CN115161217A - 一种耐盐可降解有机大分子物质的废盐田枝芽孢杆菌h83及其菌剂制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐盐可降解有机大分子物质的菌株，所述菌株是保藏编号为CGMCC No.21233、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的废盐田枝芽孢杆菌(Virgibacillus chiguensis)H83；还公开了由耐盐可降解有机大分子物质的菌株发酵得到的H83菌剂；H83菌剂的制备方法；H83菌剂在番茄盐胁迫下生长时的应用。本发明有益于高盐分土壤上作物促生，提供了一种将能用于作物根际的微生物菌剂，提高作物在盐土环境的耐盐性进而促进作物生长，为改善高盐土植物生长状况提供了一种简便高效处理方式。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种耐盐可降解有机大分子物质的废盐田枝芽孢杆菌H83及其菌剂制备与应用。
背景技术
盐分过多的土壤影响植物的生产力。在中国，700万公顷的土地受到盐分的影响，为了养活不断增长的人口，需要提高作物生产力。盐渍土壤引起植物离子毒性、养分缺乏、氧化胁迫和渗透胁迫，限制了植物对土壤水分的吸收。在盐胁迫下，Na+吸收的增加严重影响植物的代谢和生长。离子毒性可以改变化学反应中K+离子的浓度，从而引起氨基酸构象的变化。Na+在植物中的高积累抑制光合作用并产生活性氧(ROS)，从而导致植物DNA损伤、膜损伤和蛋白质退化，细胞壁引发细胞死亡和渗透胁迫。盐分通过降低叶绿素含量、叶面积、气孔导度和光系统效率来干扰光合作用；渗透平衡紊乱导致细胞肿胀、细胞干燥，最终导致细胞死亡；渗透胁迫和离子毒性可导致代谢不平衡，导致氧化应激。
植物进化出一系列遗传和表观遗传调控系统，以应对盐分和干旱等非生物胁迫。传统植物育种和分子技术的结合广泛应用于提高作物的非生物耐受性。但是，这种方法在提高耐盐性或产量方面并不是很成功，有很多缺点如，既费时又费力、分子技术不广泛适用于四倍体或六倍体的物种等。微生物通过不同的机制应对非生物胁迫，增强植物的抗逆能力，如产生赤霉素、吲哚乙酸和一些未测定生物激素，这些生物激素促进根表面积、根长面积、根尖数量增加，提高植物养分含量，改善盐胁迫下植物的健康。在盐胁迫条件下，植物根际促生菌对油菜、番茄、菜豆、生菜、辣椒等不同植物的生长均有促进作用,接种特定的植物根际促生菌有助于提高植物的耐盐性。
发明内容
发明目的：为了克服背景技术的不足，本发明第一目的是公开一种耐盐可降解有机大分子物质的菌株；
第二目的是公开由耐盐可降解有机大分子物质的菌株发酵得到的H83耐盐菌剂，以及与有机废弃物堆肥混合发酵得到的H83耐盐菌肥；
第三目的是公开H83菌剂的制备方法；
第四目的是公开H83菌剂和H83菌肥在番茄盐胁迫下生长时的应用。
技术方案：本发明公开了一种耐盐可降解有机大分子物质的菌株，所述菌株是保藏编号为CGMCC No.21233、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的废盐田枝芽孢杆菌(Virgibacillus chiguensis)H83。
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
是否存活：是；
保藏日期：2020年11月26日。
一种H83耐盐菌剂，所述菌剂由权利要求1所述的盐田枝芽孢杆菌H83发酵得到。
上述的H83耐盐菌剂在番茄盐胁迫下生长时的应用，将所述的H83耐盐菌剂施用于盐胁迫下的番茄中，帮助番茄抵抗盐分胁迫，实现增产。
上述的H83耐盐菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、耐盐菌库构建
S1-1、耐盐菌来源样品的采集：选择高盐餐厨垃圾堆肥作为筛选耐盐菌株的样品，餐厨垃圾堆肥样品每个样品S型随机选取5个点，采用四分法后混匀后装入自封袋，保存于-4℃保温箱备用；
S1-2、制备含有NaCl的LB选择性培养基：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，1000ml去离子水，琼脂粉15～20g搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH 至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下蒸汽灭菌20min；然后将培养基取出，放置室温下，等温度降低到50-60℃时加入经过细菌滤器处理的1％bromocresol purple，及 100mg溶解到甲醇中的真菌抑制剂放线菌酮，混匀后在超净台内倒板，冷却凝固成平板，备用；
S1-3、样品的处理：称取样品10g与100ml生理盐水于250ml锥形瓶中，锥形瓶中放入50余颗玻璃珠，使用封口膜封口置于30℃、180r/min摇床震荡30min，使其充分混匀，然后取其100μl加入到900μl去离子水中混匀，此时是10-1，接着在已稀释的溶液中取100μl加入到900μl去离子水中，混匀，为10-2，以此重复，倍比稀释到10-5、10-6、 10-7，备用；
S1-4、耐盐菌株的分离纯化：分别取已稀释的10-5、10-6、10-7样品溶液100μl，分别均匀涂到倒好的含有不同盐浓度分别为1％、4％、7％、10％的LB培养基的固体平板上，每个梯度设置3个重复，倒置于30℃培养箱中过夜后取出观察各平板生长情况，挑选菌落分散较好的平板，挑取菌落形态不同的单菌落，经过多次划线纯化，即得到耐盐纯菌株；
S2、盐胁迫下种子促生实验筛选废盐田枝芽孢杆菌H83
S2-1、番茄栽培，使用前，先用1.5％(W/V)NaClO对种子表面进行消毒2min，并用无菌水漂洗5～8次，确保无NaClO残留后均匀铺撒于用无菌蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，置于温室黑暗条件下培养12-24h；
S2-2、挑选可发芽的番茄种子，即萌发出0.1mm芽尖的种子进行下一步实验；
S2-3、使用耐盐菌菌液，浓度为108CFU/ml，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡30s，作为处理组；空白对照组使用无菌液体LB培养基，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡 30s；
S2-4、将浸泡好的种子平铺至无菌0.5％、1.0％、1.5％NaCl三种浓度盐分胁迫浸润的灭菌滤纸上，盖上培养皿，用封口膜封好，放入黑暗条件28℃恒温培养48h观察种子萌发情况，筛选出耐盐促生效果最显著的耐盐菌，即废盐田枝芽孢杆菌H83进行后续操作；
S3、废盐田枝芽孢杆菌H83生长条件探索
将获得的H83进行生长曲线测定和最适培养温度探索，确定菌株培养条件；
S4、耐盐菌剂的制备
S4-1、一级种子培养液：在无菌条件下，将培养得的H83接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃条件下，180r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到 3.0以上时停止培养，制得一级种子液；
S4-2、二级种子培养液：在无菌条件下，将一级种子液接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，接种量为5％。在30℃条件下，180r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液即菌剂。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：
H83耐盐菌剂，能用于作物根际，提高作物在盐土环境的耐盐性进而促进作物生长，为改善高盐土植物生长状况提供了一种简便高效处理方式；
将H83应用于番茄盐胁迫下生长，可帮助番茄抵抗盐分胁迫，实现增产。
附图说明
图1为本发明耐盐菌剂提高番茄幼苗抗盐胁迫实验中试验第21天后变化的不同处理的番茄幼苗生长情况图；
图2为本发明耐盐菌剂堆肥强化番茄幼苗抗盐胁迫实验中随时间变化的不同处理的番茄幼苗第12天生长情况图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
制备H83耐盐菌剂
(1)耐盐菌菌库构建
耐盐菌来源样品的采集：选择高盐餐厨垃圾堆肥作为筛选耐盐菌株的样品。餐厨废弃物堆肥样品每个样品S型随机选取5个点，采用四分法后混匀后装入自封袋。新鲜堆肥样需剔除粒径较大的杂物，保存于-4℃保温箱，并尽快拿回实验室进行后续试验。
制备含有NaCl的LB选择性培养基：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl10g，1000ml去离子水，琼脂粉15g或使用配置好的LB培养基试剂40g加入1000ml 去离子水搅拌至溶质溶解。(额外加入体积分数盐度的NaCl)用5mol/L NaOH调节PH 至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下蒸汽灭菌20min；然后将培养基取出，放置室温下，等温度降低到60℃时加入经过细菌滤器(0.2um)处理的1％bromocresol purple (0.5ml/400ml或1ml/400ml)，及100mg溶解到甲醇中的真菌抑制剂放线菌酮 (100mg/ml)，混匀后在超净台内倒板，冷却凝固成平板，备用。
样品的处理：称取堆肥/土壤样品10g与100ml生理盐水于250ml锥形瓶中，锥形瓶中放入50余颗玻璃珠(直径5mm)，使用封口膜封口置于30℃、180r/min摇床震荡 30min，使其充分混匀。然后取其100μl加入到900μl去离子水中混匀，此时是10-1，接着在已稀释的溶液中取100μl加入到900μl去离子水中，混匀，为10-2，以此重复，倍比稀释到10-5、10-6、10-7，备用。
耐盐菌株的分离纯化：分别取已稀释的10-5、10-6、10-7样品溶液100μl，分别均匀涂到倒好的含有不同盐浓度(以NaCl计)分别为1％、4％、7％、10％(呈梯度即可，方法以筛选1-10％耐盐度为例)的LB培养基的固体平板上，每个梯度设置3个重复，倒置于30℃培养箱中过夜后取出观察各平板生长情况，挑选菌落分散较好的平板，挑取菌落形态不同的单菌落，经过若干次划线纯化(Z字型三个梯度进行划线)，即得到耐盐纯菌株。
进行盐胁迫下番茄种子促生实验筛选耐盐促生菌
番茄(Lycopersicon esculentum)栽培品种“上海903”。使用前，先用1.5％(W/V)NaClO对种子表面进行消毒2min，并用无菌水漂洗8次，确保无NaClO残留后均匀铺撒于用无菌蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，置于温室黑暗条件下培养12-24h；
挑选可发芽的番茄种子，即萌发出0.1mm芽尖的种子进行下一步实验；
使用耐盐菌菌液，浓度为108CFU/ml，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡30s，作为处理组(可同时进行多菌株验证)；空白对照组使用无菌液体LB培养基，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡30s。
将浸泡好的种子平铺至无菌0.5％、1.0％、1.5％NaCl三种浓度盐分胁迫浸润的灭菌滤纸上，盖上培养皿，用封口膜封好，放入黑暗条件28℃恒温培养48h观察种子萌发情况，筛选出耐盐促生效果最显著的耐盐菌即盐田枝芽孢杆菌H83进行后续操作。
该菌株已于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21233，分类命名：废盐田枝芽孢杆菌(Virgibacillus chiguensis)。
(2)耐盐菌生长条件探索
将获得的耐盐促生菌H83进行生长曲线测定和最适培养温度探索，确定菌株培养条件。
(3)耐盐菌剂制备
一级种子培养液：在无菌条件下，将培养得的耐盐菌H83接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃条件下，180r/min摇床培养2天，当菌种液体培养OD值达到 3.0以上时停止培养，制得一级种子液。
二级种子培养液：在无菌条件下，将一级种子液接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，接种量为5％。在30℃条件下，180r/min摇床培养2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液即菌剂。
耐盐菌剂提高番茄幼苗抗盐胁迫实验
试验在中国农业大学有机循环研究院(苏州)进行。
一、试验步骤如下：
1.实验材料
番茄(Lycopersicon esculentum)栽培品种“上海903”。播种前，先用1.5％(W/V)NaClO对种子表面进行消毒2min，并用无菌水漂洗5～8次，确保无NaClO残留后均匀铺撒于用蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，置于温室黑暗条件下培养3d；然后用镊子将催芽的种子置于穴盘中(基质为东北黑土、蛭石、珍珠岩按照1:1:1比例均匀混合)于温室中培养，温室培养条件是周期为16h/18h，22℃，70％相对湿度。培养到4叶期后进行移栽，每个盆钵1株苗，移栽后置于相同的温室条件下生长。盆钵由容量为330mL一次性塑料杯底部钻孔制得，每盆装土重量为200g。
2.试验设计
实验材料选用4叶期的番茄幼苗，设置4个处理，如表1每个处理设置重复36株，采集第0、3、7、14、21d植物样品进行后续指标测定，收集植物样品的根际土及植物叶片并液氮速冻保存。植物测定生长指标(株高、茎粗、地上部干鲜重、地下部干鲜重，地下部根长、叶绿素相对含量)
表1实验处理
二、测定指标
1、株高：游标卡尺测量、拍照。测量第0、3、7、14、21d样品，每个处理测三个重复。
2、茎粗：游标卡尺测量根部3cm直径宽度。测量第0、3、7、14、21d样品，每个处理测三个重复。
3、总叶面积：将番茄幼苗叶子全部使用叶面积仪扫描得到植株总叶面积。测量第0、 3、7、14、21d样品，样品每个处理测三个重复。
4、地上部干鲜重：鲜样采样后直接使用分析天平称量得地上部鲜重。70℃干燥至恒重后称量得地上部干重。测量第0、21d样品，样品每个处理测三个重复。
5、地下部干鲜重：鲜样采样后使用分析天平称量得地下部鲜重。70℃干燥至恒重后称量得地上部干重。测量第0、21d样品，样品每个处理测三个重复。
6、根长：根系扫描仪；测量第0、3、7、14、21d。样品每个处理测三个重复。每株植物的茎和根用手术刀分开。用去离子水冲洗新鲜根，然后使用扫描系统(Expression 4990，Epson，Long Beach，CA)分析根系形态。数据分析采用Win-RHIZO软件根总长、根径、根表面积、根体积和根数自动测定。
7、叶绿素相对含量：叶绿素仪测定；每个植株测定十片叶子数据进行平均值，使用其作为一个数据，测量第0、3、7、14、21d样品。样品每个处理测三个重复。首先将叶绿素测定仪的测量头夹在叶片两端，按下测量头。用于计算SPAD测量值，就可以分析出所测叶片的叶绿素含量。
三、结果与分析
试验第21天后变化的不同处理的番茄幼苗生长情况如图1所示。从图1可以看出在盐胁迫处理下，番茄受到盐分胁迫生长受到显著抑制，表现在株高、茎粗、叶绿素相对含量、总叶面积、地上部干鲜重及地上部干鲜重8个指标上。将耐盐菌剂H83接种在番茄幼苗中的处理组，在盐分胁迫和非盐分胁迫条件下，对比对照组均有提高，但是在盐分胁迫处理组的对照中显著性更为明显，八个相应生长指标见均显著提高，盐胁迫条件下的番茄生长得到大幅度促进，甚至在个别指标超过无盐分胁迫对照组，如茎粗、地上部鲜重和地下部鲜重。
总结
施用20ml的H83耐盐菌剂至4叶期的番茄幼苗盆栽中，对其进行浓度为0.4％盐胁迫处理，发现耐盐菌剂可以显著促进番茄幼苗的生长存活。耐盐菌剂处理组在非盐分胁迫和盐胁迫条件下都能够促进番茄植株的生长，但是在盐胁迫处理下的促生效果更为明显，番茄生长指标较无盐分胁迫的空白对照处理更高，可以证明该菌剂可以帮助番茄抵抗盐分胁迫，实现增产。
耐盐菌剂堆肥强化番茄幼苗抗盐胁迫实验
试验在中国农业大学有机循环研究院(苏州)进行。
一、试验步骤如下：
1.实验材料
番茄(Lycopersicon esculentum)栽培品种“上海903”。播种前，先用1.5％(W/V)NaClO对种子表面进行消毒2min，并用无菌水漂洗5～8次，确保无NaClO残留后均匀铺撒于用蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，置于温室黑暗条件下培养3d；然后用镊子将催芽的种子置于穴盘中(基质为东北黑土、蛭石、珍珠岩按照1:1:1比例均匀混合)于温室中培养，温室培养条件是周期为16h/18h，22℃，70％相对湿度。培养到4叶期后进行移栽，每个盆钵1株苗，移栽后置于相同的温室条件下生长。盆钵由容量为330 mL一次性塑料杯底部钻孔制得，每盆装土重量为200g。
有机肥使用上一章实验中腐熟后经风干含水率低于30％、研磨为2mm的堆肥样品。CK堆肥即为堆肥实验中CK处理的堆肥产品；耐盐菌剂H83、堆肥即为堆肥实验中接种耐盐菌剂处理的堆肥产品。
2.试验设计
实验材料选用4叶期的番茄幼苗，设置8个处理，如表2每个处理设置重复36 株，采集第0、3、6、9、12d植物样品进行后续指标测定，收集植物样品的根际土及植物叶片并液氮速冻保存。植物测定生长指标(株高、茎粗、地上部干鲜重、地下部干鲜重，地下部根长、叶绿素相对含量)
表2实验处理
二、测定指标
株高：游标卡尺测量、拍照。测量第0、3、6、9、12d样品，每个处理测三个重复。
茎粗：游标卡尺测量根部3cm直径宽度。测量第0、3、6、9、12d样品，每个处理测三个重复。
总叶面积：将番茄幼苗叶子全部使用叶面积仪扫描得到植株总叶面积。测量第0、3、6、9、12d样品，样品每个处理测三个重复。
地上部干鲜重：鲜样采样后直接使用分析天平称量得地上部鲜重。70℃干燥至恒重后称量得地上部干重。测量第0、12d样品，样品每个处理测三个重复。
地下部干鲜重：鲜样采样后使用分析天平称量得地下部鲜重。70℃干燥至恒重后称量得地上部干重。测量第0、12d样品，样品每个处理测三个重复。
根长：根系扫描仪；测量第0、3、6、9、12d。样品每个处理测三个重复。每株植物的茎和根用手术刀分开。用去离子水冲洗新鲜根，然后使用扫描系统(Expression 4990，Epson，Long Beach，CA)分析根系形态。数据分析采用Win-RHIZO软件根总长、根径、根表面积、根体积和根数自动测定。
叶绿素相对含量：叶绿素仪测定；每个植株测定十片叶子数据进行平均值，使用其作为一个数据，测量第0、3、6、9、12d样品。样品每个处理测三个重复。首先将叶绿素测定仪的测量头夹在叶片两端，按下测量头。用于计算SPAD测量值，就可以分析出所测叶片的叶绿素含量。
三、结果与分析
试验随时间变化的不同处理的番茄幼苗第12天生长情况如下图2，空白处理组番茄植株在3d出现叶面卷曲，在第3～9d期间盐害不断加重，叶子变黄，根茎部开始腐烂，至第12d该处理植株全部死亡，试验被迫停止，该处理组对应数据指标为0。
株高是衡量植物生长的重要指标之一，图2-A株高变化可知，在0.4％盐胁迫下施用6％堆肥处理组和菌肥处理组株高显著性高于未施用堆肥的空白处理，表明堆肥中的营养物质和有益微生物可以帮助番茄提高抗盐胁迫能力。植株茎部是水分、养分运输的关键，盐分对植物的胁迫表现在对水分运输通道的损害。由图2-B茎粗变化可知，在0.4％盐胁迫下施用6％堆肥的专利菌肥处理在茎粗指标显著高于相同环境下的其他处理，养分能够帮助植物抵御一部分盐分胁迫，施用耐盐菌肥明显的可以促进植株茎粗的生长更好的运送水分，帮助植物稀释盐减少盐对其损伤，从而提高植物抵抗盐胁迫的能力。 SPAD值是通过测量叶子对两个波长段里的吸收率，来计算叶绿素的相对含量，该指标指示了植物生长情况，相对叶绿素含量较高的处理长势越好。由图2-C叶绿素相对含量变化可知，本专利菌肥叶绿素含量最高并显著高于其他处理，表明耐盐菌肥可以帮助番茄促进盐胁迫环境下的生长。由图2-D总叶面积变化可知，在盐胁迫处理组中本专利菌肥处理在第12d的总叶面积显著高于其他处理，该结果也和地上部干鲜重、地下部干鲜重结果相似，所有生长指标皆反映了一个结论就是施用耐盐菌肥能够显著促进盐胁迫环境下番茄幼苗的生长，帮助番茄提高耐盐性，对盐碱地进行番茄栽培具重要意义。
总结
施用6％的耐盐菌剂堆肥至4叶期的番茄幼苗盆栽中，对其进行浓度为0.4％盐胁迫处理，发现堆肥可以显著促进番茄幼苗的生长存活。堆肥中富含营养元素可以被植物吸收，提供其所需养分促进生长。堆肥中富含大量有益微生物通过番茄植株根际微生物互相作用，帮助其抵抗盐分胁迫。耐盐菌剂堆肥处理帮助番茄抵抗盐胁迫以及促进非盐胁迫下番茄幼苗生长更为显著，该菌肥有较大使用价值。
Claims (6)
1.一种耐盐可降解有机大分子物质的菌株，其特征在于：所述菌株是保藏编号为CGMCCNo.21233、保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的废盐田枝芽孢杆菌(Virgibacillus chiguensis)H83。
2.一种H83耐盐菌剂，其特征在于：所述菌剂由权利要求1所述的盐田枝芽孢杆菌H83发酵得到。
3.一种H83耐盐菌肥，其特征在于：所述菌肥由权利要求1所述的盐田枝芽孢杆菌H83与有机废弃物堆肥混合发酵得到。
4.权利要求2所述的H83耐盐菌剂在番茄盐胁迫下生长时的应用，其特征在于：将所述的H83耐盐菌剂施用于盐胁迫下的番茄中，帮助番茄抵抗盐分胁迫，实现增产。
5.权利要求3所述的H83耐盐菌肥在番茄盐胁迫下生长时的应用，其特征在于：将所述的H83耐盐菌肥施用于盐胁迫下的番茄中，帮助番茄抵抗盐分胁迫，实现增产。
6.权利要求2所述的H83耐盐菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、耐盐菌库构建
S1-1、耐盐菌来源样品的采集：选择高盐餐厨垃圾堆肥作为筛选耐盐菌株的样品，餐厨垃圾堆肥样品每个样品S型随机选取5个点，采用四分法后混匀后装入自封袋，保存于-4℃保温箱备用；
S1-2、制备含有NaCl的LB选择性培养基：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl10g，1000ml去离子水，琼脂粉15～20g搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下蒸汽灭菌20min；然后将培养基取出，放置室温下，等温度降低到50-60℃时加入经过细菌滤器处理的1％bromocresol purple，及100mg溶解到甲醇中的真菌抑制剂放线菌酮，混匀后在超净台内倒板，冷却凝固成平板，备用；
S1-3、样品的处理：称取样品10g与100ml生理盐水于250ml锥形瓶中，锥形瓶中放入50余颗玻璃珠，使用封口膜封口置于30℃、180r/min摇床震荡30min，使其充分混匀，然后取其100μl加入到900μl去离子水中混匀，此时是10-1，接着在已稀释的溶液中取100μl加入到900μl去离子水中，混匀，为10-2，以此重复，倍比稀释到10-5、10-6、10-7，备用；
S1-4、耐盐菌株的分离纯化：分别取已稀释的10-5、10-6、10-7样品溶液100μl，分别均匀涂到倒好的含有不同盐浓度分别为1％、4％、7％、10％的LB培养基的固体平板上，每个梯度设置3个重复，倒置于30℃培养箱中过夜后取出观察各平板生长情况，挑选菌落分散较好的平板，挑取菌落形态不同的单菌落，经过多次划线纯化，即得到耐盐纯菌株；
S2、盐胁迫下种子促生实验筛选废盐田枝芽孢杆菌H83
S2-1、番茄栽培，使用前，先用1.5％(W/V)NaClO对种子表面进行消毒2min，并用无菌水漂洗5～8次，确保无NaClO残留后均匀铺撒于用无菌蒸馏水润湿的灭菌滤纸上，置于温室黑暗条件下培养12-24h；
S2-2、挑选可发芽的番茄种子，即萌发出0.1mm芽尖的种子进行下一步实验；
S2-3、使用耐盐菌菌液，浓度为108CFU/ml，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡30s，作为处理组；空白对照组使用无菌液体LB培养基，放入挑选出的番茄种子15颗浸泡30s；
S2-4、将浸泡好的种子平铺至无菌0.5％、1.0％、1.5％NaCl三种浓度盐分胁迫浸润的灭菌滤纸上，盖上培养皿，用封口膜封好，放入黑暗条件28℃恒温培养48h观察种子萌发情况，筛选出耐盐促生效果最显著的耐盐菌，即废盐田枝芽孢杆菌H83进行后续操作；
S3、废盐田枝芽孢杆菌H83生长条件探索
将获得的H83进行生长曲线测定和最适培养温度探索，确定菌株培养条件；
S4、耐盐菌剂的制备
S4-1、一级种子培养液：在无菌条件下，将培养得的H83接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，在30℃条件下，180r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得一级种子液；
S4-2、二级种子培养液：在无菌条件下，将一级种子液接种于含有LB液体培养基的锥形瓶中，接种量为5％。在30℃条件下，180r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液即菌剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210409216.8A CN115161217B (zh) | 2022-04-19 | 2022-04-19 | 一种耐盐可降解有机大分子物质的废盐田枝芽孢杆菌h83及其菌剂制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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Patent Citations (9)
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Also Published As
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