CN110093299A

CN110093299A - 一种耐盐促生菌菌株d5-2及其应用

Info

Publication number: CN110093299A
Application number: CN201910429431.2A
Authority: CN
Inventors: 赵海燕; 陈军; 郑青松; 兰汝佳; 韩鹰; 吴馨怡
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-08-06
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110093299B

Abstract

本发明涉及一种耐盐促生菌菌株D5‑2，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月5日，保藏号为CGMCC NO.17706，所述耐盐促生菌菌株D5‑2的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。接种菌株D5‑2能在盐胁迫下显著提高番茄的耐盐促生能力，将该菌株制成菌剂，然后注入番茄幼苗根围土壤中，能明显增大番茄的株型、株高和茎粗，显著促进番茄幼苗的干物质积累，并对番茄幼苗的根长、表面积、根体积、根尖数的均有促进作用，减缓了盐害现象，从而促进番茄幼苗的生长，有助于提高番茄的耐盐性。

Description

一种耐盐促生菌菌株D5-2及其应用

技术领域

本发明涉及一种耐盐促生菌菌株D5-2及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum)是世界上种植量仅次于马铃薯的最多的茄科蔬菜作物，也是肉果及茄科的重要模式植物(Salvalaggio等,2017；张天鹏和杨兴洪,2018)，深受大众喜爱和欢迎，目前世界范围内报导的番茄品种已超过3000 种，全球番茄生产正面临生物和非生物胁迫的严峻挑战。盐渍是农业中抑制作物生长和降低粮食产量以限制全球主要粮食作物生产力的一大主要环境胁迫 (Kaushal等,2016；栗露露等,2019)。番茄对盐中度敏感，主要种植在世界温暖和干旱地区，而这些地区的土壤往往盐度比较高。随着可利用淡水资源的日益缺乏、人口的急剧膨胀和自然资源的不合理使用，利用盐度高的旱区、半干旱地区和沿海地区土壤发展农业生产不得不为之(Tank&Saraf,2018)。近年来国内外番茄设施农业的迅猛发展使得番茄面临次生盐渍等各类胁迫的问题更为突出，因此番茄耐盐性及其调控研究就显得格外重要。

Kloepper和Schroth于1978年首次定义植物根际促生菌(PGPR)为定植于植物根部的有益土壤细菌。PGPR参与了土壤生态系统的各项生物活动，通过提高营养的可利用性(固氮解磷等)、提高激素产量、竞争有害的微生物、共生关系的促进等等，使其具有动态的营养转换和可持续的作物生产(Paul等,2005；艾文琴等,2018)。诸多研究表明，与根相关的多种微生物对促进植物盐渍适应至起到关重要的作用。PGPR通过生产生长素(IAA)、赤霉素(GAs)和一些未知的因子，会导致根长、根表面积和根尖数量的增加，从而促进养分的吸收，从而改善植物在胁迫条件下的健康状况。利用这些微生物本身可以减轻盐土农业方面的压力，并促进可持续农业的良性发展。

目前，有关PGPR改善盐土、促进植物耐盐性的研究工作尚处于起步阶段，主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.) 等，并对它们在调整植物内源激素平衡、离子稳态、抗氧化和光合作用等方面做了一些机理性的探讨。而关于番茄耐盐的根际促生菌的介绍很少。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种耐盐促生菌菌株 D5-2及其应用。

技术方案

本发明筛选到一种耐盐促生菌菌株D5-2，分类命名为Bacillus siamensis KCTC13613，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏日期为 2019年5月5日，保藏号为CGMCC NO.17706。

所述耐盐促生菌菌株D5-2的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述耐盐促生菌菌株D5-2分离自张家港松花菜根际土壤，称取张家港松花菜根际土壤样本(连带植物根系)后，加入双蒸水制备土壤悬液，将土壤悬液转接于含2％NaCl的LB液体培养基内，30℃振荡培养24h后，以1:100的接种量，再次转接于4％NaCl含量的LB培养基中，30℃振荡培养24h后，再转接于6％NaCl 含量的LB培养基中，30℃振荡培养24h后，将所得细菌培养液10⁶稀释涂布，挑取生长良好的单菌落，即为耐盐促生菌菌株D5-2。

上述耐盐促生菌菌株D5-2在盐胁迫中促进番茄生长的应用。

一种含有上述耐盐促生菌菌株D5-2的菌剂，制备方法为：将D5-2接种于 LB液体培养基，180rpm，30℃，培养至OD600为1，然后将菌液以6000rpm离心10min，弃上清液，再注入等体积dd水，振荡重悬后，以6000rpm离心10min，弃上清液，重复2次，重悬后即得菌剂。

上述菌剂用于在盐胁迫中促进番茄生长的应用，应用方法为：将菌剂注入番茄幼苗根围土壤中，每株番茄幼苗根围注入10mL菌剂。

本发明的有益效果：本发明提供了一种耐盐促生菌菌株D5-2，接种该菌株能在盐胁迫下显著提高番茄的耐盐促生能力，将该菌株制成菌剂，然后注入番茄幼苗根围土壤中，能明显增大番茄的株型、株高和茎粗，显著促进番茄幼苗的干物质积累，并对番茄幼苗的根长、表面积、根体积、根尖数的均有促进作用，减缓了盐害现象，从而促进番茄幼苗的生长，有助于提高番茄的耐盐性，减少化学肥料的使用，该耐盐促生菌菌株具有良好的应用前景。

具体实施方式

为了更好地理解发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅限于以下实施例。下述实施例中，测试用的番茄材料为番茄“合作903”(Solanumlycopersicum)种子，来自于上海番茄研究所。

实施例1耐盐促生菌菌株D5-2的分离、筛选及鉴定

1.耐盐促生菌菌株D5-2的分离及筛选：

从张家港温室大棚，松花菜根际土壤中采集土样，称取2.0g松花菜根际土壤样本(连带植物根系)置于装有100mL双蒸水的锥形瓶内，以封口膜封口后，在200r/min摇床内30℃恒温振荡24h，即得土壤悬液。吸取1mL土壤悬液转接于含2％NaCl的100mL LB液体培养基内，以200r/min转速30℃恒温培养24h 后，仍以1:100的接种量，再次转接于4％NaCl含量的LB培养基中，重复上述步骤，至LB培养液中NaCl含量达6％。将所得细菌培养液10⁶稀释涂布，挑取生长良好的单菌落，即得耐盐促生菌菌株D5-2。

2.耐盐促生菌菌株D5-2的鉴定：

(1)细菌DNA提取

将上面分离及筛选出的细菌培养至对数期，吸取1mL菌液至1.5mL离心管，先以30min沸水浴灭活，再将其置于离心机以1000rpm离心5min，所得上清液及为细菌DNA提取液。

(2)菌株16s rDNA的PCR扩增

将所提细菌DNA为模板，扩增引物采用细菌通用引物，即：正向引物U8-27(F) 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；反向引物L1494-1514(R)5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μLPCR扩增体系：21μL dd水，正反引物各1 μL，25μL R-Taq mix，2μL上述DNA提取液。按顺序加入上述体系中的各物质于0.5mL PCR管内，充分混匀，并以5000rpm离心3～5s。以上实验操作均需在超净台内完成，实验所用工具、耗材等均需严格灭菌。扩增反应程序：①94℃预变性2min，②94℃变性30s，③52℃退火30s，④72℃延伸1.5min，步骤②～④进行30个循环后，体系在72℃继续延伸10min，扩增产物保存于4℃。

PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶(含0.01％GelRed)电泳检测，以DNA Marker 2000作为参照，并置于1×TAE缓冲液内100V恒压电泳30min。随后在凝胶成像系统下观察PCR扩增产物条带。

(3)菌株16s rDNA序列测定与菌种鉴定

将扩增成功的PCR产物送由南京金唯智生物公司进行测序，并将所得16S rDNA序列上传至EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行同源性比对，鉴定该菌株为Bacillus siamensis，命名为D5-2。

将菌株D5-2进行菌种保藏，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月5日，保藏号为CGMCC NO.17706。

实施例2耐盐促生菌菌株D5-2对番茄的耐盐促生测试

制备含有耐盐促生菌菌株D5-2的菌剂：将D5-2接种于LB液体培养基， 180rpm，30℃的条件下培养至OD600为1，然后将菌液以6000rpm离心10min，弃上清液，再注入等体积dd水，振荡重悬后，以6000rpm离心10min，弃上清液，重复2次，重悬后即得菌剂。

实验设计：挑选大小一致、饱满的番茄种子用5％的NaClO溶液表面消毒 10min，用去离子水反复冲洗种子多次，置于去离子水中浸种24h，再将其置于铺有湿润纱布的培养皿上，27℃催芽2d。选取芽长一致的种子播种于塑料盆 (盆高17cm，口径23cm)中，栽培基质为泥炭土和蛭石(体积比2:1)。每盆播6 颗，浇水，待幼苗长至3叶1心时间苗以确保齐苗，幼苗长至4叶1心时转入不同处理。实验设0、2.5‰、5‰NaCl处理3个水平(以基质80℃烘干干重为基准)，共设6个处理组，即：(1)不外加NaCl+不外加菌剂(对照组)；(2)外加菌剂；(3)外加2.5‰NaCl；(4)外加2.5‰NaCl+外加菌剂；(5)外加5‰NaCl； (6)外加5‰NaCl+外加菌剂。每个处理组7盆。按设定用饱和的NaCl溶液浇灌，再用蒸馏水润洗，使得外加盐分在基质中均匀，对照组用蒸馏水浇灌，要外加菌剂的实验组在盐处理后第2天用菌剂灌根，每株幼苗根围注入10mL菌剂。处理15d后采样进行指标测定。整个培养过程昼夜为16h:8h，白天光照度为镝灯10000Lux，温度：白天25±5℃及夜间20±5℃，相对湿度：白天50％±10％及夜间60％±6％。

实验测试：

1.叶绿素含量及光合参数测定

于白天以手持式SPAD叶绿素仪(8SPAD502-plus,中国)测定番茄新完全展开叶叶绿素含量，每个处理7个重复。同时用Li-6400便携式光合仪(Li-COR，美国)测定番茄新完全展开叶的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO₂浓度(Ci) 及蒸腾速率(Tr)。测定使用红蓝光源叶室，叶温25±3℃，光照强度为1000μmol m^-2s^-1，气流速率500μmol s^-1。

测试结果见表1：

表1

由表1可以看出，盐胁迫下，番茄幼苗净光合速率(Pn)明显被抑制 (P<0.05)，2.5‰和5‰NaCl处理下，比对照分别降低57％和66％。在非盐胁迫下，接种D5-2可提高79％的番茄幼苗Pn。在2.5‰NaCl盐度下，D5-2 处理植株Pn对照提高228％；在5‰NaCl盐度下，D5-2处理的Pn比对照提高37％。2.5‰和5‰NaCl盐度下植株气孔导度(Gs)分别比降低67％和92％。非盐胁迫下，接种D5-2植株叶片Gs比对照组提高246％；2.5‰NaCl盐度下， D5-2处理的植株Gs比对照增加399％；5‰NaCl盐度下，D5-2处理的Gs比对照提高118％。在非盐胁迫下，D5-2处理的植株胞间CO₂浓度(Ci)比对照组提高142％；2.5‰NaCl盐度下，D5-2处理的植株叶片Ci比对照增加400％； 5‰NaCl盐度下，D5-2处理植株叶片Ci比对照增加200％。2.5‰和5‰盐度下蒸腾速率(Tr)分别比对照下降46％和87％。非盐条件下D5-2处理的番茄叶片Tr与对照差异不显著；2.5‰NaCl盐度下，D5-2处理下的植株Tr与对照增加40％；5‰NaCl盐度下，D5-2处理的植株Tr比对照增加190％。

2.根系形态分析

使用爱普生扫描仪(1640XL,中国)对根系进行扫描及WinRHIZO分析系统软件(LA1600+,加拿大)进行分析，得到总根长、根表面积、根体积、根尖数等指标。测试结果见表2：

表2

由表2可以看出，盐胁迫显著抑制了番茄幼苗根生长，且盐浓度越高抑制作用越强。在非盐胁迫下，D5-2处理的总根长、根表面积、根体积和根尖数，与对照相比分别提高30％、27％、15％和15％。在2.5‰NaCl盐度，接种D5-2 对番茄幼苗根长、表面积、根体积、根尖数分别提高95％、94％、133％和27％。在5‰NaCl盐度，接种D5-2对番茄幼苗根长、表面积、根体积、根尖数分别提高77％、88％、125％和42％。在2.5‰NaCl盐度下，对番茄根系的促进作用最佳。

3.番茄株高、茎粗、干重及根冠比

将番茄幼苗整株从基质中取出，洗净，用吸水纸吸干表面水分，将番茄分为地上部分和地下部分，使用刻度刚尺测量株高、茎粗。将材料置于105℃烘箱杀青15min，再在60℃烘箱烘干至恒重，称取干重。以地上部分和地下部分的干重比，得出根冠比(R/S)，即：

根冠比(％)＝(根干重/地上部干重)×100

测试结果表3：

表3

由表3可以看出，与非盐处理相比，2.5‰和5‰NaCl处理株高分别下降 20％和45％。而非盐条件下，D5-2处理的植株株高比对照增长48％；2.5‰NaCl 胁迫下，D5-2株高比对照增长53％；5‰NaCl胁迫下，接种D5-2番茄株高相比对照提高了79％。与不加盐相比，2.5‰和5‰NaCl处理茎粗下降分别为29％和39％。非盐处理下，接种D5-2的处理植株茎粗比对照增长28％；2.5‰NaCl 胁迫下，D5-2处理茎粗比对照增加32％；5‰NaCl胁迫下，接种D5-2番茄幼苗茎粗比对照增加24％。

2.5‰和5‰NaCl处理植株地上部干重比非盐处理的分别减少65％和77％。在非盐条件下，D5-2处理的番茄地上部干重比对照提高84％；2.5‰NaCl胁迫下，接种D5-2对番茄幼苗地上部干重比对照增加254％；5‰NaCl胁迫下，接种D5-2比对照增长348％。2.5‰和5‰NaCl胁迫下，番茄幼苗根部干重分别比不加盐的减少48％和67％。在非盐胁迫水平下，接种D5-2的番茄幼苗根部干重比对照增加67％；2.5‰NaCl胁迫下，接种D5-2的幼苗根部干重比对照增加155％；5‰NaCl胁迫下，接种D5-2的植株根部干重比对照增加186％。整株干重的处理间差异趋势和地上部的相似。在非盐条件下，D5-2处理的植株根冠低于对照12％；2.5‰NaCl胁迫下，接种D5-2的番茄幼苗根冠比下降25％； 5‰NaCl胁迫下，接种D5-2的番茄幼苗根冠比下降25％。

4.矿质元素含量测定

将上述烘干植株样磨碎并过40目不锈钢筛，得待用干样品。参考鲍士旦(鲍士旦.土壤农化分析.3版[M].中国农业出版社,2000)的方法进行测定：植株K、Na、Ca、Mg、Fe的测定采用HNO3消解，将消煮稀释液过滤后使用ICP原子发射光谱仪(Agilent Technologies710，澳大利亚)进行元素含量测定。测试结果见表4：

表4

由表4可以看出，随着盐胁迫的加剧，番茄幼苗叶片Na含量明显上升，K、 Ca、Mg含量下降。非盐胁迫下，接种D5-2对叶片Na含量没有明显影响，但2.5‰和5‰NaCl盐度下，Na分别降低55％和24％。非盐胁迫下，K含量比对照组增加了27％，2.5‰和5‰NaCl盐度下，K含量分别提高了22％和56％。非盐胁迫和2.5‰ NaCl盐度下，接种D5-2对叶片Ca和Fe含量影响不大，5‰NaCl盐度下，可分别提高叶片Ca和Fe含量25％和150％。非盐胁迫下，Mg含量比对照组增加了25％， 2.5‰和5‰NaCl盐度下，Mg含量分别提高了24％和113％。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种耐盐促生菌菌株D5-2及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 1

ttcggcggct ggctccataa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720

agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780

ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840

cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900

acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960

gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020

ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080

ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140

ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200

ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260

gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcagacaac catccggtat tagccccggt 1320

ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380

ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgta 1426

Claims

1.一种耐盐促生菌菌株D5-2，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年5月5日，保藏号为CGMCC NO.17706。

2.如权利要求1所述耐盐促生菌菌株D5-2，其特征在于，所述耐盐促生菌菌株D5-2的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述耐盐促生菌菌株D5-2在盐胁迫中促进番茄生长的应用。

4.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述耐盐促生菌菌株D5-2。

5.权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，将D5-2接种于LB液体培养基，180rpm，30℃，培养至OD600为1，然后将菌液以6000rpm离心10min，弃上清液，再注入等体积dd水，振荡重悬后，以6000rpm离心10min，弃上清液，重复2次，重悬后即得菌剂。

6.权利要求4所述菌剂用于在盐胁迫中促进番茄生长的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法为：将菌剂注入番茄幼苗根围土壤中，每株番茄幼苗根围注入10mL菌剂。