CN113308400A

CN113308400A - Castellaniella sp.OFA38菌株及其筛选方法和用途

Info

Publication number: CN113308400A
Application number: CN202110564013.1A
Authority: CN
Inventors: 张晓君; 吴巧玉; 于丝雨
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113308400B

Abstract

本发明公开了Castellaniella sp.OFA38菌株及其筛选方法和用途，属于环境微生物技术领域。Castellaniella sp.OFA38菌株保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22161，保藏日期为2021年04月09日，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，可通过硝态氮和亚硝态氮进行反硝化作用还原氧化亚氮(N₂O)为氮气。本发明的Castellaniella sp.OFA38菌株或由其制备的菌剂能够有效减少潮土和黑土等农田土壤中温室气体N₂O的排放，减少温室气体带来的环境损害。

Description

Castellaniella sp.OFA38菌株及其筛选方法和用途

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及Castellaniella sp.OFA38菌株及其筛选方法和用途。

背景技术

为了减少农田土壤N₂O的排放，从农田土壤中筛选出能够高效还原N₂O的微生物具有重要的农业环境应用价值和现实意义。迄今为止，已报道分离到很多种反硝化微生物，主要有产碱杆菌属(Alcoligenes)、水螺菌属(Aquaspirillum)、固氮弧菌属(Azoarcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、陶厄氏菌属(Thauera)等。国内外学者报道从土壤或者污泥中分离出反硝化菌来对各种水体的有机物污染进行治理和改良土壤次生盐渍化现象，取得良好的效果。另有研究报道，Castellaniella属的细菌分离物可以高效地将硝酸盐还原为气态氮，进而降低废水中硝酸盐浓度(Pang and Liu，2007；魏阳，2019)；Castellaniella属于细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)。曾有报道检测到用于废水处理的反硝化污泥中含有Castellaniella等多种具有反硝化脱氮作用的相关菌属，反硝化效果良好(邢金良，等，2018)；陈寒玉以宁波慈溪地区的大棚种植土壤为样本，筛选得到一株高效好氧反硝化菌为革兰氏阳性短杆菌，属于Castellaniella属脱氮杆菌，在好氧培养52h时，NO₃-去除率达到92％，在脱氮过程中并没有出现亚硝酸盐的积累现象，此菌剂制备的生物菌肥(培养的菌种和腐熟花生壳混合)对土壤总盐度和硝酸盐浓度都有明显的降低作用(陈寒玉，等，2018)；还有研究表明卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella)、生根瘤菌属(Mesorhizobium)、盐单胞菌属(Halomonas)、螯台球菌属(Chelatococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)为牛粪堆肥过程中主要的含nosZ的反硝化细菌(许本姝，等，2019)。现有技术中，没有关于Castellaniella属的反硝化菌在土壤中进行反硝化过程中N₂O的形成或还原能力的报道，筛选Castellaniella属的反硝化菌株接种到农田土壤中增强N₂O的还原能力也未见相关报道。

发明内容

本发明的第一目的是提供Castellaniella sp.OFA38菌株，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.22161，保藏日期为2021年04月09日。

所述Castellaniella sp.OFA38菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述Castellaniella sp.OFA38菌株来源于农田土壤。

优选地，所述Castellaniella sp.OFA38菌株可以通过硝态氮和亚硝态氮进行反硝化作用还原N₂O为氮气，中间过程无N₂O积累。

本发明的另一目的在于提供所述Castellaniella sp.OFA38菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)对不同农田土壤的反硝化功能测定和土壤菌群结构的关联分析，得出将具有氧化亚氮还原功能的潮土作为所述Castellaniella sp.OFA38菌株的来源；

(2)用梯度稀释法得到来源于潮土的农田土壤菌悬液，将所述农田土壤菌悬液涂布在含有少量硝酸盐的1/10TSA培养基上，在有氧和厌氧条件下分别对土壤微生物进行分离培养，对生长出的单菌落进行分离纯化，得到菌株；

(3)对步骤(2)中每个分离纯化的菌株进行nosZ基因的扩增，并对其中阳性菌株进行16S rRNA基因全长片段的扩增与测序，得到16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示的菌株，即Castellaniella sp.OFA38菌株。

优选地，所述含有少量硝酸盐的1/10TSA培养基按照0.1g硝酸钠、1.5g酪蛋白胨、0.5g大豆蛋白胨、0.5g氯化钠和15g琼脂溶于1L水中的配比得到。

本发明的另一目的在于提供一种用于修复硝酸盐或亚硝酸盐污染农田土壤的菌剂，其包含上述Castellaniella sp.OFA38菌株。

本发明的另一目的在于提供上述Castellaniella sp.OFA38菌株或者所述菌剂在减少农田土壤中温室气体N₂O排放中的用途。

优选地，所述农田土壤的土质包括但不限于潮土或黑土。

优选地，所述Castellaniella sp.OFA38菌株可以通过硝态氮和亚硝态氮进行反硝化作用还原N₂O为N₂，中间过程无N₂O积累。

优选地，所述Castellaniella sp.OFA38菌株的使用量不低于10⁷个细胞/g土。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中Castellaniella sp.OFA38菌株制备的菌剂能够有效减少潮土和黑土等农田土壤施氮肥后导致的大量温室气体N₂O的排放，减少农业生产中温室气体带来的环境损害。

参考以下详细说明更易于理解本发明的上述以及其他特征、方面和优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1是Castellaniella sp.OFA38菌株在TSA培养基上的菌落形态。

图2是Castellaniella sp.OFA38菌株的细胞显微形态。

图3是Castellaniella sp.OFA38菌株用亚硝酸盐为底物的DM培养基进行反硝化作用时N₂O和N₂的动态变化。

图4是Castellaniella sp.OFA38菌株用硝酸盐为底物的DM培养基进行反硝化作用时N₂O和N₂的动态变化。

图5是Castellaniella sp.OFA38菌株对黑土释放N₂O和N₂产生的动态变化的影响。

图6是Castellaniella sp.OFA38菌株对潮土释放N₂O和N₂产生的动态变化的影响。

图7是黑土和潮土不同处理组N₂O释放量的比较。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中Castellaniella sp.OFA38菌株保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22161，保藏日期为2021年04月09日。

以下实施例中Castellaniella sp.OFA38菌株的筛选方法，包括以下步骤：

(1)对不同农田土壤的反硝化功能测定和土壤菌群结构的关联分析，发现潮土产生的N₂O低于黑土、砂浆黑土、黄褐土和红壤，潮土产生的N₂O显著低于黑土，基于16S rRNAV3-V4区的高通量测序并用PICRUST功能预测分析，发现潮土含norB基因的反硝化菌或nosZ反硝化菌群结构与黑土存在显著性不同，含norB的属于卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella)的OTU 102呈现高丰度，且该OTU及Castellaniella属细菌与N₂O/(N₂O+N₂)呈负相关关系，得出将具有氧化亚氮还原功能的潮土作为所述Castellaniellasp.OFA38菌株的来源；

(3)对步骤(2)中每个分离纯化的菌株进行nosZ基因的扩增，对其中阳性菌株进行16S rRNA基因全长片段的扩增与测序，得到16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示的菌株，即Castellaniella sp.OFA38菌株。

将Castellaniella sp.OFA38菌株接种在1/10TSB培养基中，180r/min，30℃培养3天后，8000×g/min离心收集菌体，分别用5mL含硝酸盐或亚硝酸盐的液体DM培养基悬浮菌体，并将其悬浮菌液接种到无菌的25mL含硝酸盐或亚硝酸盐的DM培养基中，用氦气置换血清瓶中的气体三次，然后用反硝化气体检测装置(Robot系统)检测在厌氧条件下Castellaniella sp.OFA38菌株的反硝化能力，表明Castellaniella sp.OFA38菌株能够利用硝酸盐或亚硝酸产生N₂，且能够快速还原N₂O，该菌株在培养过程中几乎没有N₂O的积累。

将新鲜培养Castellaniella sp.OFA38菌液离心收集菌体，菌体悬浮在缓冲液中，以10⁷个细胞/g土的量加入到黑土和潮土中，在厌氧培养条件下，发现接入Castellaniellasp.OFA38菌悬液的黑土或潮土比未接入该菌悬液的黑土或潮土排放的N₂O大大减少，在黑土中N₂O减少97％以上，在潮土中减少26％以上，使农田土壤的N₂O排放控制在很低的水平，表明将Castellaniella sp.OFA38菌株施用到农田土壤中，具有高效减少农田N₂O排放的重要作用。

以下通过具体实施例进一步解释说明本发明的技术方案。

实施例1

筛选Castellaniella sp.OFA38菌株，具体步骤如下：

(一)培养基配方

(1)含少量硝酸盐的1/10TSA培养基：0.1g硝酸钠、1.5g酪蛋白胨、0.5g大豆蛋白胨、0.5g氯化钠、15g琼脂溶于1L水中，121℃灭菌20min。

(2)1/10TSB培养基：1.5g酪蛋白胨、0.5g大豆蛋白胨、0.5g氯化钠溶于1L水中，121℃灭菌20min。

(3)含亚硝酸盐的DM培养基：1.6g Na₂HPO₄、1g KH₂PO₄、0.45g NH₄Cl、0.05g K₂SO₄、0.025g CaCl₂·2H₂O、0.1g MgCl·6H₂O、0.04g NaHCO₃、0.1g亚硝酸钠、0.2g乙酸钠(CH₃COONa)、0.5g胰蛋白胨(tryptone)、0.3g酵母提取物溶于1L水中，121℃灭菌20min。

(4)含硝酸盐的DM培养基：1.6g Na₂HPO₄、1g KH₂PO₄、0.45g NH₄Cl、0.05g K₂SO₄、0.025g CaCl₂·2H₂O、0.1g MgCl·6H₂O、0.04g NaHCO₃、0.505g硝酸钾、0.2g乙酸钠(CH₃COONa)、0.5g胰蛋白胨(tryptone)、0.3g酵母提取物溶于1L水中，121℃灭菌20min。

(5)Ringer溶液：将氯化钠9g、氯化钾0.4g、无水氯化钙0.25g溶于1L纯水中，121℃灭菌20min。

(二)土壤菌悬液的制备

(1)配制0.85％NaCl溶液，121℃灭菌20min，用于制备土壤菌悬液。

(2)称取潮土3g，放入50mL无菌离心管中。

(3)按土:水＝1:10的比例，加入30ml 0.85％NaCl溶液，加入灭菌玻璃珠6粒。

(4)涡旋振荡3次，放入28℃摇床，180rpm转30min，然后500r/min涡旋15min。

(5)不需静置，在超净台内，吸取1ml搅拌均匀的菌悬液，加入到9ml灭菌0.85％NaCl中，抽吸几次充分混匀后得到10-¹稀释液，从10-¹稀释液中吸取1m土壤悬液，加入到9ml灭菌的0.85％NaCl中，稀释成10-²稀释液，然后按此方法，连续稀释到10-³、10-⁴、10-⁵。

(三)有氧和厌氧条件下培养土壤微生物

(1)有氧条件培养，分别吸取100μl的10-²、10-³、10-⁴、10-⁵的菌悬液依次涂布在1/10TSA的培养基上，每个稀释度设置5个重复，平板先正置20-30分钟后，再倒置于28℃培养箱培养2周左右。

(2)厌氧条件培养，分别吸取100μl的10-²、10-³、10-⁴、10-⁵的菌悬液依次涂布在1/10TSA的培养基上，每个稀释度设置5个重复，平板先正置20-30分钟后，再倒置于厌氧培养箱中，28℃培养2周左右。

(四)纯化菌株

观察记录梯度稀释平板上新长出的单菌落，并根据菌落的大小、颜色，形态，尽可能挑选各种不同的细菌分离物，在1/10TSA培养基上划线纯化菌株2-3次，直至获得单一纯化的菌落。

(五)保存菌株

划线纯化2-3次的菌在平板上长出后，用无菌牙签挑取单菌落至1/10TSB液体培养基中，28℃摇床培养1-2天，吸取700μl菌液加入到已加入300μl 50％甘油的冻存管中，置于-80℃冰箱保存。

(六)对含有nosZ基因的菌株进行形态学和分子生物学的鉴定

对潮土中分离出的456个微生物分离物的DNA进行nosZ功能基因PCR扩增，根据是否存在阳性扩增结果，筛选出191个含有nosZ功能基因的微生物分离物。通过高通量测序分析，结果表明其中72株菌为Castellaniella属的细菌，根据Eric-PCR结果，将72个Castellaniella属的细菌分为8类不同的菌株，并对8类不同的菌株进行16S rRNA基因全长测序和分类地位的鉴定，经过对测序菌株的16S rRNA基因全长序列分析，其中一株含有nosZ基因被编号为OFA38的分离株的16S rRNA基因全长序列由1442个核苷酸组成，与潮土中Castellaniella属丰度最高的OTU(OTU102)的16S rRNA基因序列的相似性为100％。因此，可认为被鉴定为Castellaniella属的OFA38菌株是潮土中重要的潜在氧化亚氮还原菌的代表菌株。

Castellaniella sp.OFA38菌株在1/10TSA固体培养基上培养3天后，菌落呈半透明米黄色，菌落表面光滑，呈圆点状(图1)，光学显微镜下观察该菌株的菌体形态为短杆状，属于革兰氏阴性细菌(图2)，Castellaniella sp.OFA38菌株的16S rRNA全长碱基序列如下：

(如SEQ ID NO:1所示)。

应用例1

将Castellaniella sp.OFA38菌株在1/10TSA培养基上划线，在30℃培养2-3天。挑选OFA38单菌落，接种到10mL1/10TSB液体培养基中，30℃180转/min培养1.5天，待菌液变浑浊。7830rpm/min离心菌体5分钟，弃上清，收集Castellaniella sp.OFA38菌体，用5ml灭菌的含亚硝酸盐的DM培养基悬浮菌体，再将5ml菌悬液接种到含亚硝酸盐的DM液体培养基中，氮代谢表型显示，该菌株能够利用亚硝酸盐，且能够快速将N₂O还原为N₂，培养过程中几乎没有N₂O的积累(图3)；在含硝酸盐的DM液体培养基中接种Castellaniella sp.OFA38菌株后，氮代谢表型显示，该菌株能够利用硝酸盐，且能够快速将N₂O还原为N₂，几乎没有N₂O的积累(图4)。

挑选在TSA培养基上活化的OFA38单菌落，接种到20mL1/10TSB的培养基中，30℃180转/min培养1.5天，待菌液变浑浊。按照2％的接种量，取500μl菌液，接入到装有25mlTSB培养基的50mL离心管中，30℃，180转/min摇菌过夜至菌液变浑浊。5000rpm/min，4℃，离心15分钟，用30ml的无菌Ringer洗涤2次后，加入20ml无菌Ringer溶液悬浮菌体。用无菌Ringer溶液十倍倍比稀释OFA38菌悬液，直至稀释10⁸倍，每个稀释度3个重复，用流式细胞仪和平板计数法检测各稀释度的菌液中Castellaniella sp.OFA38菌株细胞的个数。最后，根据菌液浓度，向相当于10g干重的新鲜黑土或潮土中接入OFA38菌悬液，接入的细胞数量为10⁸个活细胞，在厌氧条件下测量土壤的N₂O和N₂的产生量，其中：

(a)OFA38菌株的添加对黑土释放N₂O的影响：在厌氧培养的64h内，定期采集气体样品，N₂O含量采用气相色谱测定。结果表明，不添加OFA38菌的黑土产生的N₂O先不断积累、逐渐升高，在封闭的瓶内后期被还原而检测到量的降低。而添加OFA38菌液的黑土在厌氧培养的过程中几乎看不到N₂O的积累，只有N₂的产生。说明Castellaniella sp.OFA38菌株能够快速将N₂O还原为N₂，可显著降低黑土中N₂O释放量(图5)。

(b)OFA38菌株的添加对潮土释放N₂O的影响：由于Castellaniella sp.OFA38菌株是从原始潮土优势反硝化菌群中筛选出来的一株菌，结果显示潮土在厌氧培养的过程中N₂O的积累较少(远低于黑土)，研究结果也发现，添加OFA38菌液的潮土释放的N₂O含量低于未添加OFA38菌液的原始潮土释放的N₂O量(图6)。

(c)黑土和潮土在添加OFA38前后的N₂O排放量的比较：整个64h的培养过程中添加OFA38菌液与不添加OFA38菌液的潮土、黑土中N₂O积累量的比较，表明添加OFA38菌株的一组黑土N₂O的累积释放量比未加OFA38的黑土减少了97.5％，不添加OFA38菌的黑土产生的N₂O含量显著高于添加OFA38菌的黑土，也显著高于不添加OFA38菌的原始潮土(原始潮土中本身存在一定量OFA38)以及添加OFA38菌的潮土的N₂O积累量。另外，添加OFA38菌的黑土、不添加OFA38菌的潮土、添加OFA38菌的潮土的N₂O积累量的大小在统计学上没有显著性差异，但实验数据表明添加OFA38菌的潮土N₂O的累积量比未加OFA38的潮土减少了26.49％，说明OFA38菌的存在可降低黑土和潮土的N₂O排放(图7)。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> Castellaniella sp.OFA38菌株及其筛选方法和用途

<141> 2021-05-24

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1442

<212> DNA

<213> 潮土()

<400> 1

caaaagggga gagcttacca tgcagtcgaa cggcagcgcg aaggagcttg ctttctttgg 60

cggcgagtgg cgaacgggtg agtaatgtat cggaacgtgc ccagtagcgg gggataactg 120

gccgaaaggt cagctaatac cgcatacgcc ctacggggga aaggggggga tcgcaagacc 180

tctcactatt ggagcggccg atatcggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag 240

gcgacgatcc gtagctggtt tgagaggacg accagccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggggaaacc ctgatccagc 360

catcccgcgt gtgcgatgaa ggccttcggg ttgtaaagca cttttggcag ggaagaaaca 420

gcctgggtta ataccccggg cgactgacgg tacctgcaga ataagcaccg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540

cgtgcgcagg cggttcggaa agaaaggtgt gaaatcccag ggcttaacct tggaactgca 600

cttttaacta ccgggctaga gtacgtcaga ggggggtaga attccacgtg tagcagtgaa 660

atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc cccctgggat gatactgacg 720

ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa 780

acgatgtcaa ctagctgttg gggtttatta accttagtag cgcagctaac gcgtgaagtt 840

gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac 900

aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct acccttgaca 960

tgtctggaat cccgaagaga tttgggagtg ctcgcaagag aaccggaaca caggtgctgc 1020

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttgccattag ttgctacatt cagttgggca ctctaatggg actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgg gtagggcttc acacgtcata 1200

caatggtcgg gacagagggt tgccaaaccg cgaggtggag ccaatctcag aaacccgatc 1260

gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagcatgt cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380

gagtgggttt caccagaagt aggtagccta accgcaaggg ggcgctacca gcgtagtagg 1440

tg 1442

Claims

1.Castellaniella sp.OFA38菌株，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.22161，保藏日期为2021年04月09日。

2.根据权利要求1所述的Castellaniella sp.OFA38菌株，其特征在于，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的Castellaniella sp.OFA38菌株，其特征在于，所述Castellaniella sp.OFA38菌株来源于农田土壤。

4.根据权利要求1至3任一项所述的Castellaniella sp.OFA38菌株，其特征在于，所述Castellaniella sp.OFA38菌株通过硝态氮和亚硝态氮进行反硝化作用还原氧化亚氮(N₂O)为氮气，且中间过程无N₂O积累。

5.权利要求1至4任一项所述Castellaniella sp.OFA38菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.一种用于修复硝酸盐或亚硝酸盐污染农田土壤的菌剂，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述Castellaniella sp.OFA38菌株。

7.权利要求1至4任一项所述的Castellaniella sp.OFA38菌株或者权利要求6所述的菌剂在减少农田土壤中温室气体N₂O排放中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述农田土壤的土质包括但不限于潮土和黑土。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述Castellaniella sp.OFA38菌株可以通过硝态氮和亚硝态氮进行反硝化作用还原N₂O为氮气，且中间过程无N₂O积累。

10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述Castellaniella sp.OFA38菌株的使用量不低于10⁷个细胞/g土。