CN109439590B - 一株决明属根瘤菌wys3r1 及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株根瘤菌WYS3R1及其应用，属于微生物技术领域。该菌株系是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR检测nodA gene，并经16S rDNA分子生物学鉴定所得，确定为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的新菌株系，并命名为武圆1号。于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018190。本发明的根瘤菌WYS3R1通过实验室盆栽回接试验证明其具有高效结瘤和固氮能力强的特性，接种该根瘤菌能够显著提高决明属牧草的根瘤数、根瘤固氮效率、生物量和植株氮含量，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。

Description

一株决明属根瘤菌WYS3R1 及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株决明属根瘤菌 WYS3R1 及其应用。

背景技术

我国约有 5690 万 hm²酸性土壤，占总耕地面积42.2%以上。近年来，随着大量化学氮肥的施用，土壤酸化日趋严重。我国酸性土壤主要集中在长江以南地区，该地区光、热、水等资源丰富，但土壤瘦瘠、粘重、pH 值低及养分有效性低，严重制约了该地区农业的快速发展。在生产上，往往通过施用大量化肥来提高作物产量。但是大量化肥的投入不仅会导致土壤板结及进一步酸化，而且还会造成水体富营养化和地下水的污染，严重破坏生态环境。

通过种植豆科植物结合根瘤菌接种技术，来改良土壤、提高土壤肥力是目前较为认可的一种途径。豆科植物能与根瘤菌结合形成互利互惠的共生关系。根瘤菌从宿主植物得到生长所需的碳水化合物及其他养分，而宿主植物则从根瘤菌生物固氮过程中获取氮素营养，以达到提高农作物产量和降低化肥使用量的效果，进而在减少水土污染的同时保持农业的可持续发展。

决明属植物(Chamaecrista spp. Greene.)是热带、亚热带地区重要的豆科植物，包括乔木、灌木和草本等三类。圆叶决明(Chamaecrista rotundifolia (Pers.) Greene)原产于澳大利亚，是决明属半直立型多年生豆科草本植物，具有固氮效率高、耐贫瘠、生物量较大、花色艳丽，特别适应酸性土壤等特性。1996 年，福建省农业科学院从澳大利亚牧草种质资源中心引进圆叶决明，并将其作为改良酸性土壤的豆科绿肥型牧草，在福建、广东和广西等酸性土壤地区推广种植。但是，圆叶决明在自然条件下结瘤慢且少、固氮效率较低，严重影响其种植及推广应用。因此，为提高圆叶决明的结瘤率和固氮效率，急需筛选出结瘤率高和固氮能力强的根瘤菌菌株，以提高决明属牧草的固氮效率，进而达到培肥地力和改善生态环境的效果。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株决明属牧草根瘤菌 WYS3R1，该菌株的分类命名为根瘤菌（Bradyrhizobiumsp.）WYS3R1，是慢生根瘤菌属的新菌株系，于 2018 年 4 月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2018190，保藏地址为：武汉大学。具有结瘤率高和固氮能力强的特点。

本发明的另一个目的是将上述根瘤菌WYS3R1 应用在豆科决明属植物共生固氮中，通过提高圆叶决明的生物固氮能力，促进其生长，达到决明生产中减肥增效的目的。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案来实现的：

1 根瘤菌菌株的分离和纯化

1）取圆叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分。

2）放入95%（w/v）的酒精中处理 3~5 分钟，再放入0.1%（w/v） HgCl₂ 中，灭菌 3~5分钟，取出后用无菌水冲洗 5~6 次。

3）在火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向 YMA 培养基表面划线，倒置后在 28℃ 下培养。YMA 培养基的配方如表 1 所示：

表1 YMA（Yeast Mannitol Agar）培养基配方

4）待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，加 1 mL 无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3天(d)之后观察菌落情况，一直观察到15d (慢生根瘤菌需7~15d出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。

5）待长出单克隆菌体后，根据以下两个方面判断其是否为根瘤菌：

①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养 3~5 d 菌落直径达 2~4 mm 为快生型根瘤菌，培养 7~10 d 菌落直径为 1 mm 则为慢生型根瘤菌。

②nodA gene 的 PCR 检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行 nodA gene PCR 检测，引物分别为 nodA-F 和 nodA-R，正向引物 SEQ ID NO.1：nodA-F 5’-TGCRGTGGARDCTRYGCTGGGAAA-3’；反向引物 SEQ ID NO.2： nodA-R 5’-GNCCGTCRTCRAASGTCARGTA-3’。酶选用 2×starMix，分别用根瘤菌BXYD3的基因组 DNA 和水为模板做阳性对照及阴性对照。nodA gene 长度约 666b p，运用电泳成像技术观察其在666 bp处是否具有条带，具有条带的菌落为根瘤菌。其 PCR 反应体系如表2：

表2 nodA gene 2×starMix 酶反应体系

反应条件：94℃ 5 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）×35 cycle；70℃ 5min。

2 根瘤菌WYS3R1 的性质

1) 形态特征

该菌株在菌落形态上，为慢生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在 YMA 平板上生长 5~7 d 后的直径为 0.8~2.0 mm(附图1)。

2) 培养特性

该菌的最适生长条件为：pH＝7.0，温度 28℃，转速 180 r/min，可利甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源。

3) 基因特性

经 nodA gene PCR、电泳成像检测，在约 666 bp 处具有较亮条带(附图 2)。

4) 功能特性

根瘤菌WYS3R1 具有结瘤率高和固氮能力强等特点。菌体被释放到自然环境中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而丰富了土壤间根瘤菌的群体多样性，对决明属牧草的结瘤固氮具有明显的促进作用。

3 根瘤菌WYS3R1 的 16S rDNA分子生物学鉴定

为鉴定根瘤菌菌株的系统发育地位，对所分离到的根瘤菌菌株的 16S rDNA进行PCR 特异性扩增。测序正向引物 SEQ ID NO.3：V4V5515-F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；测序反向引物 SEQ ID NO.4：V4V5907-R 5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’；测序所得根瘤菌WYS3R1 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO.5 所示；其 PCR 反应体系如表3：

表3 16S rDNA2×starMix 酶反应体系

反应条件：95℃ 5 min；（95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 50s）×44 cycle；70℃ 5min。

从 NCBI(GenBank)数据库中获取 13 个参比菌株序列，运用软件 BioEdit 和MEGA6 对分离菌株和参比菌株的 16S rDNA 部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树。从而确定根瘤菌WYS3R1 为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系(附图 3)，并命名为武圆 1 号。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的根瘤菌WYS3R1 具有结瘤率高和固氮能力强的特性，回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌30 d 分别提高圆叶决明鲜重和干重283.55wt%和338.57wt%，可用于实际生产；2)圆叶决明接种本发明的根瘤菌WYS3R1，极显著地提高了植株全氮含量(P<0.01)，从而达到促进圆叶决明植株生长和培肥地力的目的；3)本发明的根瘤菌WYS3R1 适用于南方酸性土壤地区，能作为圆叶决明常规栽培的重要措施之一。

附图说明

图 1 根瘤菌WYS3R1在 YMA 培养基上的菌落形态；

图 2 根瘤菌WYS3R1 经 nodA gene PCR、电泳成像检测所成图像；其中，+代表用根瘤菌 BXYD3 的 DNA 做阳性对照，-表示用水做阴性对照。

图 3 根瘤菌WYS3R1 的 16S rDNA 部分序列分析系统发育树；其中，分支上的数字表示可信度；括号内容表示在Gene bank 中的登录号；比例尺表示100个核苷酸里有2个替换。

图 4根瘤菌WYS3R1 蛭石回接效果图；CK：空白对照。

图 5 接种根瘤菌 WYS3R1 30 d 后圆叶决明结瘤数及根瘤固氮酶活性；其中，A：圆叶决明结瘤数；B：圆叶决明根瘤固氮酶活性；CK：空白对照。

图 6 接种根瘤菌 WYS3R1 30 d 后对圆叶决明生长的影响；其中，A：圆叶决明鲜重；B：圆叶决明干重；C：圆叶决明株高；D：圆叶决明SPAD值；E：圆叶决明植株含氮量； CK：空白对照；*：0.01<P<0.05，**：0.001<P<0.01，***：P<0.001。

具体实施方式

实施例1 根瘤菌WYS3R1 的分离和纯化

1 根瘤菌的分离

取圆叶决明新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用水冲洗干净，用滤纸吸干表面水分。先放入95%（w/v）的乙醇中处理 3~5 分钟，取出用无菌水冲洗 5~6 次，再放入 0.1%（w/v）HgCl₂ 灭菌 3~5 分钟，取出用无菌水冲洗 5~6 次。然后于火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向 YMA(表1)培养基表面划线，倒置后在 28℃下培养。

2 纯化

待长出菌体后，用枪头从平板上刮取少量根瘤菌菌落，加 1 mL 无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3 d 之后观察菌落情况，一直观察到 15 d (慢生根瘤菌需 7~15 d出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。

根据以下两个方面可初步判断是否为根瘤菌：

①菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质或多或少。培养 3~5 d 菌落直径达 2~4 mm 为快生型根瘤菌，培养 7~10 d 菌落直径达 1 mm 则为慢生型根瘤菌。

②nodA gene PCR检测：挑取上述形态根瘤菌单克隆进行nodA gene PCR检测，引物分别为 nodA-F和 nodA-R，酶选用 2×starMix，分别用根瘤菌 BXYD3 的基因组DNA 和水为模板做阳性对照及阴性对照。此及基因的条带长度大约为 666 bp，运用电泳成像技术观察菌株 WYS3R1 在 666 bp处具有较亮条带，初步判定其为根瘤菌。然后加入等体积50%（w/v）甘油放 -80℃ 保菌。

本实施例菌株 WYS3R1 为慢生型根瘤菌，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在 YMA平板上生长 5~7 d 后的直径为 0.8~2.0 mm（附图1）；最适生长条件为：pH=7.0，温度 28℃，转速 180 r/min，可利用甘露醇和酵母粉分别作为其碳源和氮源；经nodA gene PCR、电泳成像检测，其条带与阳性对照根瘤菌 BXYD3 的基因组 DNA 为模板的条带一致(基因长度约 666 bp，如附图 2)。

运用此分离纯化方法，经若干代反复纯化，在 YMA 固体培养基（表1）中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经蛭石回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到结瘤率高和固氮能力强的菌株 WYS3R1。

实施例2 根瘤菌WYS3R1 的 16S rDNA 分子生物学鉴定

对根瘤菌单克隆菌液进行16S rDNA 的 PCR 特异性扩增，正向引物为SEQ IDNO.3：V4V5515-F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTA-3’；反向引物为SEQ ID NO.4：V4V5907-R 5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’。酶选用 2×star Mix。PCR 扩增产物做电泳成像技术进行检测，观察其是否具有条带，将剩余 PCR 扩增产物用于序列测定。测序结果如SEQ ID NO:5所示。其PCR反应体系如表3。

反应条件：95℃ 5 min；（95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 50s）×44 cycle；70℃ 5min。

从 NCBI(GenBank)数据库中获取 13 个参比菌株序列，运用软件 BioEdit 和MEGA6 对分离菌株和参比菌株的 16S rDNA 部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树(附图 3)。从而确定根瘤菌WYS3R1 为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系，并命名为武圆 1 号。

实施例3 回接试验

试验目的：筛选出和决明属牧草具有较高结合效率且固氮能力较强的根瘤菌。

试验材料：供试植物：闽育 1 号圆叶决明；供试菌株：分离纯化的根瘤菌。

主要试验仪器和器材：人工气候生长室、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、15×15 cm 的盆栽盆 25 个、1 L 的烧杯 2 个、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒、剪刀和纱布等。

试验药品和试剂

(1) 试验药品：甘露醇、MgSO₄∙7H₂O、NaCl、酵母粉、K₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCO₃、Ca(NO₃)₂∙4H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、Na₂HPO₄·12H₂O、C₁₀H₁₂N₂O₈FeNa·3H₂O、Na₂MoO₄、MnSO₄、H₃BO₃、CuSO₄·5H₂O 和 ZnSO₄·7H₂O。

试验试剂：

1） YMA(Yeast Mannnitol Agar)液体培养基：称取甘露醇 10 g，MgSO₄∙7H₂O0.2g，NaCl 0.1 g，酵母粉 3 g，K₂HPO₄ 0.25 g，KH₂PO₄ 0.25 g，CaCO₃ 3 g(保存时添加)，琼脂 15 g溶于 1 L 纯水中。

2） 植物低氮营养液：Ca(NO₃)₂∙4H₂O 0.03 g，MgSO₄·7H₂O 0.28 g, CaCl₂·2H₂O0.10 g，KH₂PO₄ 0.10 g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.15 g，C₁₀H₁₂N₂O₈FeNa·3H₂O 0.0075 g，微量元素1 mL，蒸馏水 1000 mL，pH 5.5。微量元素配方(g∙L^-1): Na₂MoO₄ 0.03 g，MnSO₄ 1.81 g，H₃BO₃ 2.86 g，CuSO₄·5H₂O 0.8 g，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g。

试验步骤

（1）菌株培养

将 -80℃ 保存的供试菌株转接于 YMA 液体培养，培养至对数期。即 OD值达到1~1.2。

（2）灭菌处理

将试验所需用的盆栽盆、烧杯、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒、纱布、剪刀包好，将蛭石用保鲜袋装好，121℃，灭菌 30 min。YMA 液体培养基、蒸馏水用瓶子装好，121℃，灭菌20 min。

将供试植物种子浸入 80℃ 的热水中浸泡 3 min，使种皮软化，胶状物析出，并用清水反复冲洗干净，之后将圆叶决明种子经75%（w/v）酒精处理 15 min，用无菌水冲洗 5~6次，用10%（w/v） H₂O₂ 进行表面消毒 4 min，再用无菌水冲洗 7~8 次，最后放入带有滤纸的培养皿 28℃ 下催芽 10 h，待胚根长出 0.2 cm 即可。

（3）蛭石栽培及接种

(1) 将纱布条穿过灭过菌的盆栽盆的底部，然后将灭过菌的蛭石盛装于灭过菌的盆栽盆中，使植物低氮营养液通过纱布条引到基质和植物根部，以保证圆叶决明牧草生长发育对营养和水分的需求。然后将盆栽盆套在装有营养液的烧杯中。用锡箔纸包裹此上下两层装置，以避免营养液在光照条件下长青苔。

(2) 将处理过的圆叶决明种子穴播于蛭石中，将圆叶决明种子接种根瘤菌菌液，每盆 2 mL，菌含量为 10亿个每毫升，最后盖上厚1 cm的蛭石。置于生长室中(光周期为：日/夜=16 h/8 h，温度为：日/夜=26℃/24℃)培养。

以不接种根瘤菌菌液为空白对照，做 3 个重复，接种 30 d后收获，以植株鲜重、干重、结瘤数、植株含氮量、根瘤菌固氮酶活性、SPAD 值和株高作为测定根瘤菌结合性和固氮能力的判断指标。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一株决明属根瘤菌WYS3R1 及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> nodA-F

<400> 1

tgcrgtggar dctrygctgg gaaa 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> nodA-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

gnccgtcrtc raasgtcarg ta 22

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<211> 19

<212> DNA

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<212> DNA

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ccgtcaattc ctttgagttt 20

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<211> 384

<212> DNA

<213> 根瘤菌 WYS3R1的16S rDNA序列

<400> 5

gcaggcagcg ttgctcggat cctgggcgta agggtgcgta ggcgggtctt taagtcaggg 60

gtgaaatcct ggagctcaac tccagaactg cctttgatac tgaagatctt gagttcggga 120

gaggtgagtg gaactgcgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcgcaa gaacaccagt 180

ggcgaaggcg gctcactggc ccgatactga cgctgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac 240

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagccgt tagtgggttt 300

actcactagt ggcgcagcta acgctttaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 360

taaaactcaa agaaaattga cgga 384

Claims (2)

1.一株决明属慢生根瘤菌 WYS3R1 其特征在于：所示慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WYS3R1，是从决明属牧草新鲜根瘤中分离和纯化，PCR 检测 nodA gene，并经 16SrDNA分子生物学鉴定所得，于 2018 年 4 月10 日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M2018190。

2.如权利要求 1 所述的一株决明属慢生根瘤菌 WYS3R1 在豆科决明属植物提高生物固氮能力中的应用。

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