CN104974962A

CN104974962A - 一株不动杆菌属解磷促生细菌y40及其应用

Info

Publication number: CN104974962A
Application number: CN201510399215.XA
Authority: CN
Inventors: 沈其荣; 李�荣; 赵买琼; 张瑞福
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Jiangsu Green Bo Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-07-08
Also published as: CN104974962B

Abstract

本发明提供了一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40及其应用，该菌株分离于马铃薯根际，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.10241。摇瓶实验结果表明，菌株能够有效降低溶液pH并溶解溶液中难溶性磷；灌菌盆栽试验结果表明，该菌株能够有效促进番茄和茄子植株的生长，同时菌株能够在植株根际大量定殖，存活于根际发挥促生作用。

Description

一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，提供一株不动杆菌属解磷促生细菌Y40及其应用。

背景技术

磷是植物生长必不可少的营养元素，我国耕地缺磷现象普遍，土壤中无效磷形态占到95％，植物几乎不能直接吸收利用。土壤中难溶性磷可分为有机磷和无机磷，其中难溶性有机磷占土壤全磷的20％-50％。过磷酸钙等磷肥的有效磷含量偏低，而且施用后磷肥当季利用率为5％-25％，剩余大部分磷与土壤中的Ca²⁺、Fe³⁺以及Al³⁺等结合形成难溶性磷酸盐，因此，如何提高磷利用率是一个急需解决的问题。植物根际的解磷菌数量不足以和其他微生物竞争，难以发挥其活性。固氮、解磷、解钾菌株是微生物肥料的主要菌株，因此，有必要从植物根际自然条件下筛选高效解磷菌株，制成微生物菌剂回接到土壤中，确保该类微生物能够有效定殖于植物根际，以促进植物生长。一些研究者提出一个方案：通过开发高效解磷微生物肥料，减少化学肥料的使用来提高土壤中有效磷的含量。同时，一些研究者经过试验证实解磷菌与有机肥料在一起能发挥更好的解磷作用。因此，本发明正好把二者很好地结合起来。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株具有解磷作用的不动杆菌属解磷促生细菌。

本发明的另一目的是提供该细菌的应用。

本发明的又一目的是提供该细菌制备的生物肥料及其应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株乙酸钙不动杆菌Y40，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.10241。

菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阴性，菌体着色均匀，呈球杆状，两端钝平，呈不规则形状。淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸盐，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸利用均呈阳性。7％NaCl生长。菌株16S rDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株 Y40位于Acinetobacter calcoaceticus分支上,结合生理生化试验将Y40鉴定为不动杆菌属细菌。

本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中的应用。

本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40在制备促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长的生物肥料中的应用。

由本发明所述的乙酸钙不动杆菌Y40制备的解磷促生生物肥料。

所述的解磷促生生物肥料优选主要通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO.10241的不动杆菌属细菌Y40接种到LB培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH值自然，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵时间为40h，使发酵液中含菌量≥1×10¹⁰个/mL。

所述的解磷促生生物肥料进一步优选得到发酵液后将其按照常规方法制备为其他的生物肥料常用剂型，优选制备为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。

本发明所述的解磷促生生物肥料在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中的应用。

所述的应用，优选将所述的发酵液8000～10000r/min离心5～10min后，采用等体积0.9％(g/100ml)的生理盐水重悬菌体，然后直接加至植物根际。以降低成本为基准，添加量优选按照3％(ml/100g)进行。

有益效果

本发明主要利用Y40菌株能够根际有益，高效定殖于植物根际，发挥解磷作用，将土壤中难溶性磷转化为植物可以吸收利用的可溶性磷，从而促进作物生长。专利产品应用后，促生效果好，适合蔬菜作物产区大面积使用。

该菌株及其效应验证与其它菌株相比具有如下优点：

1)本发明所获得的解磷菌株Y40为不动杆菌属高效解磷细菌，分离于植物根际，因此，应用时，相比于其他菌株能够更加有效的在植物根际大量定殖，从而高效发挥解磷促生功能，具有显而易见的优势。

2)研究结果表明，本专利分离获得的解磷菌Y40，在多季盆栽试验中表现出显而易见的稳定促生能力。

附图说明

图1基于菌株Y40的16S rDNA基因序列采用邻接法建立的系统发育树

图2第一季番茄促生盆栽效果图

图3第二季番茄促生盆栽效果图

图4第一季茄子促生盆栽效果图

图5第二季茄子促生盆栽效果图

图6解磷菌Y40根际定殖情况图

生物材料保藏信息

菌株Y40，分类命名为乙酸钙不动杆菌Acinetobacter calcoaceticus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.10241。

具体实施方式

实施例1、功能菌株的分离及鉴定

剪取5g马铃薯根至盛有45mL无菌水的三角瓶中，170rpm振荡30min制成悬液，然后依次配备浓度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的土壤稀释液。从10^-4、10^-5、10^-6稀释液中取0.1mL溶液分别涂布于磷酸钙盐无机磷培养基和卵黄培养基上(每个浓度在各培养基上重复3次)。分离解有机磷和无机磷细菌平板分别在30℃下培养2-3d和5-7d后，取出观察，选择在固体培养基平板上产生透明圈的菌落初步认定为解磷细菌，划线纯化后，于4℃冰箱保存留待进一步研究。

其中所用磷酸钙盐无机磷培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂5g，卵黄培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，蛋黄液10mL，用去离子水定容至1000mL，pH 6.0-6.5，琼脂18-20g，115℃下灭菌30min。蛋黄液的制备：在超净工作台上，先用棉花蘸取适量的酒精把鸡蛋的外壳擦干净，一般进行三次擦洗。接着用已经用酒精擦洗过的镊子在鸡蛋壳的一端敲开小孔，卵清液流入灭菌的小锥形瓶中，剩下的卵黄液让其流入已灭菌的试剂瓶中，再按照蛋黄液：0.9％的灭菌生理盐水等体积混合后放冰箱中备用。最终分离获得一株菌株命名为Y40，具有优异的解磷效果。

菌株Y40在LB平板上的菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，具有一定的黏性，易挑起。在显微镜下所观察到的营养体细胞，革兰氏染色阴性，菌体着色均匀，呈球杆状，两端钝平，呈不规则形状。淀粉水解反应，V.P反应，接触酶反应，利用柠檬酸盐反应，甲基红反应，明胶液化反应均呈阳性，葡萄糖，阿拉伯糖，葡萄糖酸盐，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸利用均呈阳性。7％NaCl生长。菌株16S rDNA序列构建的系统发育树见图1。菌株Y40位于Acinetobacter calcoaceticus分支上，结合生理生化试验将Y40归类为Acinetobacter calcoaceticus，将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10241。

实施例2、功能菌灌菌菌悬液的生产

将菌株Y40(CGMCC NO.10241)接种至LB培养液中液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH 6.0～7.0，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵时间为40h，使发酵液中含菌量≥1×10¹⁰个/mL；灌菌液为发酵液8000r/min离心6min后，采用等体积0.9％的生理盐水重悬菌体。

其中所用LB培养基配制方法为，以配制1L培养基为例：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂18-20g，定容至1000mL，pH值自然，121℃灭菌20min。

实施例3、温室促生效果试验

3.1 促生有机肥在番茄(第一季、第二季)上的应用效果

两季番茄促生试验均在江苏中宜生物肥料工程中心温室里进行，供试作物：番茄品种为合作906，番茄种子用60℃温水浸泡，搅拌至室温，取沉淀种子，5％次氯酸钠消毒处理3min，无菌水清洗3-4次后，于30℃培养箱中遮光催芽至露白后埋入基质中，培育出适时、量足、苗壮、苗齐的番茄苗。共设三个处理：1)添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40灌菌菌悬液(Y40)；2)添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)；3)添加腐熟鸡粪和过磷酸钙(CK2)。每个处理8盆，每盆装土2kg，肥料添加量为每盆30g，磷酸钙和过磷酸钙的添加量为3g/盆，Y40灌菌菌悬液的接种量以降低成本为基准，按照3％(体积/质量)进行。

。肥料与土拌匀作为基肥，40天测定各处理株高、茎粗、SPAD值、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重，并稀释涂布计数各处理中功能菌Y40在根际的定殖数量。

第一季番茄促生效果如图2、生物量情况如表1所示，移苗40天后，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理与添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)在各个指标中除茎粗外，其余均达到了显著性差异(p<0.05)。与CK1相比，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)的处理在株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重方面，分别增加了 10％、0.87％、10.60％、1.09％、9.24％和13.11％。

第二季番茄促生效果如图3、生物量情况如表2所示，移苗40天后，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理的番茄生长过程中各项指标除茎粗外，其余指标均显著高于添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)。与CK1相比，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)的处理在株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重及地下部干重方面，分别增加了13.71％、12.79％、15.19％、41.03％、13.40％和25.92％。

综上两季盆栽结果表明，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理与添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)处理的各项指标之间都达到了显著性差异。与添加腐熟鸡粪和过磷酸钙(CK2)处理的番茄株高、茎粗、地上部鲜重及地下部干重之间差异不显著，说明Y40菌株很好的发挥了解磷促生功能。

表1、第一季番茄促生盆栽试验生物量情况

表2、第二季番茄促生盆栽试验生物量情况

3.2 促生有机肥在茄子(第一、二季)上的应用效果

茄子品种为苏琦茄，两季茄子盆栽采用上述番茄同样的育苗方式和处理。两季茄子生物量结果如表3和表4所示，第一季茄子促生效果如图4、生物量情况如表3所示，移苗后40天，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)与添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)在地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重方面均达到了显著性差异(p<0.05)。与CK1相比，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理的茄子在株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重方面，分别增加了19.33％、10.88％、31.09％、177.18％、33.70％和95.70％。

第二季茄子促生效果如图5、生物量情况如表4所示，移苗后40天，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理的茄子生长过程中的各项指标均与添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)处理之间达到了显著性差异(p<0.05)。同时，株高和茎粗与添加腐熟鸡粪和过磷酸钙(CK2)之间差异不显著。与CK1相比，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)处理的茄子在株高、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重和地下部干重方面，分别增加了15.71％、34.41％、1.40％、2.51％、9.72％和23.77％。

综上两季盆栽结果表明，添加腐熟鸡粪、磷酸钙和Y40发酵液(Y40)与添加腐熟鸡粪和过磷酸钙(CK2)处理的茄子在株高、茎粗和地下部鲜重达到了显著性差异，与添加腐熟鸡粪和磷酸钙(CK1)处理的各项指标之间都达到了显著性差异。说明Y40菌株很好的发挥了解磷促生功能。

表3、第一季茄子促生盆栽试验生物量情况

表4、第二季茄子促生盆栽试验生物量情况

3.3 解磷菌Y40在作物根际的定殖情况

根际定殖功能菌株Y40采用固体磷酸钙盐无机磷培养基和卵黄培养基计数(具体实施方案中的配方)，功能菌Y40菌落数以每克根干重计算。

由图6可以看出：解磷菌Y40在两季番茄和茄子上的定殖都达到了相当水平，解磷菌Y40在第一季和第二季番茄上的定殖能力分别达到4.5×10⁷CFU/g和5.4×10⁷CFU/g，在第一季和第二季茄子上的定殖能力分别达到4.5×10⁷CFU/g和4.3×10⁷CFU/g。由根际定殖情况大概可以得出解磷菌Y40在番茄和茄子根际上有很强的定殖能力。

Claims

1.一株乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter sp.)Y40，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.10241。

2.权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌Y40在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中的应用。

3.权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌Y40在制备促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长的生物肥料中的应用。

4.由权利要求1所述的不动杆菌属细菌Y40制备的解磷促生生物肥料。

5.根据权利要求4所述的解磷促生生物肥料，其特征在于主要通过以下方法制备：将保藏号为CGMCC NO.10241的乙酸钙不动杆菌Y40接种到LB培养液中，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH值自然，发酵温度范围30～35℃，搅拌速度为170～200转/分钟，发酵时间为40h，使发酵液中含菌量≥1×10¹⁰个/mL。

6.根据权利要求5所述的解磷促生生物肥料，其特征在于得到发酵液后将其按照常规方法制备为其他的生物肥料常用剂型。

7.根据权利要求6所述的解磷促生生物肥料，其特征在于得到发酵液后将其按照常规方法制备为制备为粉剂、颗粒剂或悬浮剂。

8.权利要求5所述的解磷促生生物肥料在促溶解土壤中难溶性磷和/或进植物生长中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将权利要求5所述的发酵液8000～10000r/min离心5～10min后，采用等体积0.9％(g/100ml)的生理盐水重悬菌体，然后直接加至植物根际。