CN112662588B

CN112662588B - 一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用

Info

Publication number: CN112662588B
Application number: CN202110061326.5A
Authority: CN
Inventors: 邓勋; 宋小双; 遇文婧; 刘欣; 周琦; 马晓乾; 王琪; 李俊; 刘艳红; 姜瑞凤; 梁新宇; 王笑松
Original assignee: HEILONGJIANG PROV FOREST PROTECTION INSTITUTE
Current assignee: HEILONGJIANG PROV FOREST PROTECTION INSTITUTE
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-18
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2041-01-18
Also published as: CN112662588A

Abstract

本发明提供了一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用，属于微生物技术领域。针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaambifaria)菌株ZB‑155，具有产IAA、解磷能力，对樟子松等针叶木生长具有显著促进作用；而且该菌株还有分泌纤维素酶和蛋白酶能力，并且该菌株及其发酵产物对苗木立枯病、杨树烂皮病、松枯梢病、榛子叶枯病和榛子褐斑病等致病菌具有抑菌作用，而且还能改善植物根际土壤营养成分，因此，本发明提供了所述菌株及其衍生产品在植物种植和土壤改良中的应用。

Description

一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用。

背景技术

根际微生物组在促进植物生长、改善矿物质吸收、病害生物防治、提高植物抗逆性等方面发挥不可替代的作用，因此被称为“植物第二基因组”。根际促生细菌(PGPR，plantgrowth promoting rhizobacteria)是益生菌的典型代表，主要通过生物固氮作用、分泌激素、产生铁螯合载体、解磷作用等提高植物根际养分吸收能力，促进生长。代表性的PGPR菌属主要包括假单胞杆菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等。根际促生细菌提高植物抗逆性的作用机制主要包括：产生ACC脱氨酶、提高植物激素含量、诱导合成植物抗氧化酶、改善植物必须矿物元素的吸收、胞外高分子聚合物的产生、减少植物对过量养分和重金属的吸收、生物降解土壤中有毒物质、诱导植物抗逆基因表达等。

伯克霍尔德菌属(Burkholderia)作为优良的促生抗逆菌属，具有潜在的应用开发价值，如于存从马尾松根际分离筛选得到的伯克霍尔德菌株WJ27具有高效的溶磷作用，可显著促进马尾松苗木的生长。王瑞从水稻根际分离筛选的伯克霍尔德菌株B51-7是一株具有生物防治作用的高效解磷细菌，可应用于生物菌肥和生防制剂的研发。赤霉酸产生细菌Burkholderia cepacia在干旱和盐碱胁迫中可缓解逆境胁迫对黄瓜和大豆生长的影响，细菌产生的激素能够刺激植物的分析发育，提高其对逆境胁迫的抗性。王平从镉污染土壤中分离筛选的高耐Cd伯克霍尔德菌株B-6，可为给Cd污染土壤微生物修复提供功能菌株。

就伯克霍尔德菌研究来说，针叶树尤其是北方针叶树如樟子松、红松等根际促生抗病细菌资源的挖掘和利用严重滞后，近年来北方针叶树苗圃育苗中存在化学农药过量使用以及连作障碍等原因带来的苗木长势不好的问题，通过引入根际益生菌是促进苗木生长，改善根际微生态环境的有效途径，因此筛选挖掘北方针叶树根际促生抗逆细菌资源，对提高针叶苗木抗逆性水平，保障壮苗生产和提高后续造林成活率均具有重要的科学意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株，具有产IAA、解磷能力，对樟子松等针叶木生长具有显著促进作用。

本发明的目的还在于提供所述双向伯克霍尔德氏菌株的应用，所述菌株不仅具有促针叶树生长的作用，而且还可改善苗木根际土壤和理化性状，提高根际土壤中酶活性，抑菌谱广泛，抑制林木病原菌的作用。

本发明提供了一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏(Burkholderiaambifaria)菌株ZB-155，所述菌株ZB-155的保藏编号为CGMCC No.20813。

本发明提供了一种包含所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的产品。

优选的，所述产品包括微生物菌剂、土壤改良剂和微生物肥料。

本发明提供了所述产品在植物种植中的应用。

本发明提供了所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在促进植物生长中的应用。

本发明提供了所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在提高植物抗逆方面的应用。

优选的，所述抗逆包括抗植物病害；

优选的，所述抗植物病害中的病害包括苗木立枯病、杨树烂皮病、松枯梢病、榛子叶枯病和榛子褐斑病。

本发明提供了一种包含所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的抑菌剂。

本发明提供了所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155或所述抑菌剂在防治植物病害中的应用；

优选的，所述病害的病原菌包括立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、污黑腐皮壳菌(Valsa sordida)、松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)、链格孢菌(Alternaria alternata)和/或平脐蠕孢(Bipolaris bicolor)。

优选的，所述植物包括针叶树。

本发明提供的针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155，保藏编号为CGMCC No.20813。针叶树根际细菌ZB-155同时具有产IAA和解磷作用，实验结果表明，菌株ZB-155产IAA的量为43.15μg/mL，解磷值为215.36mg/L，同时经盆栽实验结果表明，针叶树根际细菌ZB-155对樟子松树具有很好的促生作用，可显著提高樟子松的苗高和地径，接种90d后，同对照组(CK)相比，ZB-155接种处理苗高、地径、鲜重和干重均值分别提高15.21％、15.83％、9.59％和20.61％。而且在立枯丝核菌胁迫条件下，同CK+SH相比，ZB-155+SH处理苗高、地径、鲜重和干重分别提高24.43％、10.15％、23.39％和17.42％。菌株ZB-155接种处理可显著促进樟子松苗木生长和生物量积累。

同时，本发明提供的双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155还具有产生纤维素酶和蛋白酶，而纤维素酶和蛋白酶在对病原菌的抑制作用中具有重要的作用。同时病原菌抑菌谱测定结果表明，针叶树根际细菌ZB-155及其发酵液对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、污黑腐皮壳菌(Valsa sordida)、松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)、链格孢菌(Alternaria alternata)和/或平脐蠕孢(Bipolarisbicolor)等多种病原菌菌丝生长具有明显的抑制作用。实验表明，樟子松1年生苗盆栽实验中，对由立枯丝核菌引起的立枯病防治效果为62.45％，同时可显著提高樟子松1年生苗中β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性。由此可见，针叶树根际细菌ZB-155在病害防治以及针叶苗木促生微生物菌肥开发方面具有较高的应用价值。因此，针叶树根际细菌ZB-155具有较好的促生抗逆特性，具有作为一种新型的微生物菌株资源开发应用的潜力。

生物材料保藏信息

双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年9月24日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.20813，菌株编号为ZB-155。

附图说明

图1为本发明提供的菌株ZB-155的形态特征，其中图1-A为肉眼观察图，图1-B为菌落放大图；

图2为本发明提供的菌株ZB-155的革兰氏染色结果图；

图3为本发明提供的菌株ZB-155 16S rRNA基因构建的系统进化树；

图4为本发明提供的菌株ZB-155对各病原菌的抑制结果图；其中，1～3为对峙培养(1污黑腐皮壳菌，2松球壳孢菌，3立枯丝核菌)；4～6为发酵液抑菌实验(4松球壳孢菌，5污黑腐皮壳菌，6平脐蠕孢)；

图5为菌株ZB-155解磷作用检测结果；左图为菌落正面，右图为菌落背面；

图6为菌株ZB-155蛋白酶检测结果，左图为菌落正面，右图为菌落背面。

具体实施方式

本发明提供了一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏(Burkholderiaambifaria)菌株ZB-155，所述菌株ZB-155的保藏编号为CGMCC No.20813。所述菌株ZB-155从辽宁省章古台实验林场樟子松人工林根际土壤中分离得到。经过形态特征观察及生理生化指标测定，同时结合分子鉴定，采用16S rRNA基因序列测定及进化树分析，鉴定分离菌株为双向伯克霍尔德氏(Burkholderia ambifaria)。

在本发明中，定量检测结果表明，所述菌株ZB-155产IAA的量达到43.15μg/ml；解磷效果定量检测结果表明，菌株ZB-155的解磷量为215.36mg/L。产IAA的能力以及解磷能力证明菌株ZB-155可以促进植物生长。同时植物种植中通过接种所述菌株ZB-155，与对照和病害组相比，接种菌株的苗木在苗高、地径、鲜重和干重方面具有显著优势，ZB-155接种处理可显著促进樟子松苗木生长和生物量积累。

在本发明中，经过平板拮抗实验和菌株发酵液抑菌实验表明，所述菌株ZB-155及其胞外代谢产物对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、污黑腐皮壳菌、松球壳孢菌、链格孢菌、平脐蠕孢等均具有理想的抑制率，表明所述菌株ZB-155抑菌谱广泛。菌株ZB-155的胞外代谢产物的制备方法优选为将所述菌株ZB-155在NA培养基中振荡培养70～75h后，离心，取上清液，过0.22μm滤膜除菌，得到无菌的胞外代谢产物。所述振荡培养的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm。所述离心的转速优选为10000～13000rpm，更优选为12000rpm。所述离心的时间优选为5～10min，更优选为7min。

在本发明中，菌株ZB-155在蛋白酶检测培养基、纤维素酶检测培养基上出现明显的透明圈，表明该菌株ZB-155可分泌蛋白酶和纤维素酶，具有一定的水解蛋白质和分解纤维素的能力。而纤维素酶和蛋白酶在对病原菌的抑制作用中具有重要的作用。

在本发明中，经过病菌的防治效果以及诱导抗性实验，结果表明，与对照组相比，菌株ZB-155在立枯病发生率和苗木存活率方面具有显著提高，对立枯病的相对防治效果为62.45％。同时通过见从苗木中抗性生理指标发现，在生物胁迫条件下，ZB-155可显著提高樟子松抗性生理指标(包括保护酶(SOD、POD、CAT)活性，脯氨酸和丙二醛含量、葡聚糖酶和几丁质酶活性)，来提高樟子松苗木的抗病性。

在本发明中，所述菌株ZB-155对植物根际土壤营养成分还具有改良作用，实验表明，同空白对照相比，ZB-155接种处理的樟子松根际土壤速效氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾均有提高，其中速效磷提高最多，同时对酸性磷酸酶和脲酶活性均有提高。

鉴于所述菌株ZB-155的上述功能特性，本发明提供了一种包含所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的产品。

在本发明中，所述产品优选包括微生物菌剂、土壤改良剂和微生物肥料。

在本发明中，所述产品优选包括双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155菌体和/或所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的发酵产物。所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的发酵产物的发酵方法，优选将所述菌株ZB-155在NA培养基中振荡培养70～75h后，得到发酵产物。本发明对所述NA培养基的配方不做具体限定，采用本领域所熟知的NA培养基配方即可。所述振荡培养的转速优选为160～200rpm，更优选为180rpm。本发明对所述菌剂、土壤改良剂和微生物肥料的制备方法不做具体限定，采用本领域所熟知的菌剂、土壤改良剂和微生物肥料的制备方法即可。

本发明提供了所述产品在植物种植中的应用。

在本发明中，所述植物种植中所述产品的使用方法，优选将所述产品施入待种植的土壤或浸泡植物种子或苗根的方法。所述产品不仅能促进植物生长，还能防治多种病害发生，而且具有调节土壤营养成分的作用。

本发明提供了所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在促进植物生长中的应用。所述促进植物生长优选包括苗高、地径、鲜重和干重。

所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在提高植物抗逆方面的应用。

在本发明中，所述抗逆优选包括抗植物病害。所述抗植物病害中的病害优选包括苗木立枯病、杨树烂皮病、松枯梢病、榛子叶枯病和榛子褐斑病。为了举例说明本发明所述菌株对真菌引起的上述多种病害具有防效，以立枯病为例加以说明，但并不能理解对本发明保护范围的限制。同时本发明实施例中，还通过抑菌实验证明所述菌株对上述病害的病原菌的抑制作用，因此，可以得到所述菌株对上述病原菌引起的病害同样具有较强的防效。在病原菌胁迫下，所述菌株ZB155通过提高樟子松主要生理指标，来提高樟子松苗木的抗病性。所述生理指标包括β-1,3-葡聚糖酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、苯丙氨酸酶活性。

本发明提供了所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155或所述抑菌剂在防治植物病害中的应用。所述病害的病原菌优选包括立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、污黑腐皮壳菌(Valsa sordida)、松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)、链格孢菌(Alternaria alternata)和/或平脐蠕孢(Bipolaris bicolor)。

在本发明中，所述植物优选包括针叶树。本发明对所述针叶树的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的针叶树的种类即可，例如松树、柏树、杉树等。本发明以樟子松为例进行实施，但不应该理解对本发明保护范围的限制。

下面结合实施例对本发明提供的一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所使用的主要材料和数据处理方法为：

1)供试林木病原菌：苗木立枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、杨树烂皮病病原菌污黑腐皮壳菌(Valsa sordida)、松枯梢病病原菌松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)、榛子叶枯病病原菌链格孢菌(Alternariaalternata)、榛子褐斑病病原菌平脐蠕孢(Bipolaris bicolor)，所有菌株保存于黑龙江省林业科学院森林有害生物防治实验室。

2)植物材料樟为樟子松1年生盆栽苗，将草炭土、蛭石和河沙按体积比2:1:1混合配制成育苗基质，121℃下高温高压灭菌2h，装入营养钵(15cm×13cm)中室温放置7天后进行播种。营养钵中播入催芽后的灭菌樟子松种子，每钵播30粒种子，上层覆盖2cm厚无菌基质，置于温室大棚中培养，待幼苗出土后，定苗至每钵15株，进行常规的日常管护。

3)供试培养基细菌活化保存培养基牛肉膏蛋白胨培养基(NB)、无机磷解磷培养基(NBRIP)检测解磷作用、酪蛋白琼脂培养基用于检测蛋白酶活性、R2A培养基用于检测菌株产IAA的检测。

4)数据处理采用Excel 2019进行初步分析，使用SPSS19.0统计学分析软件进行单因素方差分析，使用Origin 2019进行作图。

实施例1

菌株ZB-155分离鉴定

从辽宁省章古台实验林场樟子松人工林根际土壤中分离出的菌株ZB-155，进行鉴定，具体方法如下：

1)菌体形态、特征观察及生理生化指标测定：参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株ZB-155进行生理生化测定，描述菌落形态和特征。

菌株ZB-155在NA培养基上培养24h后可形成1～2mm的菌落，菌落中间无凸起，乳白色，表面光滑，有光泽，边缘整齐，不透明，不产生荧光(图1-A、图1-B)。菌体短杆状，革兰氏染色为阴性(图2)。

菌株ZB-155可厌氧生长，苯丙氨酸脱氢酶、淀粉酶、尿素酶、V-P实验、明胶液化实验均呈阳性，接触酶、硝酸盐还原实验、吲哚实验均呈阴性，可利用葡萄糖、甘露醇、木糖，不能利用蔗糖，在大于5％NaCl、4℃和大于41℃条件下均不能生长，结合菌株形态及染色结果，与伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的特征基本相符(表1)。

表1菌株ZB-155生理生化测定结果

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

菌株16S rRNA基因序列测定及进化树分析：将菌株ZB-155接种到NA培养基中，37℃，180r·min^-1振荡培养48h后，12000r·min^-1离心5min收集菌体，提取细菌基因组DNA，使用16S rRNA基因通用引物27F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAG-3’，SEQ ID NO:1)和1492R(5’-GGCGTCTGTACAAGGCCCGG-3’，SEQ ID NO:2)对基因组DNA进行PCR扩增，反应体系：2×TaqPCR Mastermix 25μL、10mmol·L^-1 27F 1μL、10mmol·L^-1 1492R 1μL、DNA模板1μL，加无菌ddH₂O至反应总体积50μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃30S，55℃30S，72℃1min，30个循环；72℃5min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，回收纯化的PCR产物进行测序，测序结果在NCBI上进行BlastN比对，并将序列提交到GenBank中获得基因登录号，将相似率较高模式菌株的16S rRNA基因序列用MEGA X软件构建系统发育树，进行菌株分类地位鉴定。

通过提取菌株MHBZ039基因组DNA，经过PCR产物序列测定，菌株ZB-155的16S rRNA基因PCR产物长度分别为1260bp，将16S rRNA基因片段(SEQ ID NO:3)与GenBank中的序列比对同源性高的模式菌株序列信息，利用MGEA X软件构建系统进化树(图3)，序列分析结果，菌株ZB-155与Burkholderia ambifaria AMMDT(KM000851)的同源性达到99.84％，在此基础上，结合菌落形态和生理生化指标，菌株ZB-155为双向伯克霍尔德氏菌(B.ambifaria)。

实施例2

根际细菌ZB-155林木病原菌抑菌谱活性测定

平板拮抗：将PDA平板背面过中心点划十字交叉线，将根际细菌ZB-155在NA培养基中发酵培养24h后，分别吸取50μl菌液点在十字交叉线上距中心点3.0cm的4个点上，25℃培养24后，将供试病原真菌接种于PDA培养基中心，以不接种细菌菌液处为对照处理，放入培养箱中25℃培养，当对照长满平板后，测量处理菌落直径，计算抑菌率。

酵液抑菌实验：将根际细菌ZB-155在NA培养基中震荡培养72h后，将发酵液移入50ml无菌离心管中，在12000r/min下离心7min后，取上清液，过0.22μm滤膜除菌，得到无菌的胞外代谢产物，将代谢产物按照50％比例加入PDA培养基中，倒平板，接种病原菌，以不加细菌胞外代谢产物的PDA平板为对照，每处理3次重复，25℃恒温培养箱中培养，待病原菌长满平板后，测定处理平板菌落直径，按平板拮抗实验方法计算抑菌率。

表2菌株ZB-155抑菌谱测定

注：不同字母代表显著性水平不同(P＜0.05)。

实施例3

根际细菌ZB-155产IAA及解磷活性测定

IAA定性检测：将ZB-155接种到含有200mg/L的L-色氨酸的R2A培养基中，恒温振荡培养箱28℃，180rpm振荡培养48h后，用无菌枪头吸取2ml菌液于无菌离心管中，加入等体积的Sackowchi’s显色剂后迅速充分混合，室温下避光放置30min，观察颜色变化。

IAA定量检测：精确称取IAA 10mg，先用少量无水乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100ml(浓度100μg/ml)，然后分别稀释成0、4、8、12、16、20、24μg/ml，取不同浓度1ml，分别加入4ml Sackowchi’s显色剂，室温下避光静置30min，在OD_535nm条件下测定OD值，绘制标准曲线。将培养的菌液和空白对照在12000rpm离心10min后，取上清液2ml加入等量显色液，室温避光静置30min后，取出立即在535nm条件下测定OD_535nm值，每个样品重复3次，也加入显色液的空白对照调零，对照标准曲线计算菌株分泌IAA的量。

采用Sackowchi’s比色法测定结果表明，在含有色氨酸的R2A菌液的比色反应变为红色，结果为阳性，说明菌株ZB-155具有产IAA的能力。在定量测定中，ZB-155产IAA的量均值达到43.15μg/ml，产IAA的能力证明菌株ZB-155可以促进植物生长。

菌株的解磷效果定性检测：将培养好的ZB-155菌液采用三点接种法，分别点接到无机磷解磷培养基(NBRIP)平板上，每个处理三个生物学重复，28℃黑暗条件下培养5d，观察解磷圈的有无，并测量解磷圈(D)和菌落直径(d)，计算D/d值。培养5d后菌株ZB-155的菌落直径均值为4.1mm，解磷圈直径均值为5.5mm，D/d的比值均值为1.34(图5)。

菌株的解磷效果定量检测：将培养好的ZB-155菌液(浓度10⁸CFU/ml)按照1％比例接种到100ml(250ml三角瓶)NBRIP液体培养基中，每处理3个生物学重复，在28℃、180rpm下振荡培养5d后，将培养的菌液和空白对照在12000rpm下离心10min年后，取上清液采用钼磷比色法测定发酵液中的有效磷含量，以不接菌的NBRIP液体培养基作为对照。发酵培养5d后，菌株ZB-155的解磷量均值为215.36mg/L。

实施例4

根际细菌ZB-155产纤维素酶、蛋白酶检测

纤维素酶检测：将将供试菌株采用三点接种的方法，接种在纤维素刚果红培养上(青岛海博)上，每个处理三个生物学重复，28℃静置培养5d，连续观察菌落周围透明圈的有无。

蛋白酶检测：将供试菌株采用三点接种的方法，接种在酪蛋白琼脂培养基(青岛海博)上，每个处理三个生物学重复，28℃静置培养5d，连续观察菌落周围透明圈的有无。

经检测，菌株ZB-155在蛋白酶检测培养基、纤维素酶检测培养基上出现明显的透明圈，表明该菌株可分泌蛋白酶和纤维素酶，具有一定的水解蛋白质和分解纤维素的能力(图6)。

实施例5

对立枯丝核菌的防治效果及诱导抗性

ZB-155接种菌剂制备：将菌株ZB-155接种到装有100ml R2A液体培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h后作为种子液，然后将种子液稀释到有效活菌数1×10⁸CFU/ml即为接种液体。

樟子松育苗：樟子松种子用0.5％高锰酸钾浸泡30min，用无菌水多次冲洗后，用湿润无菌纱布覆盖，25℃黑暗条件下催芽，每天用无菌水冲洗，5d后约30％的樟子松种子露白即催芽完成。将催芽的樟子松种子浸泡到ZB-155接种菌剂中，将浸泡2h的樟子松种子播入含有无菌培养基质(草炭土：蛭石：细沙＝2:1:1，体积比)营养钵(15cm×13cm)中，每钵30颗种子，上覆2cm厚无菌土，浇透水后放入大棚中培养，待幼苗出土后，定苗至每钵15株。进行常规的日常管护，每2d浇一次水(100ml/钵)，每周浇一次Hoagland营养液(100ml/钵)。

立枯丝核菌的胁迫接种：使用无菌打孔器(1.0cm)切取在PDA培养基上培养好得立枯丝核菌菌饼2片，接种到250ml的PD培养基中，25℃、150r/min振荡培养7后制备成菌丝液，将菌丝液与无菌栽培基质按照1:10(m:m)的比例混匀后制备成立枯丝核菌接种土。樟子松出苗30d后进行立枯丝核菌的接种，每个营养钵在表面覆盖接种土1cm，对照覆盖无菌栽培基质。

共四个接种处理方式：1)空白对照(CK)；2)ZB-155接种(ZB-155)；3)立枯丝核菌接种(SH)；4)ZB-155处理接种立枯丝核菌(ZB-155+SH)，每个处理20钵，300株樟子松苗木。

防治效果调查：立枯丝核菌接种15d后，调查立枯病发生情况，计算防治效果。

诱导抗性分析：立枯丝核菌接种15d后，进行樟子松苗木取样，测定抗性生理指标，包括保护酶(SOD、POD、CAT)活性，脯氨酸和丙二醛含量、葡聚糖酶和几丁质酶活性，采用南京建成试剂盒进行测定。

双向伯克霍尔德氏菌ZB-155接种可有效控制樟子松苗木立枯病的发生，立枯丝核菌接种15d后，立枯病发生率均值为30.27％，30d后苗木存活率均值为80.25％，对照处理立枯病发生率均值为75.33％，苗木存活率均值为35.25％，ZB-155对立枯病的相对防治效果均值为62.45％。

双向伯克霍尔德氏菌(B.ambifaria)ZB-155和立枯丝核菌接种可影响樟子松1年生苗主要生理指标，不同处理之间具有显著性差异(p<0.05)，同对照(CK)相比，ZB-155接种处理的樟子松苗木β-1,3-葡聚糖酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、苯丙氨酸酶活性均值分别提高22.62％、19.78％、96.03％和38.94％。接种立枯丝核菌后，同CK+SH处理相比，ZB-155+SH接种处理的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性均值分别提高40.13％、48.35％、14.16％、12.36％和149.64％，生物胁迫条件下，ZB-155可显著提高樟子松抗性生理指标，来提高樟子松苗木的抗病性。

表3不同接种处理对樟子松苗生理指标的影响

注：不同字母代表显著性水平不同(P＜0.05)。

实施例6

根际细菌ZB-155对樟子松1年生苗的促生作用

出苗90d后，每处理随机挖取30株樟子松苗木，测定苗木生长指标，采用直尺和游标卡尺分别测量苗高和地径。苗木取样后，用刷子小心清理掉根际泥土，用电子天平测定苗木鲜重后，在鼓风干燥箱中85℃烘干后称量苗木的干重。

同对照(CK)相比，ZB-155接种处理苗高、地径、鲜重和干重分别提高15.21％、15.83％、9.59％和20.61％，在立枯丝核菌胁迫条件下，同CK+SH相比，ZB-155+SH处理苗高、地径、鲜重和干重均值分别提高24.43％、10.15％、23.39％和17.42％。ZB-155接种处理可显著促进樟子松苗木生长和生物量积累。

表4根际细菌ZB-155对樟子松苗的促生实验

注：不同字母代表显著性水平不同(P＜0.05)。

实施例7

根际细菌ZB-155对樟子松1年生苗根际土壤养分的影响

出苗90d后，每一处理随机采集70株樟子松苗轻轻抖动根际将根际土样收集与无菌样品袋中，用2mm筛子过筛后放入装有冰袋的保温箱中带回实验室，自然风干后4℃冰箱保存。土壤有机质的测定用重铬酸钾外加热法，全氮的测定采用凯氏定氮仪测定，全磷采用钼锑抗比色法测定，速效磷采用双酸侵提钼锑抗比色法，速效钾采用NH₄OAc侵提火焰光度计法，全钾采用火焰光度计法测定，土壤pH用酸度计法。土壤蔗糖酶活性、过氧化氢酶活性、酸性磷酸酶活性、脲酶活性使用南京建成试剂盒测定。

由表5结果可知，双向伯克霍尔德氏菌ZB-155对樟子松苗根际土壤理化性状具有改良作用，不同处理之间存在显著性差异(P<0.05)，同空白对照相比，ZB-155接种处理的樟子松根际土壤速效氮、全磷、速效磷、全钾、速效钾均值分别提高57.57％、32.53％、103.84％、33.11％和23.52％，其中速效磷提高最多，达到了103.84％，证明ZB-155有效改善了樟子松根际土壤理化性状，促进樟子松苗木的生长。同空白对照相比，接种ZB-155后，樟子松根际土壤酶包括酸性磷酸酶和脲酶活性均值分别提高19.24％和19.84％。双向伯克霍尔德氏菌(B.ambifaria)ZB-155的使用对根际土壤的活性酶和养分循环起到了显著的促进作用。

表5不同处理对樟子松根际土壤养分和酶活性的影响

注：不同字母代表显著性水平不同(P＜0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黑龙江省森林保护研究所

<120> 一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcctacgg gaggcag 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgtctgta caaggcccgg 20

<210> 3

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Burkholderia ambifaria)

<400> 3

catgtcctgt agtgggggat agcccggcga aagccggatt aataccgcat acgatccatg 60

gatgaaagcg ggggaccttc gggcctcgcg ctatagggtt ggccgatggc tgattagcta 120

gttggtgggg taaaggccta ccaaggcgac gatcagtagc tggtctgaga ggacgaccag 180

ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgg 240

acaatgggcg aaagcctgat ccagcaatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta 300

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gaagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg 420

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ccccgggctc aacctgggaa ctgcattggt gactggcagg ctagagtatg gcagaggggg 540

gtagaattcc acgtgtagca gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaatacc gatggcgaag 600

gcagccccct gggccaatac tgacgctcat gcacgaaagc gtggggagca aacaggatta 660

gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactagt tgttggggat tcatttcctt 720

agtaacgtag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt acggtcgcaa gattaaaact 780

caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg tggattaatt cgatgcaacg 840

cgaaaaacct tacctaccct tgacatggtc ggaatcctgc tgagaggtgg gagtgctcga 900

aagagaaccg gcgcacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 960

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc cttagttgct acgcaagagc actctaagga 1020

gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttatg 1080

ggtagggctt cacacgtcat acaatggtcg gaacagaggg ttgccaaccc gcgaggggga 1140

gctaatccca gaaaaccgat cgtagtccgg attgcactct gcaactcgag tgcatgaagc 1200

tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac 1260

Claims

1.一株针叶树根际生防促生细菌双向伯克霍尔德氏 (Burkholderia ambifaria)菌株ZB-155，其特征在于，所述菌株ZB-155的保藏编号为CGMCC No .20813。

2.一种包含权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的产品。

3.根据权利要求2所述产品，其特征在于，所述产品包括微生物菌剂、土壤改良剂和微生物肥料。

4.权利要求2或3所述产品在樟子松种植中的应用。

5.权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在促进樟子松生长中的应用。

6.权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155在提高植物抗逆方面中的应用，所述植物为樟子松，所述抗逆为抗苗木立枯病。

7.一种包含权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155的抑菌剂。

8.权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌株ZB-155或权利要求7所述抑菌剂在抑制苗木病原菌中的应用；

所述苗木病原菌为立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、污黑腐皮壳菌(Valsa sordida)、松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)、链格孢菌(Alternaria alternata)和/或平脐蠕孢(Bipolaris bicolor)。