十分丰富，但这些含钾矿物中的钾主要是以难溶性含钾硅酸盐形式存在，也不能直接为作物吸收利用。因此，通过筛选高效固氮、溶磷溶钾等功能性微生物提高大气氮和土壤磷、钾的利用效率，已被公认为廉价而高效的极具环保意义的生物措施。

高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的促生能力主要考察其溶磷能力、溶钾能力和分泌植物生长素（IAA）的能力。

（1）溶有机磷和无机磷的能力

用溶磷圈法。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为磷酸钙（Ca₃(PO₄)₂）、磷酸铝（AlPO₄.2H₂O）、磷酸铁（FePO₄.2H₂O），均为市售分析纯试剂。

测定溶解有机磷能力的培养基用蒙金娜培养基，配方（g/L）：10g葡萄糖，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.3gNaCl，0.3gKCl，0.03gFeSO₄.7H₂O，0.03gMnSO₄.4H2O，0.2g卵磷脂，5gCaCO₃，0.4g酵母粉，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中卵磷脂用75%酒精加热溶解，单独灭菌，与灭菌冷却至60℃左右的培养基混合后倒平板。

测定溶解无机磷能力的培养基用PKO培养基，配方（g/L）：10g葡萄糖，3.0g上述无机磷源物质，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.2gNaCl，0.2gKCl，0.03gMgSO₄.7H₂O，0.03gMnSO₄，0.003gFeSO₄.7H₂O，0.5g酵母粉，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁用研钵碾碎过300目筛并单独干热灭菌后，与灭菌温度降至60℃左右的培养基混合倒平板，待用。菌种制备及点接种方法同实施例3抗逆性试验，重复3次。28℃培养箱培养7d后观察菌株是否生长以及是否有溶磷圈出现。结果表明高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46在磷酸铝平板上表现为不生长，对磷酸钙、磷酸铁和卵磷脂均具有一定的溶解能力，卵磷脂、磷酸钙、磷酸铁平板上测定的溶磷圈直径与菌落直径比值分别为1.13、1.18、1.12。

（2）溶钾能力

测定溶钾能力的培养基（g/L）：5.0g蔗糖，2.0gNa₂HPO₄，0.05gMgSO₄.7H₂O，0.05gFeCl₃，0.1gCaCO₃，5g钾长石粉，20.0g琼脂，蒸馏水1000ml。其中钾长石粉，经研磨成粉状，过300目筛，用去离子水洗去水溶性K、Si等离子，阴干。单独干热灭菌后，与灭菌冷却至60℃左右的培养基混合后倒平板，待用。菌种制备及点接种方法同上述溶磷能力的测定，重复3次。28℃培养箱培养7d后观察菌株是否生长，因该培养基以钾长石粉为唯一钾源，若生长就表明菌株具有溶钾能力。该试验结果表明，高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46在以钾长石粉为唯一钾源的平板上正常生长，表明高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46具有一定的溶钾能力。

（3）分泌植物生长素能力的测定

采用比色法测定根瘤菌分泌植物生长素（IAA）的能力，测定培养基采用改良的刚果红液体培养基，培养基组成：0.5gK₂HPO₄.3H₂O、0.2gMgSO₄.7H₂O、0.1gNaCl、1g酵母膏、10g甘露醇、10ml0.25%（m/v）刚果红、1gNH₄NO₃、100mgL-色氨酸、1000ml蒸馏水、pH=7.0。比色液配方：0.5MFeCl₃1ml、浓H₂SO₄30ml、蒸馏水50ml。

将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌株接种于盛有50ml培养基的三角瓶中，置于转速125rpm/min，温度28℃的摇床培养，3次重复，培养12d后，取根瘤菌悬浮液100μl置于白色塑料比色板上，加100μl的比色液，15min后观察颜色变化。粉红色为阳性，表示菌株能够分泌IAA，粉红色颜色越深表示分泌IAA能力越大；无色为阴性，表示菌株不能分泌IAA。在比色液中分别加入等量的10mg/L（CK1）、30mg/L（CK2）、50mg/L（CK3）IAA作阳性对照进行粉红色颜色深度的比较。结果表明，高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的比色反应为粉红色，且粉红色深度介于两个阳性对照CK1和CK2之间，说明高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46分泌IAA的量介于10～30mg/L之间。

实施例5高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的16SrRNA基因及其他持家基因glnII、atpD、recA的扩增及系统发育分析

提取高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌株总DNA，用表2所示引物分别对上述4个基因进行PCR扩增，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器，PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到英俊公司进行序列的测定。本研究的基因扩增引物列于表2。用软件DNAman6.0进行基因序列相似度的计算。

表2本试验中所用PCR引物

注：Y=CorT,H=A,CorT,R=AorG,S=CorG,K=GorT,N=A,C,GorT,I=inosine,M=AorC,N=anybase..

（1）16SrRNA基因的扩增及系统发育树的构建

以总DNA为模板，用表2通用引物P1和P6扩增16SrRNA基因序列。PCR反应体系（50μl）：2×PCRMix25μl，引物P1和P6（20μM）各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后英俊公司测序的结果如SEQIDNo1。

SEQIDNo1序列：

AAGTGCGGCAGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGGCGTAGCAATACGTCAGCGGC

AGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGGTTCGGAACAACACAGGGA

AACTTGTGCTAATACCGGATAAGCCCTTACGGGGAAAGATTTATCGCCGAAAGATC

GGCCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCA

GTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACT

CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGC

CATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTGTGCGGGAAG

ATAATGACGGTACCGCAAGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGT

AATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGC

GGGTCTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGATA

CTGAAGATCTTGAGTTCGGGAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAAT

TCGTAGATATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCCGATACTG

ACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA

CGCCGTAAACGATGAATGCCAGCCGTTAGTGGGTTTACTCACTAGTGGCGCAGCTA

ACGCTTTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAA

TTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGC

AGAACCTTACCAGCCCTTGACATGTCCAGGACCGGTCGCAGAGATGTGACCTTCT

CTTCGGAGCCTGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA

TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCCGTCCTTAGTTGCTACCATTTAG

TTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACG

TCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGAC

AATGGGATGCTAAGGGGCGACCCTTCGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGG

ATTGGGCTCTGCAACTCGAGCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAG

CACGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG

GAGTTGGCTTTACCTGAAGACGGTGCGCTAACCAGCAATGGAGGCAGCCGGCCAC

GGTAGGTCAGCGAGCTT

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）进行比对，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，构建系统发育树。用Mega5软件中的邻接法（Neighbor-joining）进行16SrRNA基因系统发育树的构建，自展值（bootstrap）1000，其系统发育树见图2。由比对结果和系统发育树可知，根瘤菌SCAUs46属于慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium），其16SrRNA基因序列与模式菌株高效固氮大豆根瘤菌BradyrhizobiumdiazoefficiensUSDA110^T，相似度最高，为99.4%。

（2）多位点基因序列的联合系统发育树的构建

为进一步更准确地确定所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的分类地位，另选择3个位点的持家基因atpD、recA和glnII序列进行联合系统发育树的构建。

扩增recA用引物recAF2、recAR2，atpD用引物atpDF3和atpDR，glnII用引物GSII-1和GSII-2，引物序列如表2所示。反应体系为50μl，反应液组成如下：反应体系（50μl）为：2×PCRMix25μl；10mM的正向引物和反向引物各0.5μl；DNA模板1μl；ddH₂O23μl。（1）recA和atpD的PCR扩增反应程序相同：95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火45s，74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸6min。（2）glnII扩增条件：92℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1.5min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后送英俊公司测序，对每个基因进行两向测序（正、反引物的序列），然后将正、反引物序列用DNAman6.0软件拼接，去掉正、反引物的序列后分别获得atpD、glnII、recA序列，序列结果分别如SEQIDNo2、SEQIDNo3、SEQIDNo4。

SEQIDNo2序列：

ATCGGCGAGCCGATCGACGAAGCCGGCCCGGTCAAGTCGGAAGGCCTGCGCGCCA

TCCACCAGGAAGCGCCGACCTACACCGACCAGTCCACCGAAGCTGAAATTCTCGT

CACCGGCATCAAGGTCGTCGATCTCCTGGCTCCCTATGCGAAGGGCGGCAAGATC

GGCCTGTTCGGCGGCGCCGGCGTCGGCAAGACCGTGCTGATTCAGGAGCTGATCA

ACAACGTCGCGAAGGCGCACGGTGGTTACTCCGTGTTCGCCGGCGTCGGCGAGCG

TACCCGCGAGGGCAACGACCTCTATCACGAGTTCATCGAGTCCAAGGTCAACGCC

GATCCGCACAATCCGGATCCGAGCGTGAAGTCGAAGTGCGCGCTGGTGTTCGGCC

AGATGAACGAGCCGCCGGGCGCCCGCGCCCGCGTCGCGCTCACCGGTCTGACCAT

CGCGGAAGACTTCCGCGACAAGGGCCAGGACGTGCTGTTCTTCGTCGACAACATC

TTCCGCTTCACC

SEQIDNo3序列：

CGTCGTTCCCGACGCTCGAGCAGCTTCCGCTCTGGGGCTTCGATGGCTCCTCCACC

CAGCAGGCCGAAGGCCACAGCTCCGATTGCGTGCTGAAGCCGGTCGCCGTCTTCC

CGGACGCCGCGCGCACCAACGGCGTGCTCGTGATGTGCGAAGTCATGATGCCCGA

TGGCAAGACCCCGCACGCCTCCAACAAGCGCGCCACCATTCTCGACGACGCCGGC

GCCTGGTTTGGCTTCGAGCAGGAATACTTCTTCTACAAGGACGGCCGTCCGCTCGG

CTTCCCGACCTCCGGTTATCCGGCGCCGCAGGGCCCGTACTACACCGGCGTCGGCT

TCTCGAACGTCGGCGACGTCGCCCGCAAGATCGTCGAAGAGCATCTCGACCTCTG

CCTCGCGGCCGGCATCAACCATGAAGGCATCAACGCGGAAGTCGCGAAGGGCCA

GTGGGAATTCCAGATCTTCGGCAAGGGCTCCAAGAAGGCCGCTGACGAAATGTGG

ATGGCCCGCTACCTGATGCTGCGCCTGACCGAAAAGTACGGCATCGACATCGAGTT

CCACTGCAAGTCGCTTGGCGACACC

SEQIDNo4序列：

GCTCGGTGATGAAGCTCGGCAAGAACGATCGGTCGATGGATGTCGAGGCGGTGTC

CTCCGGTTCCCTCGGGCTCGACATTGCGCTCGGCATCGGCGGCCTGCCGAAGGGG

CGCGTCGTGGAAATCTACGGGCCGGAATCCTCGGGCAAGACCACGCTGGCGCTGC

ACACGGTGGCGGAAGCGCAGAAGAAGGGCGGCATCTGTGCCTTCATCGACGCCG

AGCACGCGCTCGACCCGGTCTATGCGCGCAAGCTGGGCGTCAACATCGACGAGCT

GCTGATTTCGCAGCCGGACACCGGCGAGCAGGCGCTGGAAATCTGCGACACGCTG

GTGCGCTCGGGTGCGGTGGACGTTCTGGTGGTCGATTCGGTCGCGGCGCTGGTGC

CGAAGGCCGAGCTCGAGGGCGAGATGGGCGATGCGCTGCCGGGACTTCAAGCGC

GGTTGATGAGCCAGGCGCTGCGCAAGCTGACGGCTTCCATCAAACCATTCC

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）进行比对，发现与高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的atpD、glnII和recA三个位点持家基因的序列相似度最高的模式菌株均是BradyrhizobiumdiazoefficiensUSDA110^T，与该模式菌株的相似度分别为99.4%（atpD）、100%（glnII）、95.1%（recA）。应用每个基因序列在NCBI上比对结果，选择与三个基因相似度高的模式菌株作为建树的参比菌株。

三个基因（atpD、glnII和recA）联合系统发育树的构建：先将atpD、glnII、recA三个持家基因的序列分别与参比菌株的相应基因序列，用MEGA5比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的序列保存为FASTA格式，剪齐后三个基因序列长度分别为453nt、519nt、480nt。以记事本格式打开将3个序列拼接在一起，用MEGA5软件中的邻接法（Neighbor-joining）进行联合系统发育树的构建，自展值（bootstrap）1000，atpD、glnII、recA联合系统发育树如图3所示。

图2和图3显示，高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的16SrRNA基因，以及atpD、glnII、recA三个持家基因联合序列与高效固氮大豆根瘤菌的模式菌株BradyrhizobiumdiazoefficiensUSDA110^T，在同一分支节点上。又如前分析，所述菌株的这四个基因的相似度最高的模式菌株均为BradyrhizobiumdiazoefficiensUSDA110^T，表明菌株SCAUs46属高效固氮大豆根瘤菌（Bradyrhizobiumdiazoefficiens）。

实施例6田间接种效果

四川大豆主要生产区是四川丘陵区，面积最大的大豆品种为“南豆12”，主要作为夏大豆和秋大豆品种。光热资源丰富的攀西地区与丘陵区的生境差别大，攀西地区主要以春大豆为主，近年来引种大豆“于是8号”和“春丰早”为该生态区的主栽大豆品种。所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌株的田间接种效果试验选择典型的四川大豆主产区——四川自贡市荣县丘陵区，和攀西地区——攀枝花市仁和区进行。

（1）丘陵区——在四川自贡市荣县的田间接种试验

本试验共设两个处理，接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46和不接种对照处理（CK），豆种选择四川种植面积最大的主栽品种“南豆12”，未施用任何化学肥料和有机肥。采用田间随机区组排列。试验于2012年5月～11月进行。将制备好的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌剂（活菌数4.5×10⁸CFU/g菌剂）与大豆拌种，阴干后穴播，每窝6粒，定苗2株，小区面积3m²，窝距40cm，行距30cm，播种时先播CK，以避免CK处理受接种根瘤菌的影响。在植株盛花期（生育期77d）采样，测定植株株高、根瘤数、地上部分植株干重；收获期（生育期134d）测定产量。期间的管理按农户种植大豆的常规管理执行。

表3自贡市荣县（丘陵区）的田间接种效果

接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的处理，在盛花期的根瘤数比不接种对照CK增高54%，盛花期植株干重和收获期的产量分别比CK高20%、22%，与CK的差异均达显著水平。可见，接种的优良根瘤菌对植株盛花期后生长的作用更明显。所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46是适合本生态区（四川丘陵区）“南豆12”生产的优良根瘤菌。

（2）攀西地区的田间接试验

本试验选用豆种为当地主栽品种“于是8号”，共设两个处理，接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46和不接种对照（CK）处理，设3次重复。种植前按P₂O₅45kg/ha，K₂O45kg/ha施底肥，按统标准一次性放入，磷肥为过磷酸钙，钾肥为氯化钾。试验采用随机区组设计，起垄种植，每小区4垄，垄宽60cm，垄间间隔20cm，垄长5m。垄上种植两行，行距40cm，窝距30cm，每垄种植32窝。试验于2013年5月～9月进行。将高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46菌剂与大豆“于是8号”拌种，阴干后穴播，每窝5粒，定苗2株，播种时同样先播CK。在植株初荚期（生育期67d）采样，测定植株株高、根瘤数、地上部分植株干重；收获期（生育期98d）测定产量。期间的管理按当地农户种植大豆的常规管理执行。

表4攀西地区的田间接种效果

接种高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的处理，在初荚期的株高、植株干重、根瘤数和产量均比不接种对照（CK）显著增加，分别增加21.9%、35.9%、406.8%、39.4%。可见，所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46与四川攀西地区主栽大豆品种“于是8号”匹配性好，是适合攀西生态环境大豆生产的优良根瘤菌。

在四川两个典型的生态区的田间接种试验研究发现，接种所述高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46后，植株干重、根瘤数和产量均高于不接种对照，并且有极显著的增产效果，可增产22%以上。可见，本发明分离获得的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46可以在四川大豆生产中大面积的推广应用。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一株高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNO:M2014083。

2.根据权利要求1所述的高效固氮大豆根瘤菌SCAUs46的应用，其特征是，应用于四川大豆的生产。