CN105154350A

CN105154350A - 一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105154350A
Application number: CN201510390564.5A
Authority: CN
Inventors: 陈昢圳; 任天志; 郑向群; 成卫民
Original assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Current assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN105154350B

Abstract

本发明涉及农村生活污水处理领域，具体涉及一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备方法和应用。本发明的耐盐脱氮复合菌剂，其包括：类黄色食氢产水菌Hydrogenophaga？pseudoflava？sp.C2和盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillus？halodenitrificans？sp.C30。两种菌株已于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号分别为：CGMCC？No.10977和CGMCC？No.10978。本发明复合菌剂中包含的两种微生物是筛选自农村生活污水中的土著微生物，制得的复合菌剂适应性强，具有一次投菌长期使用的功能，大大节约了成本，也不需要考虑菌种的安全性，适合在我国聚集地较为分散的农村地区使用。

Description

一种耐盐脱氮复合菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农村生活污水处理领域，尤其涉及生物治理农村生活污水，且具有脱氮、耐盐功能的微生物复合菌剂。

背景技术

中国目前有行政村60多万个，村庄人口有7.6亿，其中96％村庄缺乏污水处理系统。农村污水基数大，但受农村经济发展水平，生产、生活方式等发展水平影响，不同地区农村的污水排放特征差别很大。目前城镇污水处理厂采用的技术和运行模式不适合用于农村分散型污水的处理。随着国家对农村开发力度加大，诸如农家乐、村办企业和养殖企业等不断增多，农村污水类型不断增加，污水中含盐量、氮磷等含量不断升高，加之化肥和农药的使用，这增加了污水治理难度。污水无序排放造成地表水、地下水的污染，水库、池塘和河道等水体变黑，富营养化严重，恶臭污染大气，严重影响居住环境和身心健康。加之，农村地区经济较为落后，高耗能、较高费用的技术很难推广应用。当前，必需寻找一种成本较低、无二次污染、应用范围广和适应性强的技术，且适合在中国农村地区推广应用。

高氮元素和有机物是农村污水主要特征之一，也是引起水质恶化和水体富营养化的罪魁祸首。微生物脱氮技术是目前广泛应用到污水净化领域，其基本原理是将有机氮和铵态氮分解成N₂的过程，包括硝化和反硝化两个过程。研究发现，外界环境的变化会直接影响微生物的脱氮效果。随着我国农村经济的高速发展，特别是第三产业的大量引进，污水的类型也在不断增加，其中含盐废水分布最为广泛，特别餐饮废水，严重制约着脱氮菌的脱氮除污效果。近年来，有研究者驯化出耐盐菌株或为脱氮菌株，但功能菌株较为单一，且多停留在实验室阶段，很难推广应用。在污水生态系统中，单一微生物种类稳定性较差，当水体受到有毒盐分干扰时，单一的微生物脱氮功能下降，菌种适应性差，缺乏可持续性。因此，研发耐受性强、适应性快的复合菌群对农村生活污水的治理至关重要。

发明内容

针对农村生活污水存在的上述问题，本发明人从农村分散养殖废水中筛选出一株高效脱氮菌，从农村高盐废水中筛选出一株耐盐除污菌，通过大量的试验，构建出耐盐脱氮复合菌剂，该复合菌剂同时具备降解水体中COD功能，对农村污水净化效果强，适应性强，具有一次投菌长期使用的功能。

本发明旨在提供一种高效的耐盐脱氮的复合菌剂及其制备方法和应用，以期有效的解决农村生活污水高氮所引起的污染问题。

为了实现上述目标，本发明采取以下技术方案：

一种耐盐脱氮复合菌剂，其包括：

类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2(以下简称“C2”)，其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.10977，和

盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30(以下简称“C30”)，其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为：CGMCCNo.10978。

优选地，所述复合菌剂中，C2和C30的体积比为1～2:5～15。在该比例时，该复合菌剂不仅可以更好地在污水中耐盐，而且可以更好地脱除污水中的氮。

更优选地，所述复合菌剂中，C2和C30的体积比为1:8～10。在该比例时，该复合菌剂不仅可以进一步在污水中耐盐，而且可以进一步脱除污水中的氮。

优选地，在所述复合菌剂中，所述C2的活菌含量为1×10⁶～9×10⁸CFU/g，C30的活菌含量为1×10⁵～1×10⁸CFU/g，总的活菌含量为1.5×10⁶～1×10⁹CFU/g。

所述类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2(其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.10977)对农村生活污水不仅具有高效的脱氮功能，还具有耐盐功能。该菌筛选自湖北十堰农村生活污水，该菌菌体细杆状，0.3×0.6μm～1.5μm，单个、成对排列，芽孢中生，椭圆形，孢囊膨大，革兰氏阴性。所述C2的16SrDNA序列如序列表1所示，其长度为1372bp。

所述盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30(其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.10978)筛选自湖北十堰农村生活污水。C30在生活污水中不仅耐盐还具有脱氮功能。菌体杆状，0.3×1.2μm～5.0μm，单个或链状排列，未见芽胞，革兰氏阳性。

一种如上所述的耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其包括以下步骤：

1)固体斜面培养：将C2和C30分别转接到固体培养基上，于30℃无菌环境中培养40～72小时，使菌株活化；

2)种子培养：将步骤1)活化的菌种分别接种于液体培养基中，震荡培养，培养温度为30℃，160～200rpm下培养40～72小时，至菌株处于对数生长期；

3)扩大培养：将步骤2)获得的C2和C30种子按体积比为1～15％的接种量接种于发酵罐中，30℃培养40～72小时，至菌株处于对数生长期，即得本发明的复合菌剂。

其中，步骤1)中，

所述C2的固体培养基为：硫酸铵0.24～0.94g/L、琥珀酸(丁二酸钠)2.81～11.25g/L、微量元素溶液50mL、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄.3H₂O6.5g/L、MgSO₄.7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L、琼脂20g/L；

所述C30固体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl30～80g/L、pH7.0～7.5、琼脂20g/L；

步骤2)中，

所述C2的液体培养基为：硫酸铵0.24～0.94g/L、琥珀酸(丁二酸钠)2.81～11.25g/L、微量元素溶液50mL、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄.3H₂O6.5g/L、MgSO₄.7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L；

所述C30的液体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl30-80g/L、pH7.0～7.5；

步骤3)中，

所述发酵罐中的扩大培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、硫酸铵0.5g/L、NaCl10～80g/L、pH7.0～7.5；

所述发酵罐中：搅拌速度为160～200rpm，通气量为1:1.5～2，搅拌间隔时间为2小时，搅拌2min。

优选地，步骤3)中，接种于发酵罐中的C2和C30种子的体积比为1～2:5～15；优选为1:8～10。

一种如上所述的耐盐脱氮复合菌剂的应用，其用于污水的净化。具体为：按1～15体积％接种量将本发明的复合菌剂接入到农村生活污水中，30℃培养3～4天，pH为6.0～8.5(更优选pH为7.0～7.5)，通气量为1:1.5～2，搅拌速度为160rpm。

优选地，所述农村生活污水的含盐量为1％～4％(以NaCl计)，氮含量小于200mg/L。此时的污水净化效果更好。

本发明人在农村分散畜禽养殖废水中筛选出具备高效脱氮功能菌，同时在农家乐餐饮废水中筛选出耐盐菌株，两种菌株均为土著微生物，且耐盐菌株对废水中COD具有很好的去除效果。本发明通过制得两种土著微生物生长所需的复合培养基，经过实验室驯化培养，制得具备高耐盐负荷，高效脱氮的复合菌群，且复合菌剂对废水中脱氮、去除COD功能都要好于任何一种单株菌。本发明两种微生物是筛选自农村生活污水中的土著微生物，制得的复合菌剂适应性强，具有一次投菌长期使用的功能，大大节约了成本，也不需要考虑菌种的安全性，适合在我国聚集地较为分散的农村地区使用。

具体实施方式

实施例1复合菌剂的制备

1)固体斜面培养：将C2和C30分别转接到固体培养基上，于30℃无菌环境中培养48小时，使菌株活化。其中，C2的固体培养基为：硫酸铵0.5g/L、琥珀酸(丁二酸钠)2.17g/L、微量元素溶液50mL、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄.3H₂O6.5g/L、MgSO₄.7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L、琼脂20g/L；C30固体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl50g/L、pH7.0～7.5、琼脂20g/L。

2)种子培养：将步骤1)活化的菌种分别接种于液体培养基中，震荡培养，培养温度为30℃，160rpm下培养48小时，至菌株处于对数生长期。其中，C2的液体培养基为：硫酸铵0.5g/L、琥珀酸(丁二酸钠)2.17g/L、微量元素溶液50mL/L、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄.3H₂O6.5g/L、MgSO₄.7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L；C30的液体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl50g/L、pH7.0～7.5。

3)扩大培养：将步骤2)获得的C2和C30种子按体积比为10％的接种量接种于发酵罐中，其中C2和C30种子按体积比为1:10分别接种到发酵罐中，30℃培养72小时，至菌株处于对数生长期，即为二级种子；发酵罐中：搅拌速度为160rpm，通气量为1:1.5，搅拌间隔时间为2小时，搅拌2min。其中，所述发酵罐中的扩大培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、硫酸铵0.5g/L、NaCl50g/L、pH7.0～7.5。即得本发明的复合菌剂。

所述复合菌剂中，C2的活菌含量为6×10⁸CFU/g，C30的活菌含量为8×10⁷CFU/g，总的活菌含量为6.8×10⁸CFU/g。

实施例2复合菌剂在天津于桥水库某农家乐废水(污水)应用

(1)废水前期处理：取天津于桥水库某农家乐废水，并经过30目的格栅网，去除水体中较大直径的悬浮物。经过检测：废水pH7.2，氨氮浓度为70.6mg/L，CODcr为320mg/L。同时向废水中加入NaCl，使废水中盐含量维持在3％。

(2)取处理过的废水5L，用两种方式接种菌剂。

方式一：将C2和C30的单株菌液分别接种到废水中，接种量为10％体积。

方式二：实施例1获得的复合菌剂按接种量为10％体积接入到废水中。

两种接种方式，培养温度为30℃，通气量为1:2，污水净化过程无需控制目标水体中pH，搅拌速度为160rpm。结果：处理4天后，水体中氨氮、CODcr去除率结果如下：

	氨氮去除率(％)	CODcr去除率(％)
			C2	78.4	57.2
C30	52.5	64.1
			复合菌剂	95.5	82.3

实施例3复合菌剂在天津杨柳青某养殖厂废水(污水)应用

(1)废水前期处理：取天津杨柳青某养殖厂废水，并经过30目的格栅网，去除水体中较大直径的悬浮物。经过检测：废水pH8.2，氨氮浓度为443mg/L，COD为3260mg/L。同时向废水中加入NaCl，使废水中盐含量维持在3％。

(2)取处理过的废水5L，用两种方式接种菌剂。

方式二：实施例1获得复合菌剂按接种量为10％体积接入到废水中。

两种接种方式，培养温度为30℃，通气量为1:2，污水净化过程无需控制目标水体中pH，搅拌速度为160rpm。

结果：处理4天后，水体中氨氮、CODcr去除率结果如下：

实施例4复合菌剂在武清区大良镇新农村生活污水应用

(1)废水前期处理：取武清区大良镇新农村生活污水，并经过30目的格栅网，去除水体中较大直径的悬浮物。经过检测：废水pH6.4，氨氮浓度为146mg/L，COD为859mg/L。同时向废水中加入NaCl，使废水中盐含量维持在3％。

(2)取处理过的废水5L，用两种方式接种菌剂。

结果：处理4天后，水体中氨氮、CODcr去除率结果如下：

	氨氮去除率(％)	CODcr去除率(％)
			C2	76.3	65.8
C30	54.4	61.7
			复合菌剂	92.6	85.2

由上述实验结果可以看出，本发明以微生物复合菌剂处理高盐、高氮废水，获得的复合菌剂按接种量为10％体积接入到废水中，在培养温度设定为30℃，通气量为1:2，培养4天后，废水中氨氮去除量维持在90％以上，CODcr去除率为78％以上。

Claims

1.一种耐盐脱氮复合菌剂，其包括：

类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2，其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.10977，和

盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30，其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.10978。

2.根据权利要求1所述的耐盐脱氮复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中，类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2和盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30的体积比为1～2:5～15，优选体积比为1:8～10。

3.根据权利要求1所述的耐盐脱氮复合菌剂，其特征在于，在所述复合菌剂中，所述类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2的活菌含量为1×10⁶～9×10⁸CFU/g，盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30的活菌含量为1×10⁵～1×10⁸CFU/g，总的活菌含量为1.5×10⁶～1×10⁹CFU/g。

4.一种权利要求1所述的耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)固体斜面培养：将类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2和盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30分别转接到固体培养基上，于30℃无菌环境中培养40～72小时，使菌株活化；

3)扩大培养：将步骤2)获得的类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2和盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30种子按体积比为1～15％的接种量接种于发酵罐中，30℃培养40～72小时，至菌株处于对数生长期，即得本发明的复合菌剂。

5.根据权利要求4所述的耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于，

步骤1)中，

所述类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2的固体培养基为：硫酸铵0.24～0.94g/L、琥珀酸2.81～11.25g/L、微量元素溶液50mL、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄·3H₂O6.5g/L、MgSO₄·7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L、琼脂20g/L；

所述盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30的固体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl30～80g/L、pH7.0～7.5、琼脂20g/L；

步骤2)中，

所述类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2的液体培养基为：硫酸铵0.24～0.94g/L、琥珀酸2.81～11.25g/L、微量元素溶液50mL、pH7.0～7.2；所述微量元素溶液的组成为：K₂HPO₄·3H₂O6.5g/L、MgSO₄·7H₂O2.5g/L、NaCl2.5g/L、FeSO₄.7H₂O0.05g/L、MnSO₄.H₂O0.04g/L；

所述盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30的液体培养基为：酵母浸膏粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl30-80g/L、pH7.0～7.5；

步骤3)中，

6.根据权利要求4或5所述的耐盐脱氮复合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中，接种于发酵罐中的类黄色食氢产水菌Hydrogenophagapseudoflavasp.C2和盐反硝化枝芽胞杆菌Virgibacillushalodenitrificanssp.C30种子的体积比为1～2:5～15；优选体积比为1:8～10。

7.权利要求1所述的耐盐脱氮复合菌剂的应用，其特征在于，该复合菌剂用于污水的净化。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体为：按1～15体积％接种量将所述复合菌剂接入到农村生活污水中，30℃培养3～4天，pH为6.0～8.5，通气量为1:1.5～2，搅拌速度为160rpm。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农村生活污水的含盐量以NaCl计为1％～4％，氮含量小于200mg/L。

10.一种盐反硝化枝芽胞杆菌，该菌命名为Virgibacillushalodenitrificanssp.C30，其于2015年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.10978。