CN108504608B - 一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用，所述菌为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS‑A01‑1，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14378。所述毛竹内生乙酸钙不动杆菌具有解磷解钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，促进毛竹光合作用，提高生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作用。

Description

一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用。
背景技术
毛竹（Phyllostachys edulis）是中国南方地区重要的森林资源，属散生型竹种，具有生长快、成材早、用途广、经济收益大等优点。根据国家林业局第6次全国森林资源清查统计，福建、江西、浙江等10省（自治区、直辖市）竹林面积占全国竹林总面积（484.26万hm2）的93.78%。其中毛竹约337.2万hm2，占全国竹林面积的70%。
植物内生细菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部，并且与植物建立了和谐联合关系的细菌（胡桂萍等，2010）。有益的内生细菌不仅将植物作为栖息场所，而且对寄主植物具有促生、防病、内生固氮等多方面的生物学作用（何红等，2004），从而促进植物对恶劣环境的适应和保证寄主植物健康生长。
国内外学者已对茄子、棉花、水稻、烟草、杨树、铁皮石斛等多种植物的内生细菌进行了深入的研究。近年来，李潞滨等（2008）、王纪杰（2008）、徐秋芳（2006）、齐泽民（2006）等人分别对毛竹和苞箭竹根际微生物和土壤细菌进行了研究，夏冬亮等（2009）、韩烁等（2010）也探索了毛竹根部内生细菌分离培养基的选择，毛竹根部解磷细菌的分离与筛选。但目前对毛竹不同组织可培养内生细菌分离、解磷解钾固氮功能内生细菌的筛选及具有促进光合作用的功能内生细菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14378，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌的菌落特征及菌体形态为：
将WYS-A01-1在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为白色，具有光泽，呈圆形、表面光滑、边缘整齐，无流动性，革兰氏染色阴性，无芽孢；菌落直径4-5mm。
所述促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌的生理生化特征：
WYS-A01-1接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阴性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
将所述促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: WYS-A01-1与Acinetobacter calcoaceticus同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Acinetobacter calcoaceticus（HM063913）的相似度达99%。结合菌落形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）。
本发明的优点在于：
所述毛竹内生乙酸钙不动杆菌具有解磷解钾固氮的作用，可以在植物体内定殖，促进毛竹光合作用，提高生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要的作用。
本发明所述乙酸钙不动杆菌制成菌剂通过灌根接种到毛竹幼苗，可以明显提高毛竹叶片叶绿素含量、提高光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，降低叶片胞间CO2浓度(Gs)，与对照相比，差异达显著水平。通过竹腔注射接种到II度毛竹，可以提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量，与对照相比，差异达显著水平。因此，本发明为将来开发毛竹专用的微生物菌剂菌肥提供了良好的菌株资源。
附图说明
图1 内生细菌处理后毛竹叶片 SPAD值的变化。
图2 内生细菌处理后毛竹叶片 CAT 活性的变化。
图3 内生细菌处理后毛竹叶片MDA含量的变化。
图4 内生细菌处理后毛竹叶片POD活性的变化。
图5内生细菌处理后毛竹叶片SOD 活性的变化。
图6内生细菌处理后毛竹叶片可溶性蛋白含量的变化。
图7内生细菌处理后毛竹叶片可溶性糖含量的变化。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
一株促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14378。
实施例1 促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌的筛选
（1）筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建省武夷山市、长汀县、将乐县毛竹中心产区I度毛竹中分离出82株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。通过平板解磷解钾固氮效果测定初步筛选出20株具有较好解磷解钾固氮效果的内生菌株，最终筛选出一株具有良好解磷解钾固氮效果的内生细菌，标记为WYS-A01-1。
（2）菌落特征及菌落形态：
将WYS-A01-1在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为白色，具有光泽，呈圆形、表面光滑、边缘整齐，无流动性，革兰氏染色阴性，无芽孢；菌落4-5mm。
（3）生理生化特征：
WYS-A01-1接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阴性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产H2S试验试验阳性。
（4）解磷解钾固氮能力测定：
将分离得到的内生细菌菌株分别接种到事先配制好的有机磷培养基、无机磷培养基、钾细菌培养基以及Ashby无氮培养基平板上，每皿4个接菌点，重复３次。28℃恒温培养 5d。分别观察并记录菌株生长情况及分解圈大小，根据分解圈大小、透明圈直径／菌落直径（Ｄ/ｄ值）确定内生细菌的解磷解钾固氮活性。分解圈越大、Ｄ/ｄ值越大，表示解磷解钾固氮活性越强。
其中，有机磷培养基： 葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
无机磷培养基：葡萄糖 10g，(NH4)2 SO4 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MnSO4 0.03g，FeSO4 0.03g，MgSO4 0.3g，CaCO3 5.0g，Ca3(PO4) 2 5.0g，酵母膏 0.4 g，琼脂 20g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
钾细菌培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）；
Ashby无氮培养基：蔗糖10.0g，酵母膏 0.5 g ，(NH4)2SO4,1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO3 1.0 g，钾长石粉 1g，琼脂 15g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0-7.2（液体培养基则不加琼脂）。
通过测定，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1解有机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为4.19±0.24，解无机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为1.82±0.33，解无机磷活性为“++”，透明圈/菌落直径（D/d）为4.50±0.34。固氮活性为“++”。
表1 高效解磷解钾固氮菌株的初步筛选
Figure DEST_PATH_IMAGE001
注: D:透明圈直径， d:菌落直径 ；
“-”：无活性（分解圈＜10mm）；“+”：有活性（分解圈:10-15mm）；
“++”：较强活性（分解圈：16-20mm）；“+++”：很强活性（分解圈：＞20mm）；
将初筛中具有解磷解钾活性的菌株接种于NB培养基中，待菌悬液的浓度达到108cfu/ mL时，各取5mL菌悬液分别接种于100 mL有机磷液体培养基、无机磷液体培养基及钾细菌液体培养基中，每个处理重复3 次，同时设不接种为对照。28℃，160 r /min 培养7d后进行离心（４℃，10000 r/ min，15 min），取上清液采用钼锑抗比色法测定测定有效磷增量（扣除对照后的值），可溶性磷含量计算公式如下：P＝K×V/V1。式中，P为有效磷含量；Ｋ为标准曲线查得显色液的磷含量（mg/L）；V为显色时溶液定容的体积（mL）；V1为显色时吸取上清液的体积（mL）。用火焰光度法测定测定有效钾增量（扣除对照后的值）。
通过测定，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1从0.2g/L卵磷脂中释放出的可溶性磷为77.85 mg/L，是对照处理（1.54 mg/L）的50.55倍，差异显著（P＜0.05）；从5.0g/L磷酸三钙中释放出的可溶性磷为48.35 mg/L，是对照处理（0.35 mg/L）的138.14倍，差异显著（P＜0.05）。培养液中可溶性钾含量为2.39 mg/L，与对照差异显著。
表2 摇瓶法内生细菌解磷效果测定
Figure 81661DEST_PATH_IMAGE002
（5）16S rDNA序列分析
16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示。将所测的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明:WYS-A01-1与Acinetobacter calcoaceticus 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Acinetobacter calcoaceticus（HM063913）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）。
（6）内生定殖
将所述内生细菌菌株WYS-A01-1通过利福平标记的方法，获得稳定的利福平标记抗性突变体菌株。在含300μg/ml 利福平（Rif）的NB培养基中，28 ℃，180 r·min-1 条件下振荡培养 72 h，用无菌水稀释制成含1× 108cfu/mL的菌悬液。通过灌根法及叶腋注射法接种毛竹幼苗，并于接种后3 d和7 d分别取毛竹幼苗根、茎、叶部组织分离突变体菌株。
测定结果表明，通过灌根法及叶腋注射处理第3 d及第7 d两种接种处理方法在毛竹的根、茎、叶部组织中均能回收到突变菌株，而对照中未分离到细菌，表明内生乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1可以在毛竹体内定殖，并可以传导与繁殖。
表3 灌根和注射法接种促生菌株在毛竹根体内的定殖分离结果
注：+表示可分离到细菌菌落。
实施例2 盆栽实验
将促进毛竹光合作用的内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2）中，于28℃、180 r·min-1 条件下振荡培养72h，培养液用无菌水稀释制成含1×108 cfu/mL的菌悬液做接种用。灌根接种毛竹幼苗后于15d、30d采用美国LI-COR公司生产的LI-6400型便携式光合作用测定仪进行毛竹幼苗叶片进行净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和细胞间隙CO2浓度等光合作用指标的测定。
毛竹盆栽幼苗经灌根接种内生细菌WYS-A01-1后15d、30d分别测定毛竹叶片光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Gs）。结果表明，经促生内生细菌处理后的毛竹幼苗叶片光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）显著高于对照，胞间CO2浓度（Ci）则低于对照。尤其以接种处理后15d测定数据最为显著。
盆栽毛竹幼苗接种15d后，毛竹幼苗叶片均高于对照，分别比对照高出39.47%，差异明显。促生内生细菌菌液接种30d后叶片光合速率均高于清水对照处理，见下表4。
表4内生细菌WYS-A01-1对毛竹叶片光合速率（Pn）的影响
Figure 467643DEST_PATH_IMAGE004
促生内生细菌接种15d后，毛竹幼苗叶片蒸腾速率均高于对照，比对照高出41.58%，内生细菌WYS-A01-1与清水处理对照差异明显。促生内生细菌接种30d后叶片蒸腾速率均高于清水对照处理，见下表5。
表5 内生细菌WYS-A01-1对毛竹叶片蒸腾速率（Tr）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
促生内生细菌接种15d后，毛竹幼苗叶片气孔导度均高于对照，分别比对照高出50.00%，与清水处理对照差异明显。促生内生细菌接种30d后叶片蒸腾速率均高于清水对照处理，差异显著，见下表6。
表6内生细菌WYS-A01-1对毛竹叶片气孔导度（Gs）的影响
Figure 935796DEST_PATH_IMAGE006
内生细菌接种15d后，毛竹幼苗叶片胞间CO2浓度均低于对照，比对照低27.87%，与清水处理对照差异明显。促生内生细菌接种30d后叶片胞间CO2浓度均低于清水对照处理，差异显著，见下表7。
表7 内生细菌WYS-A01-1对毛竹叶片胞间CO2浓度（Ci）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE007
蒸腾作用在转运水分和植物吸收方面具有重要推动作用，不仅能够维持植物各部分的水分饱和，保持细胞组织的形态，促进无机盐类在植物体内的分布，而且还能够散出植物进行光合作用和氧化代谢中多余的热能，同时植物在进行光合作用时必须张开气孔，从大气中获取所需的CO2，因此，促生内生细菌可以提高其光合作用，从而促进毛竹的生长。
实施例3 田间实验
选取福建省将乐县龙栖山自然保护区毛竹林基地，选取II度毛竹，先用电钻在距土表30cm左右的竹杆部位钻孔，然后取上述菌悬液30 mL分别用无菌注射器注射至毛竹竹腔内部，第二天重复接种30 mL，并用泥土封住竹腔空洞。每处理 10 株，3 次重复，以清水为对照。分别于处理后15d、30d通过高枝剪采集毛竹东、南、西、北四个方向的毛竹叶片各5-10片，并充分混合作为一个混合样，用于叶绿素含量、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶(SOD)、可溶性蛋白含量、可溶性糖等生理生化指标的测定。
采用SPAD-502叶绿素快速测定仪（Minolta，Japan），选取10片毛竹叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得SPAD值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用SPAD值表示叶片叶绿素相对值。
采用紫外分光光度法测定毛竹叶片过氧化氢酶（CAT）活性，参照硫代巴比妥酸法测定毛竹叶片丙二醛（MDA）含量，参照愈创木酚法测定毛竹叶片过氧化物酶（POD）活性活性，参照氮蓝四唑(NBT)光还原法测定毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用考马斯亮蓝比色法测定毛竹叶片可溶性蛋白含量，采用恩同比色法测定毛竹叶片可溶性糖含量。
促生内生细菌对毛竹叶片叶绿素含量的影响
从图1可以看出，经内生细菌注射接种处理后毛竹叶片SPAD值均高于清水接种的对照处理，其中内生细菌接种处理15d、30d，内生细菌接种处理毛竹叶片SPAD值与清水对照相比差异显著。内生细菌处理后的毛竹叶片叶绿素含量增加，因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，因此叶绿素含量的增加能够提高毛竹的光合作用速率，从而促进其生长。
促生内生细菌对毛竹叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响
由图2研究结果表明，内生细菌处理对毛竹叶片的过氧化氢酶(CAT)活性产生了显著的影响，内生细菌WYS-A01-1处理后的毛竹叶片过氧化氢酶活性均高于清水对照处理。内生细菌处理的毛竹叶片的 CAT 活性变化较一致，经内生细菌处理后，毛竹体内的 CAT 活性能迅速上升并维持在较高的水平，内生细菌WYS-A01-1处理15d时达到峰值，与对照处理之间差异显著。过氧化氢酶（CAT）是植物体内重要的酶促防御系统，可以清除 H2O2，是植物体内重要的抗氧化酶。由图2可以看出，接种内生细菌后，毛竹体内的 CAT 含量能迅速上升，经内生细菌处理后的毛竹叶片能迅速的提高其体内的抗氧化酶活性，充分与H2O2、O2-等物质反应，从而维持活性氧与其清除系统之间的相对平衡。
促生内生细菌对毛竹叶片丙二醛（MDA）活性的影响
内生细菌注射法接种处理II度毛竹后，毛竹叶片丙二醛（MDA）浓度的变化测定结果显示（图3），与清水处理对照相比，内生细菌接种15d、30d内各处理之间MDA浓度基本保持平稳或稍有降低。表明寄主体内MDA含量与寄主细胞的损伤程度相关，因此，毛竹经内生细菌处理后可以有效地降低MDA的含量，从而起到保护毛竹的细胞膜的作用。
促生内生细菌对毛竹叶片过氧化物酶(POD)活性的影响
由图4 可以看出，内生细菌WYS-A01-1接种处理15d和30d时POD活性明显高于清水对照处理，差异显著。研究结果表明促生内生细菌注射接种毛竹后可以提高毛竹叶片过氧化物酶（POD）活性，从而促进毛竹生长。
促生内生细菌对毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
内生细菌WYS-A01-1处理15 d 、30 d后，毛竹叶片的超氧化物歧化酶（SOD）活性变化与清水对照处理变化趋势基本相似，呈现平稳的趋势，且内生细菌WYS-A01-1处理15 d时与清水对照处理之间差异明显（图5）。说明注射法接种促生菌株后可以提高毛竹叶片的超氧化物歧化酶（SOD）活性。
促生内生细菌对毛竹叶片可溶性蛋白含量的影响
经各内生细菌处理后，毛竹叶片可溶性蛋白含量与清水对照处理毛竹叶片可溶性蛋白的含量均呈现逐渐增加的趋势；内生细菌WYS-A01-1接种15d和30d时毛竹叶片可溶性蛋白含量与清水对照相比，差异显著（图6）。由此可见，接种内生细菌可诱导毛竹叶片内可溶性蛋白含量的增加。
促生内生细菌对毛竹叶片可溶性糖含量的影响
毛竹叶片可溶性糖含量变化的测定结果表明(图7)，内生细菌处理及清水对照处理毛竹叶片可溶性蛋白的含量逐渐增加的趋势。内生细菌WYS-A01-1接种15d时，各内生细菌处理的毛竹叶片可溶性蛋白含量与清水对照相比，差异显著。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用
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<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcattctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc gacttcatgg agtcgagttg cagactccaa tccggactac gatcggcttt 180
ttgagattag catcctatcg ctaggtagca accctttgta ccgaccattg tagcacgtgt 240
gtagccctgg ccgtaagggc catgatgact tgacgtcgtc cccgccttcc tccagtttgt 300
cactggcagt atccttaaag ttcccgacat tactcgctgg caaataagga aaagggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac 420
ctgtatgtaa gttcccgaag gcaccaatcc atctctggaa agttcttact atgtcaaggc 480
caggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc 540
cccgtcaatt catttgagtt ttagtcttgc gaccgtactc cccaggcggt ctacttatcg 600
cgttagctgc gccactaaag cctcaaaggc cccaacggct agtagacatc gtttacggca 660
tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccatgct ttcgcacctc agcgtcagtg 720
ttaggccaga tggctgcctt cgccatcggt attcctccag atctctacgc atttcaccgc 780
tacacctgga attctaccat cctctcccac actctagcta accagtatcg aatgcaattc 840
ccaagttaag ctcggggatt tcacatttga cttaattagc cgcctacgcg cgctttacgc 900
ccagtaaatc cgattaacgc ttgcaccctc tgtattaccg cggctgctgg cacagagtta 960
gccggtgctt attctgcgag taacgtccac tatatctagg tattaactaa agtagcctcc 1020
tcctcgctta aagtgcttta caaccataag gccttcttca cacacgcggc atggctggat 1080
caggcttgcg cccattgtcc aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140
gtctcagtcc cagtgtggcg gatcatcctc tcagacccgc tacagatcgt cgccttggta 1200
ggcctttacc ccaccaacta gctaatccga cttaggctca tctattagcg caaggtccga 1260
agatcccctg ctttctcccg taggacgtat gcggtattag cattcctttc gaaatgttgt 1320
cccccactaa taggcagatt cctaagcatt actcacccgt ccgccgctaa gtgatagtgc 1380
aagcaccatc actccgct 1398

Claims (4)

1.一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌，其特征在于：所述菌为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14378。
2.含权利要求1所述乙酸钙不动杆菌的生物菌剂。
3.如权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌在解磷解钾固氮中的应用。
4.如权利要求1所述的乙酸钙不动杆菌在促进毛竹光合作用中的应用。
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