CN113046263A - 一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41-c8、菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41‑C8，该菌株于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCCNo.21585，该菌可以应用于解钾、固氮、解磷和促进植物生长，本发明还提供了一种包括氧化微杆菌41‑C8微生物菌剂及其制备方法。该菌株耐盐度为0～7％，最适耐盐度为3～5％，同时具有固氮、解有机磷和解钾等多种促生特性，利用氧化微杆菌41‑C8制备的菌液能在盐胁迫下显著提高白菜耐盐促生能力，减缓盐害现象，增加生物量，从而促进白菜生长的效果，有助于提高白菜的耐盐性，减少化学肥料的使用，该耐盐促生菌菌株及其菌液具有广泛的应用前景。

Description

一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41-C8、菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41-C8、菌剂及其应用。

背景技术

我国盐碱地总面积为9913万hm²，约占全世界盐碱地总面积的10％。土壤盐渍化给农业生产带来极大的障碍，盐胁迫容易导致作物失水、离子失衡、营养亏缺等,在世界范围内仍旧是影响作物产量和质量的主要因素之一,容易引起作物代谢紊乱如活性氧生成与清除的失衡、光合作用下降等,造成设施作物产量大幅降低和品质下降。盐胁迫影响植物的营养物质吸收,产生渗透胁迫,降低植物的光合作用,也会产生氧化胁迫,抑制植物的生长。我国人口众多，粮食需求日益高涨而耕地资源紧张，合理利用盐碱地提高粮食生产对保障我国粮食安全需求具有重要意义。如何改良和利用大面积盐渍化土地以及保护并提高重要的经济作物抵抗盐胁迫是当今国际社会亟待解决的重要科技问题。

植物促生菌能与植物建立共生关系，并在正常状态下或植物面临胁迫时促进其生长，合理使用根际促生菌是减轻盐胁迫危害的一种重要途径。不具有耐盐性的根际促生菌在自然条件下随盐度增加逐渐失去植物促生特征，开发利用耐盐植物促生菌是盐胁迫下增加作物产量的可行措施。现有技术对耐盐促生微生物的研究较少，缺乏耐盐促生微生物，尤其是缺乏有效的高耐盐促生微生物。本文在高盐胁迫下研究了氧化微杆菌41-C8对白菜种子萌发及幼苗生长过程中生理生化的影响，且氧化微杆菌41-C8具有较好的促生特性，能够稳定促进作物生长。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41-C8及其应用。

本发明第一个目的在于提供一种从东营市盐碱地土壤采集土样中分离的促生细菌——氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)41-C8，丰富了耐盐解钾促生的菌种资源，为研究开发促生菌菌剂奠定基础。

本发明第二个目的在于提供上述氧化微杆菌41-C8对解钾、固氮、解磷和促进植物生长的应用。

本发明第三个目的在于提供一种利用上述菌株41-C8生产的微生物菌剂。

本发明第四个目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第五个目的在于提供上述微生物菌剂对解钾、固氮、解磷和促进植物生长的应用。

本发明第六个目的在于提供上述微生物菌剂在盐胁迫中促进植物生长的应用。

本发明第七个目的在于提供上述菌株41-C8的筛选、鉴定方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一株耐盐解钾促生氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)菌株41-C8，该菌株于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.21585，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所述的菌株从盐碱地土壤中经过筛选获得，编号为41-C8，其能够溶有机磷、难溶性钾、固氮和促生。其形态特征为：呈革兰氏阳性，菌落为黄色、边缘整齐，中间隆起，表面光滑湿润，透明，直径为1～2mm。综合各项生理生化试验结果和分子生物学分析，该菌鉴定为氧化微杆菌。

本发明提供的上述的氧化微杆菌41-C8在如下任意一个或者两个以上方面的应用，例如解钾、固氮、解磷和促进植物生长。现有技术中并未公开氧化微杆菌应用于解钾、固氮、解磷和促进植物生长，该菌氧化微杆菌41-C8不同于公开的氧化微杆菌。通过功能性鉴定试验可以看出，氧化微杆菌41-C8能够溶有机磷、难溶性钾和固氮；同时，本发明氧化微杆菌41-C8在解钾试验中，其菌液、菌体和上清液均具有较高的解钾能力；本发明所述的氧化微杆菌菌株41-C8对NaCl有较宽的适应范围，在NaCl浓度达到6％情况下仍然可保持较高的菌体浓度，0～7％的盐浓度下均可生长，菌株41-C8的耐盐性最高可达6％，说明菌株41-C8能够耐受浓度为6％的NaCl含量；该菌株41-C8在浓度为0.5％NaCl的胁迫下能够提高白菜叶长、叶宽、叶片数及鲜重、干重，以及提高了MDA含量、游离脯氨酸的含量、SOD、POD和CAT的活性，表明菌株41-C8可以缓解盐胁迫对白菜幼苗造成的氧化胁迫，也为本发明的耐盐促生菌菌株在促生耐盐方面的作用提供了依据；该菌株41-C8对番茄在盐胁迫条件下也具有促生作用。

本发明还提供了一种微生物菌剂，包括上述的氧化微杆菌41-C8。所述氧化微杆菌41-C8的有效活菌数为0.5亿/g。

如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂的活性成分为氧化微杆菌41-C8的菌液、菌体和代谢上清液。

本发明还提供了一种微生物菌剂的制备方法，具体步骤包括：

(1)固体LB培养基制备；

(2)液体LB培养基制备；

(3)活化菌株：挑取在固体LB培养基平板耐盐促生菌菌株41-C8单菌落制备种子液，然后接种于液体LB培养基中，在温度27～29℃、转速120～180r/min的摇瓶中培养一定时间，待菌株生长至对数生长期时，使用无菌水稀释菌液，获得所述微生物菌剂。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，所述固体LB培养基包括以下组分及含量：葡萄糖10g/L、蛋白胨0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠2g/L、氯化钠1g/L和琼脂18g/L。该固体LB培养基是通过选取不同的碳源、氮源及无机盐，通过用不同配方的培养基对菌株进行摇瓶培养，筛选得出。

如上所述的微生物菌剂的制备方法，所述液体LB培养基包括以下组分及含量：葡萄糖10g/L、蛋白胨0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠2g/L和氯化钠1g/L。该液体LB培养基是通过选取不同的碳源、氮源及无机盐，通过用不同配方的培养基对菌株进行摇瓶培养，筛选得出。

上述固体LB培养基和液体LB培养基可以选择常规的LB培养基，但是本发明给出了优化后的发酵培养基，其与常规的培养基，能够有效提高发酵菌数，保证后期微生物菌剂中的有效活菌数，而且适合大量生产。

在本发明提供的微生物菌剂的基础上，还可以添加其他适宜的成分制备本发明所涉及的各种技术效果在内的微生物制剂。如上所述的微生物菌剂或由上述的制备方法制备的微生物菌剂在如下任意一个或者两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的微生物制剂中的应用，例如解钾、固氮、解磷和促进作物生长。

本发明提供了一种微生物菌剂在盐胁迫中促进植物生长的应用。

如上所述的应用，所述植物为白菜或者番茄。

本发明的有益效果是：

本发明从盐碱地土壤中筛选到耐盐促生菌氧化微杆菌菌株41-C8，对该菌株的遗传特性和生理生化特性进行测定，确定该菌株为氧化微杆菌41-C8(Microbacteriumoxydans)，并对其进行耐盐度分析、对盐胁迫条件下的白菜种子发芽及盆栽实验中对白菜的耐盐促生作用进行测试，结果表明，该菌株耐盐度为0～7％，最适耐盐度为3～5％，同时具有固氮、解有机磷和解钾等多种促生特性，利用氧化微杆菌41-C8制备的菌液能在盐胁迫下显著提高白菜耐盐促生能力，减缓盐害现象，增加生物量，从而促进白菜生长的效果，有助于提高白菜的耐盐性，减少化学肥料的使用，该耐盐促生菌菌株及其菌液具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的氧化微杆菌41-C8的菌落形态图；

图2为本发明提供的氧化微杆菌41-C8的功能定性鉴定图；

图3为本发明提供的氧化微杆菌41-C8的耐盐性分析；其中，图3A为氧化微杆菌41-C8不同盐浓度下的耐盐性效果图，图3B为氧化微杆菌41-C8耐盐性曲线；

图4为本发明提供的氧化微杆菌41-C8的16SrDNA基因序列扩增示意图；

图5为本发明提供的氧化微杆菌41-C8的基于16SrDNA基因序列构建的系统发育树；

图6为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发的影响；

图7为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发的发芽率及发芽势的影响；

图8为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下番茄种子萌发的影响；

图9为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下番茄种子萌发的发芽率及发芽势的影响；

图10为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对脯氨酸含量指标的影响；

图11为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对POD酶活性含量指标的影响；

图12为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对MDA含量指标的影响；

图13为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对SOD酶活性含量指标的影响；

图14为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对CAT酶活性含量指标的影响；

图15为本发明提供的氧化微杆菌41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发对氧自由基含量指标的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明中，氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)菌株41-C8或被简称为菌株41-C8。本发明所提供的氧化微杆菌可与有机肥混合施用，也可以单独施用，既可以作为底肥、基肥使用，也可以作为追肥使用。

实施例1菌株41-C8的分离筛选

从东营市盐碱地土壤采集土样，从中分离出不同的微生物，并将菌株通过平板划线保存于固体LB培养基平板上，待用。挑取菌落分别置于装有浓度为0.1％、0.3％、0.5％和0.7％不同的NaCl浓度的液体LB培养基三角瓶中进行摇瓶培养，于27℃～29℃120r/min培养2～3d，观察不同盐浓度下菌株的生产情况，并对筛选出的生长良好的菌株进行反复平板划线纯化，得到五株单一菌落的耐盐菌株，将该单一菌落命名为菌株41-C8。

实施例2菌株41-C8的功能定性鉴定

本实施例实验之前先将菌株41-C8进行摇瓶培养，活化扩繁，分别配制解钾、解磷及固氮固体培养基，准备好灭好菌的平板，培养基灭好菌之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到平板上，封好板放置27℃倒置培养，待有透明水解圈或者菌斑时，观察实验结果。如图2所示，本实施例的菌株41-C8能够溶有机磷、难溶性钾和固氮。有机磷培养基、无机磷培养基、解钾培养基和固氮培养基如下。

有机磷培养基：葡萄糖10g，NaCl 0.3g，MgSO₄ 0.3g，MnSO₄ 0.03g，CaCO₃ 5g,卵磷脂2g，琼脂18g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KCl 0.3g，FeSO₄ 0.03g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.5，121℃灭菌15min。

无机磷培养基：海博生物成品无机磷培养基，秤取32g培养基，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min。

解钾培养基：葡萄糖10g，Na₂HPO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.2g，CaCO₃ 5g，钾长石粉25g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃灭菌15min。

阿须贝固氮培养基：甘露醇10g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.2g，CaCO₃ 5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃灭菌15min。

解钾解磷评估标准：直径比＝透明圈直径/菌斑直径*100％；

固氮评估标准：测定菌斑直径。

实施例3菌株41-C8的菌液、菌体和上清液的解钾性

表1菌株41-C8的解钾性分析

不同处理	菌落直径(d)/cm	水解圈直径(D)/cm	溶钾指数(D/d)
				菌液	0.9	1.5	1.67
菌体	0.8	1	1.25
				上清液	0.7	0.9	1.29
灭菌菌液	-	-	-

提前准备好解钾固体培养基平板，对菌株41-C8进行进一步的解钾性分析，将菌株41-C8进行摇瓶培养，将菌液吸取至离心管，5000r/min进行离心两分钟，离心之后将上清液吸取至新的离心管中，剩下的菌体加入无菌水重悬。之后分别吸取1μL菌液、上清液、灭菌菌液及菌体悬液至准备好的解钾固体培养基中，放置27℃培养箱培养，至平板长出水解圈或者菌斑统计实验结果。

溶钾指数的指数的计算公式：溶钾指数＝水解圈直径/菌斑直径*100％

通过表1的结果显示，菌液、菌体和上清液都具有解钾性，初步得出菌株41-C8的代谢产物中含有具有溶钾作用的物质。

实施例4菌株41-C8的耐盐性测定

将已分离纯化的菌株41-C8的菌液分别转接相同量到不同盐浓度的液体培养基中，本实施例中，NaCl的质量浓度分别为2％、4％、6％、8％和10％，于温度27～29℃、转速120～180r/min条件下摇床培养一段时间，观察不同盐浓度下菌株的生长情况，测试菌浓度，确定耐盐促生菌菌株的耐盐度，22h后测其菌浓度(OD600)，以确定该菌株的耐盐程度，得到如图3A的耐盐性效果图和图3B所示的耐盐度曲线图。通过图3A和3B的结果显示，可见耐盐促生菌菌株41-C8对NaCl有较宽的适应范围，在盐浓度达到6％情况下仍然可保持较高的菌体浓度，0～7％的盐浓度下均可生长，菌株41-C8的耐盐性最高可达6％。

实施例5平板培养下不同盐浓度对菌株41-C8解钾性的影响

本实施例中，实验之前先将菌株41-C8进行摇瓶培养，活化扩繁，分别配制1％、2％、3％、4％、5％不同NaCl浓度的解钾固体培养基，准备好灭好菌的平板，培养基灭好菌之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到平板上，封好板放置27℃倒置培养，待有透明水解圈或者菌斑时，观察实验结果。

表2不同盐浓度对菌株41-C8的解钾性的影响

通过表2的结果显示，在盐浓度为1％或2％时，菌株41-C8具有较强的解钾性。

实施例6菌株41-C8对不同钾源解钾能力的研究

本实施例中，实验之前先将菌株41-C8进行摇瓶培养，活化扩繁，分别配制含有黑云母、钾长石、伊利土、白云母、高岭土、蒙脱土不同钾源的解钾固体培养基，准备好灭好菌的平板，培养基灭好菌之后倒板，待凝固之后，吸取菌液1μL点到平板上，封好板放置27℃倒置培养，待有透明水解圈或者菌斑时，观察实验结果。

如表3所示，利用黑云母、钾长石、伊利土、白云母、高岭土、蒙脱土六种钾源，探究菌株的41-C8对不同钾源的解钾能力，根据测定结果得出，菌株41-C8对黑云母的分解能力最强，其次对钾长石和伊利土的分解能力也很强。

表3菌株41-C8对不同矿物钾分解能力的测定

钾源	菌落直径(d)/cm	水解圈直径(D)/cm	溶钾指数(D/d)
				黑云母	0.1	0.4	4
钾长石	0.1	0.3	3
				伊利土	0.1	0.3	3
白云母	0.1	0.2	2
				高岭土	0.1	0.2	2
蒙脱土	0.1	0.2	2

实施例7菌株41-C8的鉴定

1.形态学鉴定

如图1所示，菌株41-C8呈革兰氏阳性，菌落为黄色，边缘整齐，中间隆起，表面光滑湿润，透明，直径为1～2mm。好氧，化能异养。革兰氏染色结果显示菌株41-C8为革兰氏阳性菌，杆状。

2.生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》，通过对耐盐促生菌菌株进行生理生化测定进行初步鉴定，鉴定结果显示：革兰氏阳性，吲哚反应阴性，伏-普实验反应阴性，甲基红反应阴性，硫化氢阴性，柠檬酸盐实验阴性。

根据上述鉴定结果，该耐盐促生菌菌株41-C8初步鉴定为氧化微杆菌。

3.分子生物学鉴定

如图4所示，将菌株41-C8提取DNA并作为模板，16SrDNA通用上游引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为1492R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，对16SrDNA核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定。16SrDNAPCR体系反应条件见表4。

表4 16S rDNA PCR体系反应条件

组分	使用量(μL)/管
		细菌组DNA	2
引物27f(10μmol/L)	1
		引物1492r(10μmol/L)	1
Taq DNA聚合酶	0.25
		dNTP(2.0mmol/L)	2
10×PCR buffer	2.5
		ddH<sub>2</sub>O	16.25
总体积	25

将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株16SrDNA核苷酸序列与GenBank基因库中微杆菌属中的Microbacterium oxydans的16srDNA序列同源度最高，同源率达到100％，如图5和序列表1所示；通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的微杆菌属的16SrDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，耐盐促生菌菌株41-C8 16S rDNA与Microbacterium oxydans同源性最高，因此可以初步判定该菌株41-C8为微杆菌属的氧化微杆菌。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为氧化微杆菌，命名为氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)41-C8，该菌株已于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21585。

实施例8菌株41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发的影响

菌株41-C8在盐胁迫中促进白菜种子萌发及幼苗生长的应用，包括以下步骤：

(1)白菜种子培养皿发芽实验：将未经处理过的白菜种子取适量放入培养皿中进行消毒灭菌，将挑选好的种子置于通风橱进行氯气消毒，在烧杯中放入50mL次氯酸钠和10mL氯化氢，关闭橱窗，消毒2h，消毒后放入超净工作台，通风，待用；

(2)耐盐促生菌菌液制备：将活化好的菌株41-C8菌液，用灭菌的无菌水进行稀释，分别稀释成10倍，10³倍，10⁵倍的菌液，待用；

(3)将已清洗好的白菜种子放入制备好的菌株41-C8菌液中浸泡一段时间，备用；

(4)准备适量培养皿，将吸水纸平铺在培养皿底层，盖好后灭菌待用；配置0.1％、0.3％、0.5％不同盐浓度的氯化钠溶液，灭菌后分别取2mL至培养皿中，没过吸水纸，做好标记，将用菌液浸泡的白菜种子取相同量50粒，分别用灭菌镊子夹入不同盐浓度的培养皿中，随后将培养皿放入25～27℃暗处培养一段时间，把只加无菌水培养的培养皿作为空白对照，把只用NaCl培养的白菜种子作为对照实验；

(5)记录白菜种子萌发结果，筛选出最佳盐浓度范围以及最佳菌液浓度。

结果显示：种子萌发一天后，拍照记录实验结果如图6所示，在盐浓度为0.3％和0.5％时，菌液稀释10³倍对白菜种子萌发促进作用最明显，说明耐盐促生菌菌株41-C8对白菜种子具有明显的耐盐促生作用。

(6)由上述结果得出，在盐浓度为0.3％和0.5％时，稀释10³菌液对白菜种子萌发的作用最明显，因此，选取0.5％盐浓度以及10³菌液进一步进行实验，以水处理白菜种子作为空白对照，0.5％浓度盐水处理白菜种子作为另一对照，以10³菌液处理种子作为实验组。记录白菜种子萌发的平均发芽率及平均发芽势，如表5和图7所示的耐盐促生菌菌株41-C8对白菜种子萌发生长的影响。

表5菌株41-C8对白菜种子萌发生长的影响

	空白对照(水)	对照实验	菌液+盐胁迫
				平均发芽率(％)	92.17±1.31	84.71±1.73	88.96±1.59
平均发芽势(％)	90.33±2.01	81.69±1.48	85.15±1.76

将未经处理过的白菜种子取适量放入培养皿中进行氯气消毒灭菌，备用；采用质量比为10：1营养土与蛭石混合得到盆栽基质，然后在115～120℃灭菌一段时间，冷却后等量装至穴盘中，三个穴盘设置空白对照组(无盐胁迫)，另外三个穴盘用等量浓度为0.5％的NaCl溶液浸湿盆栽基质作为对照，其它三个穴盘用浓度为0.5％的NaCl溶液浸湿盆栽基质并用制备的菌液浇灌作为实验组，每盆种入等量处理好的白菜种子。空白组用无菌水浇灌，盐加菌液组用耐盐促生菌菌株菌液混合浓度为0.5％NaCl溶液浇灌，盐胁迫组用浓度为0.5％NaCl溶液浇灌，每隔七天浇灌处理一次，其余时间都浇灌无菌水，出苗后，计算发芽率和出苗率，然后每盆保留3株幼苗，一个月后测定叶长、叶宽、叶片数、鲜重和干重等生长指标及氧自由基含量、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸的含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)生理指标，表6为耐盐促生菌菌株41-C8在盆栽实验中对白菜种苗生长的影响。通过表6可以看出耐盐促生菌菌株41-C8菌液加盐胁迫组的叶长、叶宽、叶片数及鲜重、干重均显著提高。

表6菌株41-C8在盆栽实验中对白菜种苗生长的影响

图10-图15为耐盐菌菌株41-C8对盐胁迫下白菜种子萌发抗逆指标的影响，通过图10-图15可以看出，通过检测菌株41-C8对盐胁迫下白菜幼苗氧代谢的相关生理指标，由结果可知，菌株41-C8能够显著降低0.5％NaCl胁迫下白菜幼苗体内氧自由基和MDA含量，提高其游离脯氨酸的含量以及SOD、POD和CAT的活性，表明菌株41-C8可以缓解盐胁迫对白菜幼苗造成的氧化胁迫，也为本发明的耐盐促生菌菌株在促生耐盐方面的作用提供了依据。

实施例9菌株41-C8对番茄种子萌发的影响

氧化微杆菌41-C8菌液对番茄种子萌发的影响，包括以下步骤：

(1)挑取在LB固体平板生长良好的耐盐促生菌菌株41-C8单菌落，接种于液体LB培养基中，在温度27～29℃、转速120～180r/min的摇瓶中培养一定时间，待菌株生长至对数生长期时，使用无菌水菌液10倍、10³倍、10⁵倍作为菌株菌液。

(2)耐盐促生菌菌液制备：将活化好的41-C8菌液，用灭菌的无菌水进行稀释，分别稀释成10倍，10³倍，10⁵倍的菌液，待用；

(3)将未经处理过的番茄种子取适量放入培养皿中进行消毒灭菌，将挑选好的种子置于通风橱进行氯气消毒，在烧杯中放入50mL次氯酸钠和10mL氯化氢，关闭橱窗，消毒2h,消毒后放入超净工作台，通风，待用；

(4)将已清洗好的番茄种子放入制备好的耐盐促生菌菌株菌液中浸泡一段时间，备用；

(5)准备适量培养皿，将吸水纸平铺在培养皿底层，盖好后灭菌待用；

(6)配置0.1％、0.3％、0.5％不同盐浓度的氯化钠溶液，灭菌后分别取2mL至步骤(4)的培养皿中，没过吸水纸，做好标记，将步骤(3)的番茄种子取相同量，分别用灭菌镊子夹入不同盐浓度的培养皿中，随后将培养皿放入25～27℃暗处培养一段时间，把只加无菌水培养的培养皿作为空白对照，把只用NaCl培养的番茄种子作为对照实验；

(5)记录番茄种子萌发结果，筛选出最佳盐浓度范围以及最佳菌液浓度。

结果显示：种子萌发三天后，拍照记录实验结果如图8所示，在盐浓度为0.3％和0.5％时，菌液稀释10³倍对番茄种子萌发促进作用最明显，说明耐盐促生菌菌株41-C8对番茄种子具有明显的耐盐促生作用。

(6)由上述结果得出，在盐浓度为0.3％时，稀释10³菌液对番茄种子萌发的作用最明显，因此，选取0.3％盐浓度以及10³菌液进一步进行实验，以水处理番茄种子作为空白对照，0.3％浓度盐水处理番茄种子作为另一对照，以10³菌液处理种子作为实验组。记录番茄种子萌发的平均发芽率及平均发芽势，如表7和图9所示的耐盐促生菌菌株41-C8对番茄种子萌发生长的影响。

表7菌株41-C8对番茄种子萌发生长的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛农业大学

施可丰化工股份有限公司

<120> 一株耐盐解钾促生氧化微杆菌41-C8、菌剂及其应用

<141> 2021-03-09

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> 16S rDNA of Microbacterium oxydans

<400> 1

cgggggcggc ttaccatgca gtcgaacggt gaagcagagc ttgctctgtg gatcagtggc 60

gaacgggtga gtaacacgtg agcaacctgc ccctgactct gggataagcg ctggaaacgg 120

cgtctaatac tggatatgtg atgtgaccgc atggtctgcg tctggaaaga atttcggttg 180

gggatgggct cgcggcctat cagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgtcgacg 240

ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300

cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag caacgccgcg 360

tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tcttttagca gggaagaagc gaaagtgacg 420

gtacctgcag aaaaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg 480

caagcgttat ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc gcgtctgctg 540

tgaaatccgg aggctcaacc tccggcctgc agtgggtacg ggcagactag agtgcggtag 600

gggagattgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcacgagg aacaccgatg 660

gcgaaggcag atctctgggc cgtaactgac gctgaggagc gaaagggtgg ggagcaaaca 720

ggcttagata ccctggtagt ccaccccgta aacgttggga actagttgtg gggtccattc 780

cacggattcc gtgacgcagc taacgcatta agttccccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gctaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg cggagcatgc ggattaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt accaaggctt gacatatacg agaacgggcc agaaatggtc 960

aactctttgg acactcgtaa acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttctat gttgccagca cgtaatggtg 1080

ggaactcatg ggatactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1140

catgcccctt atgtcttggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa gggctgcaat 1200

accgcgaggt ggagcgaatc ccaaaaagcc ggtcccagtt cggattgagg tctgcaactc 1260

gacctcatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt 1320

cccgggtctt gtacacaccg cccgtcaagt catgaaagtc ggtaacacct gaagccggtg 1380

gcctaaccct tgtggaggag ccgtcgaagg gggatcgt 1418

Claims (10)

1.一株耐盐解钾促生氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)41-C8，其特征在于，该菌株于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.21585。

2.一种如权利要求1所述的氧化微杆菌41-C8在如下任意一个或者两个以上方面的应用，其特征在于，解钾、固氮、解磷和促进植物生长。

3.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的氧化微杆菌41-C8。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的活性成分为氧化微杆菌41-C8的菌液、菌体和代谢上清液。

5.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)固体LB培养基制备；

(2)液体LB培养基制备；

(3)活化菌株：挑取在固体LB培养基平板耐盐促生菌菌株41-C8单菌落制备种子液，然后接种于液体LB培养基中，在温度27～29℃、转速120～180r/min的摇瓶中培养一定时间，待菌株生长至对数生长期时，使用无菌水稀释菌液，获得所述微生物菌剂。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述固体LB培养基包括以下组分及含量：葡萄糖10g/L、蛋白胨0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠2g/L、氯化钠1g/L和琼脂18g/L。

7.根据权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体LB培养基包括以下组分及含量：葡萄糖10g/L、蛋白胨0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钠2g/L和氯化钠1g/L。

8.如权利要求3或者4所述的微生物菌剂或由权利要求5-7任意一项所述的制备方法制备的微生物菌剂在如下任意一个或者两个以上方面中的应用和/或在制备如下任意一个或两个以上方面的微生物制剂中的应用，其特征在于，解钾、固氮、解磷和促进作物生长。

9.根据权利要求3所述的微生物菌剂在盐胁迫中促进植物生长的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为白菜或者番茄。

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