CN109234214A - 一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用，具体地，所述复合菌制剂包括转基因海洋兼性芽孢杆菌25份、趋磁细菌9份、棒状美丽盐菌2.5份、解淀粉盐颗粒型菌3.8份、盐生枝芽胞杆菌2.5份、运动节枝杆菌5份、盐反硝化枝芽孢杆菌6.5份、反硝化卡斯特兰尼氏菌2份，本发明提供的复合菌制剂除具备耐盐特性还同时具有较强的硝氮、氨氮去除效果，适用于高盐废水的处理。

Description

一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用
技术领域
本发明涉及污水处理领域，特别地涉及一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用。
背景技术
海水的盐度在3％左右，工业上把盐度和海水相当甚至超过海水的废水称为高盐废水。纺织印染、化工生产过程、食品加工以及农药生产过程中都会排放大量的高盐废水。目前对高盐废水的处理可分为物理化学法和生物法两大类，由于此类废水的溶解性有机物含量高，一般物理、化学方法难以处理并且处理成本高，而生物法具有经济、高效、无害的特点，是首选的处理方法。
高盐废水中所含大量的氯离子，会对微生物的生长产生抑制，使微生物细胞脱水；使脱氢酶活性降低，对细胞产生毒害作用；同时由于水的密度增加，活性污泥容易上浮流失。这些对高盐废水的传统生化处理产生了不利的影响。普通活性污泥通过一定时间的耐盐驯化可用于处理高盐废水，但是驯化周期长，耐冲击负荷能力弱，处理效果无法满足实际需求。
目前筛选出的耐盐微生物多为针对COD降解的功能菌株，缺乏针对氨氮，特别是硝氮去除的耐盐硝化菌和耐盐反硝化菌。本发明提供一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用，所述复合菌制剂具有高耐盐特性，并具有较强的硝氮、氨氮去除效果，适用于高盐废水的处理。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用。
本发明是以如下技术方案实现的：
本发明具有以下有益效果：本发明提供一种经基因改造获得具有高耐盐特性的细菌，并使该细菌同时具有较强的硝氮、氨氮去除效果，适用于高盐废水的处理，并将上述细菌与其他菌种制成新型水凝胶载体复合菌制剂，所述水凝胶载体复合菌制剂系统体积小，相对有效生物量大，储存条件要求低，在实际应用时，现场定量可根据污水量进行水凝胶载体复合菌制剂系统的叠加，便于操作，适用于多种高盐污染场景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：获得耐盐基因
地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC1.3716。前期研究证明该菌具有较强的耐盐性，虽然其具有较强的除盐作用，但是其不易培养并且不具备除碳、除硫、除氨氮等功能，不能直接应用于高盐废水的处理中。
为了挖掘地中海富盐菌的耐盐相关基因，探索其耐盐的分子机制，提取其基因组DNA进行全基因组测序，基因组测序委托南京金斯瑞公司通过SOLEXA测序平台完成，利用大肠杆菌表达系统(E.coli DH5a)构建盐胁迫后地中海富盐菌的cDNA文库，具体方法为：分别利用超声随机打断基因组DNA至250bp、500kb、1.0kb、1.5kb的片段，将DNA片段与接头连接，之后250bp和500bp文库进行PCR扩增，上机测序，1.0kb和1.5kb大片段文库采用Cre-LoxRecombination建库技术构建，在DNA大片段两端连接LoxP接头后再进行环化、测序；按照基因组构建步骤分别构建插入片段为250bp，500bp，1.0kb，1.5kb的片段插入文库。
将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，盐胁迫浓度为8％-16％(NaCl浓度按1％递增)和16％-26％(NaCl浓度按2％递增)，于28℃培养一周，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆(划线培养采用盐浓度为20％的LB培养基)，挑取10个长势旺盛的克隆进行测序，用通用引物F-T7和R-pYES2检测插入片段长度及具体序列，具体由上海生工完成测序，将所得到的序列去除载体后，获得耐盐基因AQE1、AQE2、AQE3、AQE4、AQE5、AQE6、AQE7、AQE8、AQE9、AQE10。
实施例2：将耐盐基因转入海洋兼性芽孢杆菌中
所述AQE1、AQE2、AQE3、AQE4、AQE5、AQE6、AQE7、AQE8、AQE9、AQE10的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的序列5’端还连接有NcoI酶切位点，3’端还连接有SwaI酶切位点。将合成的AQE1、AQE2、AQE3、AQE4、AQE5、AQE6、AQE7、AQE8、AQE9、AQE10核苷酸序列分别连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10，载体结构包括：Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7 RNA聚合酶启动子；AQEX为AQE1-10核苷酸序列；MCS为多克隆位点)。
制备海洋兼性芽孢杆菌(Amphibacillus marinus)的感受态细胞，海洋兼性芽孢杆菌(Amphibacillus marinus)菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC1.10434)，制备过程如下：取过夜培养的海洋兼性芽孢杆菌，稀释20倍接种于生长培养基(每500mL含蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖2.5，磷酸氢二钾2.5，0.5mol/L山梨醇)中，35℃震荡培养至OD600＝0.1，收集菌体后进行10min冰浴，放入提前预冷的4℃离心机中，5500转速离心3分钟，弃上清，留沉淀；电转液冰浴后洗涤沉淀3次，用菌体体积1/50的电转液保存菌体，备用。
将重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10分别用热激方法转化海洋兼性芽孢杆菌感受态细胞，其热激条件为：40μl海洋兼性芽孢杆菌感受态细胞、10μl质粒DNA(分别为重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10)，43℃水浴35秒；30℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I(25mMTris-HCl、10mMEDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液II(0.2MNaOH、1％SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(4M醋酸钾、2M醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。提取的质粒经NcoI和SwaI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pGEM-T01、pGEM-T02、pGEM-T03、pGEM-T04、pGEM-T05、pGEM-T06、pGEM-T07、pGEM-T08、pGEM-T09、pGEM-T10中分别对应的插入的所述AQE1、AQE2、AQE3、AQE4、AQE5、AQE6、AQE7、AQE8、AQE9、AQE10的核苷酸序列。
将上述插入外源基因的海洋兼性芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为25％的LB液体培养基，于28℃培养5天，观察其生长情况，并测定培养基中的盐含量，测定结果如表1所示：
表1液体培养基中随天数变动的NaCl浓度测定结果
结果表明，转入AQE7核苷酸序列的海洋兼性芽孢杆菌具有明显的除盐效果，在培养第5天测定OD600，转入AQE7核苷酸序列的海洋兼性芽孢杆菌长势旺盛，可以满足高盐废水的处理条件，AQE7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3：
制备新型水凝胶载体复合菌制剂系统，具体地为，按质量份数，先将50份氢氧化钠溶于水中，并加入50份丙烯酸进行预处理；再依次加入聚丙烯酸钠20份、玉米淀粉10份、丙烯酰胺10份和碳酸钙2.5份，搅拌加温反应后，加入引发剂进行接枝聚合反应；然后将反应获得的初级液体放入灭菌锅中灭菌至室温，之后向初级液体中加入复合菌制剂混悬液及光引发剂，搅拌均匀后倒入平流器皿，弱紫外线照射10分钟使其凝胶化，即得新型水凝胶载体复合菌制剂系统，所述复合菌制剂的配方按质量份数包括转基因海洋兼性芽孢杆菌25份、趋磁细菌9份、棒状美丽盐菌2.5份、解淀粉盐颗粒型菌3.8份、盐生枝芽胞杆菌2.5份、运动节枝杆菌5份、盐反硝化枝芽孢杆菌6.5份、反硝化卡斯特兰尼氏菌2份。
上述细菌初始菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号如表2所示：
表2保藏编号及拉丁名
细菌名 拉丁名 保藏编号
棒状美丽盐菌 Halobellus clavatus 1.10118
解淀粉盐颗粒型菌 Halogranum amylolyticum 1.10121
盐生枝芽胞杆菌 Virgibacillus salinus 1.10449
运动节枝杆菌 Arthrobacter agilis 1.15723
盐反硝化枝芽孢杆菌 Virgibacillus halodenitrificans 1.8915
反硝化卡斯特兰尼氏菌 Castellaniella denitrificans 1.10720
水凝胶载体具有亲水性的主链和疏水性的交联点，属于多孔凝胶，这种凝胶网络能够包埋活细胞，同时又具有适当的孔隙使污染物、氧气等物质通过并传输，形成适用于活细胞生存的良好环境，经测定，本发明提供的水凝胶载体拉伸强度为0.44MPa，断裂伸长率为65％，最佳网络含量为25％，最佳菌体包埋量为8wt％，漏菌量低于0.15(以OD600表示)，相对酶活力为155％，对pH适应度高，可用于环境温度0-35℃的污染场景。水凝胶载体可以改善常见生物反应器挂膜难、挂膜周期长、活性淤泥老化等问题，并且可批量化生产。
实施例4：
将实施例3获得的水凝胶载体复合菌制剂系统进行小试，将水凝胶载体复合菌制剂系统设置于常规水处理反应器生物反应箱中，采用高盐人工废水为进水，控制温度为25℃、pH为7.5，溶解氧为0.15mg/L～3.5mg/L的缺氧-好氧交替条件下处理盐度为8.5％的废水，接种5d后，氨氮去除率达到了98％以上，TN去除率达到了97％以上，水凝胶载体复合菌制剂系统体积小，相对有效生物量大，储存条件要求低，在实际应用时，现场定量可根据污水量进行水凝胶载体复合菌制剂系统的叠加，便于操作，适用于多种高盐污染场景。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 宜兴市永洁环保设备有限公司
<120> 一种复合菌制剂的生产方法及其在污水处理中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> AQE7
<400> 1
cgggacatac gacttatcga tgacgggcca cacgggtcta gcgatggtat aaactctccg 60
ccctatgcga ctttcgttat atattttgtg cagtcatccg gtaactaccc gttcttaaaa 120
ggcaataagt tttacgtaac tactgaacta ttcagtgaat ttaccagcat agttagccta 180
ctcccttact ctcgtctgca ttagctttta gcgtaacggc ccttttattc cagtgcctta 240
gtgcttgact atctaattca ctgctgacgt taggacctaa tgcggtataa ctttactaag 300
tgacggcctt tcagccaggc aatctcgaag ctggtactgg atgatgtagg ctttatacgg 360
ttcggcagcc ggttgtta 378

Claims (4)

1.一种复合菌制剂的生产方法，其特征在于，所述复合菌制剂包括转基因海洋兼性芽孢杆菌、趋磁细菌、棒状美丽盐菌、解淀粉盐颗粒型菌、盐生枝芽胞杆菌、运动节枝杆菌、盐反硝化枝芽孢杆菌、反硝化卡斯特兰尼氏菌。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转基因海洋兼性芽孢杆菌的制备方法包括：挖掘地中海富盐菌的耐盐相关基因，提取其基因组 DNA进行全基因组测序，利用大肠杆菌表达系统构建盐胁迫后地中海富盐菌的cDNA文库，将上述插入外源基因的大肠杆菌接种至不同盐浓度的LB培养基进行耐盐测试，于28℃培养一周，观察其生长情况，挑取生长旺盛的菌落进行纯培养，划线培养若干次直至获得单克隆，挑取10个长势旺盛的克隆进行测序，获得耐盐基因AQE1、AQE2、AQE3、AQE4、AQE5、AQE6、AQE7、AQE8、AQE9、AQE10，合成上述耐盐基因并分别转入海洋兼性芽孢杆菌感受态细胞中，将上述插入外源基因的海洋兼性芽孢杆菌分别接种至NaCl浓度为25%的LB液体培养基，于28℃培养5天，验证获得除盐效果最好的菌株为转入AQE7核苷酸序列的海洋兼性芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述AQE7的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复合菌制剂用于制备新型水凝胶载体复合菌制剂系统，具体地为，按质量份数，先将50份氢氧化钠溶于水中，并加入50份丙烯酸进行预处理；再依次加入聚丙烯酸钠20份、玉米淀粉10份、丙烯酰胺10份和碳酸钙2.5份，搅拌加温反应后，加入引发剂进行接枝聚合反应；然后将反应获得的初级液体放入灭菌锅中灭菌至室温，之后向初级液体中加入复合菌制剂混悬液及光引发剂，搅拌均匀后倒入平流器皿，弱紫外线照射10分钟使其凝胶化，即得新型水凝胶载体复合菌制剂系统。
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