CN116162561A - 一种具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株及其应用，该菌株命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2022年2月22日，保藏编号：GDMCCNO:62257；本发明菌株适用性强，耐受温度广泛，最高耐受温度和最低耐受温度均广于现有技术中的同属菌株，可以在6～30℃条件下都具有较好的反硝化能力，并且水中溶解氧对其反硝化过程没有明显的影响，特别适用于气温变化比较大的地区的污水处理脱氮系统，以及养殖水体、景观水体等无法进行厌氧反硝化的生态修复项目总氮控制。

Description

一种具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株及其应用。

背景技术

生物脱氮法作为一种经济有效的污水处理方法，已经广泛应用于含氮废水的治理。但是，传统反硝化菌在实际应用过程中会因低温抑制微生物生长活性，导致处理效果变差。而低温反硝化菌却因生长繁衍温度通常低于20℃，在夏季难以与常温反硝化菌竞争，在系统群落结构中处于劣势。因此，无论人工还是天然的净化系统在冬季需要补充低温反硝化菌让菌群快速进入适应低温状态，从而解决处理硝态氮的问题。

低温反硝化菌在实际应用过程中同样受到诸多外界因素的干扰而出现不稳定的情况，其中溶解氧是最为常见的影响因素。我国东西部海拔落差高达上千米，导致西部高原地区与北部平原地区在相同低温环境下溶解氧因大气压导致不同，平原地区溶解氧高，高原地区溶解氧低。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株及其应用，该菌株对氧和温度耐受能力更强，可以提高生物除氮工艺的适用性和稳定性。

本发明的第一方面提供一种菌株，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2022年2月22日，保藏编号：GDMCCNO:62257。

发明人在秋冬季节从多地污水处理设施中采集水样和污泥，通过富集，初筛、复筛，最终分离出一种耐低温好氧反硝化菌，该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其生物学特征为：革兰氏染色阴性，呈杆状或短杆状(如图1A所示)；在硝酸盐筛选平板上菌落呈光滑，湿润，中间略微凸起圆形菌落，菌落中间呈浅黄色周围白色(如图1B和C所示)。采用通用引物(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对菌株的16S rDNA进行PCR扩增，扩增产物由广州艾基生物技术有限公司进行测序。该序列与NCBI进行BLAST比对，并采用最大似然法构建系统发育树分析(如图2所示)，结果显示与假单胞菌Pseudomonas sp.JCM 5482的相似度最高，但不完全相同，结合菌株的形态特征，确认该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的一个新的菌株。将该菌株命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71，于2022年2月22日保存于广东省微生物菌株保藏中心(简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编510075)，保藏编号为GDMCC NO:62257。该菌株适用性强，耐受温度广泛，最高耐受温度和最低耐受温度均广于现有技术中的同属菌株，可以在6～30℃条件下都具有较好的反硝化能力，并且水中溶解氧对其反硝化过程没有明显的影响，特别适用于气温变化比较大的地区的污水处理脱氮系统，以及养殖水体、景观水体等无法进行厌氧反硝化的生态修复项目总氮控制。

优选地，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID No:1所示。

SEQ ID No:1

优选地，所述菌株的耐受温度为6～30℃。

优选地，所述菌株具备好氧反硝化能力。

本发明的第二方面提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有本发明第一方面所述的菌株。

优选地，所述微生物菌剂中还含有其他辅料，所述辅料包括冻干保护剂、溶剂、载体、培养基质中的至少一种。

本发明的第三方面提供含有下述至少一种的试剂在水体脱氮处理中的应用；

(1)本发明第一方面所述的菌株；

(2)本发明第一方面所述菌株的菌剂；

(3)本发明第一方面所述菌株的活菌液；

(4)本发明第一方面所述菌株的死菌液；

(5)本发明第一方面所述菌株的代谢产物；

(6)本发明第一方面所述菌株的提取物。

优选地，所述水体脱氮包括脱除水体中硝态氮、铵态氮或亚硝态氮。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下:

本发明菌株适用性强，耐受温度广泛，最高耐受温度和最低耐受温度均广于现有技术中的同属菌株，在6～30℃条件下都具有较好的反硝化性能。与常温反硝化菌相比，本发明菌株在9～15℃的低温条件下不影响反硝化效果，在6～9℃仍有明显的反硝化效果；与嗜冷反硝化菌相比，本发明菌株不会因温度升高而失活，在15～30℃的常温条件下反硝化效果变化不大；并且水中溶解氧对本发明菌株反硝化过程没有明显的影响，特别适用于气温变化比较大的地区的污水处理脱氮系统，以及养殖水体、景观水体等无法进行厌氧反硝化的生态修复项目总氮控制。

附图说明

图1是本发明菌株的革兰氏染色镜检和菌落图；

图2是本发明菌株的系统发育树图；

图3是本发明菌株在不同温度下的反硝化性能对比图；

图4是本发明菌株在好氧和厌氧条件下生长和脱氮能力对比图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或仪器如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

以下是本发明实施例所用到的培养基配方：

反硝化培养基：硝酸钾1.5g/L，柠檬酸钠5.1g/L，磷酸二氢钾1.36g/L，七水硫酸镁0.4g/L，微量元素(200×)0.5％(v/v)；pH调节至7.0～7.5。

其中微量元素(200×)配方为：EDTA·2Na22.8g/L，七水硫酸亚铁2g/L，七水硫酸锌1.56g/L，无水氯化钙2.2g/L，一水硫酸锰1.76g/L，四水仲钼酸铵0.44g/L，五水硫酸铜0.64g/L，六水氯化钴0.64g/L。

反硝化培养基平板：在上述反硝化培养基中添加1.5％～2％琼脂制备固体平板。

实施例1：具有耐低温、好氧反硝化功能的菌株的筛选和性能验证

样品采集和富集：在秋冬季节从多地污水处理设施中采集水样和污泥，补充适量碳源、硝酸盐、磷酸盐缓冲液、并调节pH，置于6℃培养箱内富集培养3～7天。定期测试富集培养液硝酸盐、亚硝酸盐和总氮变化，挑选出在低温环境下具有较好反硝化性能的样品进行菌株筛选。

菌株初筛：富集的培养液用生理盐水梯度稀释，并涂布于反硝化培养基平板上，置于4℃培养箱内培养3天，挑选12株耐低温菌株进行复筛验证反硝化性能。

菌株复筛：将初筛菌株分别接入反硝化培养基中，置于6℃摇床内200r/min振荡培养3天，取混合均匀的培养液测定总氮，再取培养液的离心上清测定硝酸盐和亚硝酸盐，并计算3天内硝酸盐降解率、亚硝酸盐积累率、总氮降解率。复筛得到一株硝酸盐降解率100.0％，亚硝酸盐积累率7.1％，总氮降解率36.2％的菌株。

菌株纯化：挑取复筛菌株的菌落，在筛选培养基平板上用分区划线法进行划线分离，置于6℃培养箱内培养72h。观察分离菌落形态，挑选形态一致的3～4个菌落进行复筛测试。选择复筛测试中总氮降解率最高的菌株进行下一轮纯化，直至划线分离平板上菌落形态完全一致，挑选复筛测试几个菌落测试结果基本相同，且与上一轮复筛测试结果相近。经过3轮纯化得到一株编号为BWFA71的纯化菌株，其硝酸盐降解率100.0％，亚硝酸盐积累率1.0％，总氮降解率66.2％。

菌株分子鉴定：采用通用引物(27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对菌株的16S rDNA进行PCR扩增，扩增产物由广州艾基生物技术有限公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。该序列与NCBI进行BLAST比对，并采用最大似然法构建系统发育树分析(如图2所示)，结果显示与假单胞菌Pseudomonas sp.JCM5482的相似度最高，但不完全相同，结合菌株的形态特征，确认该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的一个新的菌株。将该菌株命名为Pseudomonas sp.BWFA71。

实施例2：温度对菌株的影响

对数期菌悬液的制备：从斜面上挑取本发明假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71接种到5个装有100mL反硝化培养基的250mL锥形瓶中，分别在不同温度(6～30℃)条件振荡培养数天，定期取样测定OD₆₀₀，至生长至对数中期(OD₆₀₀＝0.4～0.8)。离心收集培养液中菌体，并制备成OD₆₀₀＝1.0的菌悬液。

取5个装有200mL反硝化培养基的250mL锥形瓶，通氮气使溶解氧降至0.5mg/L以下，按1％接种量加入上述菌悬液，取初始样后将其密封置于对应温度的摇床中继续振荡培养，定期取样测试生物量和氮素变化。测定结果如图3所示。

从图3可以看出，当温度在12～30℃，本发明菌株反硝化性能和总氮去除率变化不大，硝酸盐比降解速率在0.06～0.08h^-1，总氮去除效率维持在75％以上；当温度在9～12℃，反硝化能力变化不大，硝酸盐比降解速率可以维持在0.06h^-1以上，但低温条件下更多的氮用于菌体物质的合成，总氮去除率呈下降趋势；在6℃的低温度条件下，反硝化性能有所下降，硝酸盐比降解速率为0.042h^-1，总氮去除率为39.7％，仍有明显的反硝化作用。

一般活性污泥的反硝化性能每10℃下降2～3倍，而本发明菌株在12～30℃间可以维持比较稳定的反硝化效果，12℃以下反硝化性能虽有下降，但6℃时仍可以维持一半左右的反硝化性能。因此本发明菌株特别适用于低温或者温度波动的污水处理反硝化脱氮工艺。

实施例3：氧对菌株的影响

从斜面上挑取本发明假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71接种到装有100mL反硝化培养基的锥形瓶中，在15℃、150r/min条件下振荡培养3天。离心收集培养液中菌体，并用生理盐水制备成OD₆₀₀＝1.0的菌悬液。

取3个装有200ml反硝化培养基的500mL锥形瓶，按1％接种量加入上述菌悬液，用透气封口膜封口作为好氧组；另外取3个装有200ml反硝化培养基的250mL锥形瓶，按1％接种量加入上述菌悬液，通氮气使溶解氧降至0.5mg/L以下后胶塞密封作为厌氧组。将上述6瓶分别置于6、15和30℃摇床中，每个温度的摇床各放1瓶好氧组和1瓶厌氧组的锥形瓶，以150r/min振荡培养，定期取样测试氮素和生物量的变化，其中厌氧组每次取样时用氮气使溶解氧维持0.5mg/L以下，取样后再密封。测定结果如图4所示。

从图4可以看出，培养一段时间后，好氧组和厌氧组的硝酸盐均完全降解，且没有亚硝酸盐累积。根据各试验组氮素和生物量的数据，计算终点的总氮降解率和对数期的平均比生长速率(如表1所示)。从表1可以看出，在6～30℃，好氧条件下各组总氮均有明显下降，由于相同温度下好氧条件下菌株生长比厌氧组快，生长同化的氮相对较多，其总氮降解率比厌氧组低。因此判断该菌株在该条件下具有明显的反硝化效果；在6～15℃的低温条件下好氧和厌氧反硝化效果相近；15～30℃的常温条件下好氧条件下生长更快，更多的氮用于同化，反硝化效果有所下降。

表1不同温度时好氧和厌氧条件处理72h的反硝化效果

常规反硝化菌只能在厌氧条件下进行反硝化。而本发明菌株在好氧条件下仍表现出明显的反硝化作用，与厌氧条件相比，硝酸盐降解性能有所提高，菌量增高，而总氮去除率有一定下降。实际应用时菌体可通过沉淀等手段去除，仍可以保证出水总氮达标，因此该菌株的应用条件对溶解氧没有要求，特别适用于养殖水体、景观水体或者容易受到溶解氧冲击的反硝化脱氮系统。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种菌株，其特征在于，所述菌株命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)BWFA71，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2022年2月22日，保藏编号：GDMCCNO:62257。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的16S rRNA序列如SEQ ID No:1所示。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株的耐受温度为6～30℃。

4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株具备好氧反硝化能力。

5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1-4任一项所述的菌株。

6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有其他辅料，所述辅料包括冻干保护剂、溶剂、载体、培养基质中的至少一种。

7.含有下述至少一种的试剂在水体脱氮处理中的应用；

(1)权利要求1-4任一项所述的菌株；

(2)含有权利要求1-4任一项所述菌株的菌剂；

(3)含有权利要求1-4任一项所述菌株的活菌液；

(4)含有权利要求1-4任一项所述菌株的死菌液；

(5)权利要求1-4任一项所述菌株的代谢产物；

(6)权利要求1-4任一项所述菌株的提取物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水体脱氮包括脱除水体中硝态氮、铵态氮或亚硝态氮。

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