CN110964666B - 一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌j12 - Google Patents
一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌j12 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12，属于微生物技术领域。该内生真菌J12的分类命名为：Pseudofusicoccum violaceum，已于2019年11月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC NO.18815。该菌株是从木麻黄的茎部中分离纯化得到的，能显著促进木麻黄苗高、地径的增长。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12。
背景技术
磷元素参与了植物细胞大分子物质的构建、光合代谢且具有提高植物抗逆性等作用，是植物生长发育过程中必不可少的营养元素之一。现有研究表明，我国占耕地面积74%的土壤存在缺磷现象，磷素匮乏成为限制我国植物生产力的一大因素。在南方沿海沙地，因土壤大部分磷素与钙、铁离子易结合形成难溶性磷酸盐，土壤缺磷现象则更为严重。但已有研究报道，在磷素匮乏的情况下，植物能够通过生理生化及其形态的调整来适应供磷环境的变化。
缺磷条件下，植物最明显的变化为形态学变化，而根系形态变化是植物适应缺磷环境下的重要机制。植物通过根系形态的变化来提升活化与吸收环境养分的能力。磷素在土壤中移动性小，植物通常以吸收根际表面土壤磷素来补充生长发育所需营养物质，因此，易造成根际土壤磷的亏缺。在长期磷素缺失的情况下，植物根系通常会通过增加根长、根粗、根表面积、体积及根毛数量来充分有效吸收土壤中的磷元素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能促进低磷环境下木麻黄苗高、地径增长的内生真菌。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12，该内生真菌J12的分类命名为：Pseudofusicoccumviolaceum，已于2019年 11月20 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18815。
内生真菌J12在土豆葡萄糖培养基（PDA培养基）上培养时，初期菌落成灰白色，气生菌丝茂盛，培养后期菌落颜色开始变深，逐渐呈蓝灰色至黑色。上述一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12应用于低磷环境下木麻黄苗木的种植。
本发明提供的内生真菌J12菌株是从木麻黄的茎部分离纯化得到的，其可制备成菌液，通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于低磷环境下木麻黄苗木的种植。
所述菌液的制备方法为：将内生真菌J12菌株接入液体培养基中，摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释至5.5×106个•L-1，即得。所述液体培养基配方为：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
本发明的优点在于：本发明所得菌株能够缓解磷胁迫条件对植株磷吸收的制约，能够在低磷环境下促进木麻黄幼苗苗高、地径的增长。
附图说明：
图1内生真菌J12菌丝、菌落图。
图2无磷条件下木麻黄幼苗根系扫描图。第一行代表侵染J12菌株的幼苗根系；第二行代表未侵染J12菌株对照组的幼苗根系；3列代表3个重复。
图3低磷条件下木麻黄幼苗根系扫描图。第一行代表侵染J12菌株的幼苗根系；第二行代表未侵染J12菌株对照组的幼苗根系；3列代表3个重复。
图4正常供磷条件下木麻黄幼苗根系扫描图。第一行代表侵染J12菌株的幼苗根系；第二行代表未侵染J12菌株对照组的幼苗根系；3列代表3个重复。
图5高磷条件下木麻黄幼苗根系扫描图。第一行代表侵染J12菌株的幼苗根系；第二行代表未侵染J12菌株对照组的幼苗根系；3列代表3个重复。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
例1 木麻黄内生真菌的分离
1. 主要仪器设备
超净工作台SW-CJ-1FD、恒温培养箱HH•B11-II、恒温培养振荡器zhwy-211B、万分之一天平AR1140、全自动立式灭菌器LMQ.C-4060、超纯水机P60-CW等。
2. 主要试剂和培养基
试剂：15%次氯酸钠、75%无水乙醇、引物PAGE 11-59bp OD 1-2、DNA电泳loadingbuffer、GoodViewTM 核酸染料、2×Tap PCR MasterMix、真菌DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒。
培养基：（1）改良马丁琼脂培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，琼脂15.0g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
（2）改良马丁液体培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
（3）磷酸三钙无机磷培养基（NBRIP）：葡萄糖（C6H12O6•H2O）10.0 g，硫酸铵（(NH4)2SO4）0.5 g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.3 g，氯化钠（NaCl）0.3 g，氯化钾（KCl）0.3 g，硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）0.03 g，硫酸锰（MnSO4•4H2O）0.03 g，磷酸三钙（Ca3(PO4)2）5.0 g，琼脂18.0g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0～7.5。
3. 内生真菌的分离
（1）采用组织分离法，将木麻黄的茎经流水冲洗干净阴干后于超净台内进行组织表面消毒，其操作流程为：75%无水乙醇消毒30s→无菌水清洗2~3遍→10%次氯酸钠浸泡消毒7min→无菌水清洗2遍。将消毒后的茎用无菌刀片切去韧皮部再切成2mm×2mm大小，置于改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温避光培养。
（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的改良马丁琼脂培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。
4. 内生真菌的纯化
待平板培养基上的茎段组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的马丁琼脂培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入斜面培养基，于4℃保存。
5. 内生真菌的筛选
（1）平板初筛：采用三点接种法，将于改良马丁琼脂培养基上活化后的菌株接种于NBRIP培养基，28℃恒温培养7d。每个菌株三个重复，根据平板内透明圈的大小初步筛选具有解磷能力的菌株。
（2）摇瓶复筛：于100ml三角瓶内加入40ml NBRIP液体培养基（不含琼脂），高温（115℃、20min）灭菌备用。将于改良马丁琼脂培养基上活化后的初筛所得具有解磷能力的菌株接种于NBRIP液体培养基，摇床培养7d（28℃、180r min-1）。用无菌移液器吸取2 ml菌液于离心管离心10min（4℃、10000r min-1），取上清液1ml用钼锑抗比色法测定菌液内有效P含量，得到目标菌株J12。每个菌株3个重复，以不接菌的NBRIP液体培养基为对照。
6. 内生真菌的DNA提取和鉴定
（1）菌株总DNA的提取
将复筛所得目标J12菌株用改良马丁琼脂培养基活化后，采用OMEGA 基因组DNA提取试剂盒（Fungal DNA Kit 50）提取菌株的总DNA。
（2）菌株18S rDNA的PCR扩增
利用真菌18S rDNA通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇），PCR反应条件为预变性94℃ 5min，退火55℃ 30s，延伸72℃1min，共35个循环，最后延伸72℃ 10min。
PCR扩增反应采用50μl的反应体系，包括ddH2O 40.5μl，PCR Buffer（10x，Mg+plus）5μl，dNTP（2.5mM）1μl，ITS1（20μM）1μl，ITS4（20μM）1μl，DNA1μl，Taq polymerase(5U/μl)0.5μl。PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后交由公司进行DNA测序。
（3）菌株18S rDNA序列分析
将所得ITS rDNA序列（SEQ ID NO.1）在NCBI数据库进行同源性序列对比分析，选取与Genbank中同源性为99%以上的序列，初步确定目标菌株为Pseudofusicoccum violaceum。
实施例2
菌液制备：将筛选后的内生真菌（J12）于马铃薯葡萄糖琼脂培养基28℃培养一周，随即接入60 mL马铃薯葡萄糖液体培养基，于恒温摇床震荡培养72 h (28℃，160 r·min-1)，后与40 mL无菌水混合稀释，稀释后菌液浓度为8.75×105 cfu/mL，后续实验接菌均采用该浓度与剂量。
本实验采用土培盆栽实验，选取来自同一母树小枝水培育成的一年生短枝木麻黄进行幼苗土培盆栽实验，苗木由福建省惠安县赤湖防护林场提供，盆栽用土为黄心土与沙土3：1比例混匀 (土壤养分含量见表1)，甲醛消毒液（15 mL分析纯甲醛加水50倍配成的稀释液）消毒之后，于2018年5月21日，选取长势一致的木麻黄幼苗进行移栽，每盆放入等量混匀土壤2.5 Kg，将盆栽幼苗置于温室大棚内，缓苗一个月，于2018年6月21日，参照侯娇娇[1]菌液浇灌回接内生真菌的方法，连续三天对幼苗根际土壤、枝条进行内生真菌侵染实验，期间每间隔30d对幼苗补增一次内生真菌侵染直至实验结束，每个处理四个重复，本实验以无菌水浇灌为对照处理。整个实验处理于温室大棚内进行，实验期间进行正常的苗木管理，但不修剪。封闭花盆底部排水孔，保证幼苗生长所需水分但避免养分流失，后期不对幼苗进行氮、钾肥料及其他微量元素补充。
表1土壤养分底值
低磷胁迫实验：基于前期对滨海沙地不同林龄土壤养分含量测定以及相关资料文献，考虑自然林地土壤养分循环，凋落物养分归还以及实验中盆栽土壤养分流失现象，以KH2PO4为磷源设计了无磷处理 (0 mg/Kg)、低磷处理 (9 mg/Kg)、正常供磷 (18 mg/Kg)、高磷处理 (27 mg/Kg) 四个磷水平处理，每个处理四个重复。于2018年7月6日开始进行不同供磷水平实验，每次500 ml，连续5天对盆栽幼苗进行供磷，以逐渐达到供磷水平，分别于实验开始15d，30d，45d，60d，75d，90d取样进行各项指标测定。
根系形态的测定：
于实验处理90d后，将幼苗根系洗净放入透明托盘，注入3-6 ml水，以避免根系缠绕，应用扫描仪 (10000XL，EPSON Inc.，北京) 提取根系图像，应用WinRhizo TM 2009(Regent Instruments Canda Inc.) 软件对扫描图像进行结构与形态分析。
苗高和地径的测定：
于实验处理0d，15d，30d，45d，60d，75d，90d，利用游标卡尺测定幼苗地径，钢尺测定幼苗苗高。
生物量的测定：
于实验处理90d后，将实验幼苗地上地下部分分离且清洗干净，装入信封袋标记，称其鲜重，置于105 ℃烘箱杀青，后75 ℃烘干至恒重，称其干重。本实验根冠比公式为：根冠比=地下部分干物质质量/地上部分干物质质量。
实验结果见图1-图5、表2-表5。
表2不同磷环境下内生真菌感染对木麻黄幼苗根表面积和根系总长的影响
注：不同大写字母表示同一供磷水平下不同处理水平上差异显著 (Duncanetest, P＜0.05)，不同小写字母表示同一处理水平下不同供磷水平上差异显著 (Duncantest, P＜0.05)。
表3不同磷环境下内生真菌感染对木麻黄幼苗苗高的影响
注：不同小写字母表示同一供磷水平下不同处理之间的差异显著 (P＜0. 05)；生长幅度以相邻两次测量值得增长百分比表示，共计6次生长幅度，分别以1、2、3、4、5、6表示。
表4不同磷环境下内生真菌感染对木麻黄幼苗地径的影响
注：不同小写字母表示同一供磷水平下不同处理之间的差异显著 (P＜0. 05)；生长幅度以相邻两次测量值得增长百分比表示，共计6次生长幅度，分别以1、2、3、4、5、6表示。
表5不同磷环境下内生真菌感染对木麻黄幼苗生物量的影响
注：不同小写字母表示同一供磷水平下不同处理之间的差异显著 (P＜0. 05)
由实验结果可见：
表2结果表明：侵染内生真菌能够促进木麻黄幼苗根系生长。低磷处理下，J12菌株能显著 (P＜0.05) 提升幼苗根系总长，较CK增长了44.7%；随着供磷水平的上升，侵染J12菌株的幼苗在正常供磷下根系总长显著 (P＜0.05) 高于CK处理，较CK提升了84.1%。不同供磷水平下，内生真菌对木麻黄幼苗根系总长的影响也存在差异，侵染内生真菌的幼苗根系总长总体逐渐减少。侵染J12菌株的木麻黄幼苗随着供磷水平的增加，正常供磷下显著(P＜0.05) 高于其它处理。
侵染内生真菌能够促进木麻黄幼苗根系生长，无磷处理下，侵染J12菌株的幼苗根系表面积均显著 (P＜0.05) 高于CK，较CK增长了114.9%；低磷处理下，侵染J12菌株的幼苗根系表面积较CK显著 (P＜0.05) 增长了68%；正常供磷下，侵染J12菌株的幼苗根系表面积显著 (P＜0.05) 高于CK，且根系表面积最大，较CK增长了61.9%。不同供磷水平下，同一内生真菌对木麻黄幼苗根系表面积的影响也存在差异，侵染J12菌株的木麻黄幼苗在无磷和高磷下与低磷水平差异显著 (P＜0.05)。
表3结果表明：不同供磷水平下，木麻黄幼苗苗高都有一定程度的生长。无磷处理下，整个生长期间，J12菌株幼苗与CK幼苗苗高有显著差异 (P＜0.05)，且幼苗苗高显著 (P＜0.05) 高于CK。低磷处理下，侵染J12菌株的木麻黄幼苗苗高显著 (P＜0.05) 高于CK处理。正常供磷时，J12菌株幼苗苗高相较于CK表现出无磷处理下的显著变化趋势。高磷处理下， J12菌株幼苗苗高同样表现出显著 (P＜0.05) 差异于CK的变化趋势。不同供磷水平下，幼苗的生长幅度在不同处理时间不同，其中，无磷处理下，J12菌株幼苗生长幅度高于CK，最高生长幅度为15.5%和，侵染内生真菌的幼苗生长幅度在处理前期均表现出较好的趋势，低磷处理下，J12菌株幼苗生长幅度较高；正常供磷下，J12菌株在处理前期明显增长，增幅最高达至14.5%，随后增幅逐渐降低；高磷处理时，J12菌株幼苗生长幅度增幅明显，侵染内生真菌的苗高增幅最高达到10.2% (J12)。
表4结果表明：不同供磷水平下，木麻黄幼苗地径都有一定程度的生长。无磷和正常供磷下，整个处理期间J12幼苗地径显著 (P＜0.05) 差异于CK处理。不同供磷水平下，各处理幼苗的地径生长幅度在不同处理时间不同，四种供磷水平下，未染菌幼苗地径生长幅度变化平缓，而侵染内生真菌的幼苗地径生长幅度均高于CK处理，且随着供磷水平的上升，地径生长幅度不断提升。低磷处理下，侵染内生真菌的幼苗地径的生长幅度最高达到4.8%(J12)；无磷处理下，侵染内生真菌的幼苗地径生长幅度最高达到4.9% (J12)；正常供磷下，侵染内生真菌的幼苗地径生长幅度最高达到5.4% (J12)；高磷处理下，侵染内生真菌(J12)的幼苗地径生长幅度最高达到3.6% (J12)。
表5结果表明：不同供磷处理下，侵染内生真菌对木麻黄幼苗生物量和根冠比影响不同。对比接种内生真菌的幼苗生物量差异，在无磷处理下，J12幼苗地上部分鲜重和干重，J12幼苗地下部分鲜重，J12幼苗地下部分干重与CK均存在显著性差异 (P＜0.05)。低磷处理下，J12幼苗地下鲜重相较于CK均存在显著差异性 (P＜0.05)。正常供磷时，J12处理的木麻黄幼苗全株鲜重、地上干重均显著 (P＜0.05) 高于CK。高磷处理时，J12幼苗整株鲜重与地下干重较CK处理存均在显著差异 (P＜0.05)。
不同供磷水平下，侵染同一内生真菌对木麻黄幼苗根冠比的影响不同。低磷处理下，J12菌株内生真菌的幼苗根冠比较CK增加了15.8%；高磷处理下J12菌株幼苗根冠比较CK增加了9.5%，但与CK差异不显著。
由此表明，菌株J12能够提升木麻黄幼苗在低磷环境下对磷素的吸收能力，主要表现为能显著促进幼苗根系形态的变化、促进苗高地径的增长以及地上、地下部分生物量的分配，从而适应低磷环境的变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
参考文献：
[1]侯姣姣. 内生真菌对国槐与侧柏幼苗促生作用的研究[D].西北农林科技大学,2016.。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 589
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
cttttcgtag ggtgaacctg cggaaggatc attaccgagt tttgggtctc ttcaccgagc 60
ccactctcca accctttgtg tacctacctc tgttgctttg gcgggccgcg gttctccgcg 120
gccggccccc tagccggggc tggcctgcgc ccgccagagg accacaaaac tccagtcagt 180
gaactttgct gtctgatata aattcaataa actaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 240
tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 300
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccctttggta ttccgaaggg catgcctgtt 360
cgagcgtcat tacacccctc aagctctgct tggtattggg cggcgtcctc tccggacgcg 420
cctcaaagac ctcggcggtg gcgtcttgcc tcaagcgtag tagaaaacac ctcgctttgg 480
aggacgggac gaccgctcgc cggacgaacc tttgaattca ttttcctagg ttgacctcgg 540
atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 589
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> ITS1
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> ITS4
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (3)
1.一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12，其特征在于：所述内生真菌J12的分类命名为Pseudofusicoccum violaceum，已于2019年11 月 20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为 CGMCC NO.18815。
2.如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进木麻黄生长的内生真菌J12在低磷环境下木麻黄苗木种植中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将内生真菌J12的菌液通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式用于低磷环境下木麻黄苗木的种植。
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